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Establishment of regeneration system of kiwifruit seedlings

猕猴桃实生苗再生体系的建立



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 29(4):514— 517 2009年 7月
猕猴桃实生苗再生体系的建立
周玲艳 一,秦华明3,赖幸韵1,陈楚欢 ,梁 红1
(1.仲恺农业工程学院 生命科学学院,广州 510225;2.华南农业大学生命
科学学院,广州 510624;3.暨南大学理工学院,广州 510623)
摘 要 :以成熟饱满的美味猕猴桃种子发芽获得实生苗 ,分别以实生苗的茎段、叶柄和叶片为材料建立了再
生体系。结果表明:种子以 2.5 mg/L的赤霉素(GA3)处理 8 h较适合;以培养基发芽较为适合 ;茎段 、叶柄和
叶片的愈伤组织的诱导率均为 100 ,且茎段、叶柄 比叶片容易脱分化 ,但叶片的平均出苗率最高。再生苗在
移栽 5d后,开始长出新叶 ,10 d后就能完全适应外界环境 。
关键词 :猕猴桃;实生苗;外植体;再生体系
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号 :1000-3142(2009)04-0514-04
Establishment 0f regeneration
ystem kiwifruit seedlingss Ot lo l
ZHOU Ling-Yanl一,QIN Hua-Ming0,LAI Xing-Yunl,
CHEN Chu_Huan1.LIANG HongI
(1.Colege of Li Science,Zhongkai Agriculture and Enginering University,Guangzhou 510225,China;
2.College of Li Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;
3.Colege of Science and Technology,J inan University,Guangzhou,510632,China)
Abstract:The ful and mature seeds of kiwifruit were germinated to obtain the seedlings,and the regeneration system
was established by using the stems,petioles and leaves as explants.The results showed that:the concentration of
GA3 which was appropriate tO treat the seeds was 2.5 mg/L and the treatment time was 8 h;the medium was more
suitable for seed germination;the stems and petioles was easier tO dedifferentiation than leaves,however,the average
emergence rate of leaves was the highest.
Key words:kiwifruit;seedling;explants;regeneration system
现今,植物组织培养技术 已逐步完善,但木本植
物的组培育苗难度仍较大,常易出现褐化和玻璃苗
等现象,组培苗后期的生根也有困难,至今木本植物
组培育苗的成功率仍明显低于草本植物(阳小成等,
2002)。
系统研究猕猴桃组织培养的方法,具有重要的实
际意义。首先,植株再生体系的建立为使用基因工程
方法改进猕猴桃品质奠定重要基础;其次,组织培养
技术在猕猴桃中的开展,有利于快速繁殖大量的优质
种苗。本文以成熟饱满 的猕猴桃种子萌发所得的实
生苗为材料,对猕猴桃再生体系进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1材料
美味猕猴~,(Actinidia deliciosa)的饱满成熟种子。
1.2方法
1.2.1实生苗的获得 将种子用清水洗净后,用2.5
收稿日期 :2007—09—13 修回日期 :2008—04—25
基金项目:广东省科技计划项目(2005B60301010);仲恺农业工程学院校基金(G3051312)[Supported by Science andTechnology Pr~ect ofGuangdong
Pro~nce(2005B60301010);Fund of Zhongkai Agriculture and Engineering UnjVersity(G3O51312)
作者简介:周玲艳(1972一),女 ,湖南衡 阳人,博士研究生,副教授,主要从事植物生物技术研究。
。通讯作者(Author for correspondence,E—mail:lhofiee@yahoo.com.cn)
4期 周玲艳等:猕猴桃实生苗再生体系的建立 515
mg/L的赤霉素(纯度为 9O ,配置时以少量 95
乙醇助溶)溶液分别浸泡 5、8、15、20、24 h以打破种
子休眠,然后以 2 的次氯酸钠消毒 15 min,灭菌水
冲洗 3~5次 ,将种子用镊子分别接种于 MS基本培
养基 和带湿润滤纸 的灭菌培养皿 中,并定期加无菌
水以保持滤纸的湿润,统计种子的发芽势和发芽率。
待小苗出现两片绿色子叶时 ,将其转人生根培养基
生根培养。
1.2.2不定芽的诱 导 待小植株 长至大约 8 cm 高
时,切取其叶片 、叶柄和不带腋芽的茎段分别接入不
定芽诱导 培养基 中,叶 片切块 约 为 0.5 cm×0.5
cm,叶柄和茎段 长约 0.5 cm。每瓶 约含 4块外植
体,每种外植体各约 l0瓶。26℃,每天光照 12 h,
定期观察外植体愈伤组织和不定芽诱导情况。
1.2.3生根、驯化与移栽 将不定芽苗丛用解剖刀
一 棵棵分开来,并转移到生根培养基上,每瓶约含 5
棵苗,小苗生根培养约 70 d后,根系发达,此时对广
口瓶内的苗进行炼苗,每天逐渐增加开盖时间,到炼
苗第 7天时 ,洗净小苗根上的培养基 ,种植在细沙盆
中,置于靠窗边的培养架上,每天浇水一次以保持沙
土湿润 。
表 l 赤霉素浸种时间及发芽方式对种子发芽率的影响
Table l Effect of immersion time with GA3 and
the germinating condition on the rate of germination
赤霉素处理时间 发芽率 Germination rate(%)
Treatment time
of GA3(h) 滤纸 Flter paper 培养基 Medium
70.5
91.7
50
49.8
52.3
40.9
71.4
48.6
49
53.9
2 结果与分析
2.1赤霉素浸种时间及发芽方式对种子发芽的影响
表 1和图 l、2的结果表明 ,赤霉素浸泡种子 以
8 h为宜,其 中,滤纸和培养基 的发芽率分别为
91.7 9,6和 71.4 。两种发芽方式的发芽率差异受
赤霉素浸种时间的影响,尽管两者最大发芽率均以
浸种 8 h为宜,但浸种时间小于 8 h时,培养基上的
种子发芽率明显低于滤纸上的,而当浸种时间延长
至 15 h时,两者的发芽率相差不大,均在 5O 左右。
另外,滤纸上的种子萌芽较快,1周左右破芽萌发,
10 d左右露出子叶,而培养基上的种子萌发较慢,
一 般要 10 d以后才破芽萌发,但培养基上的小苗后
期生长较快 ,且培养基发芽不需要定期加水 ,从而减
少了污染 .所以在种子充足的情况下,选择培养基发
芽方式可减轻工作量。
罔 1 猕猴桃种子培养基上发芽情况
Fig.1 Tim germination of seeds on medium
图 2 猕猴桃实生苗生根情况
Fig.2 The root of seedling
表 2 不同外植体的培养效果
Table 2 Condition of differentnt explants in culture
外植体类型
Explants
type
2.2不同外植体的不定芽诱导
表 2和图 3、4的结果表明 ,茎段的愈伤组织起
始最早,一般接人培养基 1周左右开始从切口处形
成愈伤组织,培养 2周左右茎段基部完全愈伤组织
化,外植体膨大至原来 3~4倍 ,部分位置开始分化
形成绿点,进一步分化形成小苗。而叶柄切段接种
在基本培养基上,经 3 d培养,外植体切口处开始膨
大外凸,l周后叶柄切段在切口处产生少量淡绿色
愈伤组织,出现愈伤组织的时间比茎段稍晚。2周
后,愈伤组织上出现多个白色芽点,进一步形成不定
芽,且叶柄愈伤组织化程度也比较高。叶片接种后
继续伸长增大至大约原来体积的 2倍,lO~15 d左

不化肌 诱[翟


4期 ‘ 周玲艳等:猕猴桃实生苗再生体系的建立 517
苗生长后期,滤纸上的小苗生长较慢,而培养基上的
幼苗反而生长较快。
本试验发现叶柄 、茎段 比叶片容易脱分化 ,已有
不少研究者(姜长阳等,2003;余小林等,2004;曾建
军等,2006)报道了不同外植体的脱分化和再分化存
在较大差异,这可能与不同外植体中细胞的分化程
度不同以及内源激素水平不同有关。本实验在叶片
的培养中发现,愈伤组织大多数首先在叶脉和叶缘
的切口处产生,Mushtaq等(1997)也报道了类似现
象,认为可能是外植体边缘容易从培养基中吸收有
图 5 再生苗移栽后的情况 (1:幼苗移栽 5 d;2:幼苗移栽 70 d)
Fig. The transplanting of regenerated plants(1:5 d after transplanting;2:70 d after transplanting)
效的营养和激素所 导致;本实验还发现 ,同一叶盘绿
色的小芽点首先出现在中脉形成 的愈伤组织上,这
与Nabila&Mohannad(2000)的报道一致。在猕猴
桃叶柄和茎段培养中,叶柄和茎段切段两端伤口首
先形成愈伤组织,然后由愈伤组织分化形成不定芽。
试管苗的移栽是再生体系建立最后的关键。本
实验中发现再生植株在移栽后 的前几天 ,叶片出现
萎焉和脱落,但几天后重新发出芽来,罗成科等
(2007)在半夏再生苗的移栽中也发生类似情况。丁
士林等(1997)认为闭瓶强光锻炼,使试管苗从以异
养为主逐步过渡到以自养为主,同时认为创造适宜
的移栽条件也是非常重要的,如气 温不过 3O℃,相
对空气湿度在 9O 以上等。汪建亚等(1998)认为
试管苗成活的关键在于移栽后较高的湿度和良好的
通风条件。本试验采用 的沙粒疏水性 比较好,但保
水性较差,根据这一点,每天浇水两到三次,保证基
质湿润,并以保鲜膜搭成小棚 ,棚 内放置 2个装满水
的烧杯,以保持空气的湿度,提高移栽成活率。移栽
前还应将再生苗根部的培养基洗除干净,但同时应
注意保持根的完整性以保证小苗的成活率。
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