全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(2)：247— 250 2008年 3月
洋桔梗体细胞胚性愈伤组织诱导过程
中超氧化物歧化酶和酯酶变化
刘明志，陈 勤，刘 希
(长沙学院 生物工程和环境科学系，长沙 410003)
摘 要：通过转移洋桔梗非胚性愈伤组织到含有 1．0 mg／L 2，4一D的 MS培养基(eclM)上诱导 了洋桔梗胚性
愈伤组织形成 ，而非胚性愈伤组织在含 1．0 mg／L 2，4一D和 0．5 mg／L KT的 MS培养基(necSM)上继代培养。
本研究比较分析了洋桔梗愈伤组织在 ecIM和 necSM上的超氧化物歧化酶(SOD)活性及其同工酶酶谱、酯酶
同工酶酶谱随着培养天数的变化。实验结果表明在 ecIM 和 necSM 上培养 的洋桔梗愈 伤组织的超氧化物歧
化酶(SOD)活性在培养早期较低 ，然后随着培养天数增加而升高，维持在较高水平上，但 SOD活性变化无明
显规律性；另一方面，SOD同工酶在第 4天后出现一新的同工酶谱带；此外，在 eclM 和 necSM 上培养洋桔梗
愈伤组织的酯酶(EST)同工酶在培养至第 16～2O天期 间呈现显著缺失 。
关键词：洋桔梗 ；胚性愈伤组织；非胚性愈伤组织；超氧化物歧化酶 ；酯酶；同工酶
中图分类号 ：Q944．6 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)02—0247—04
， ■ n ●1 1● 1 nan 2IeS OtSUDeroxlde tllSm utase and estrase
in orocesses Ot em DrV0 enit Ca111 lnCIUCtl0n ● n 1 ● ll●● 1 J●
0f Eus toma grandiflorum
LIU Ming-Zhi，CHEN Qin，LIU Xi
(Department of Bioengineering and Enviromental Science，Changsha University，Changsha 410003，China)
Abstract：Embryogenic cali induction of Eustorna grandiflOFUTi~were carried out when non—embryogenic cali on nec—
SM (MS medium containing 1．0mg／L 2，4-D and 0．5mg／L KT)were transferred onto ecIM (MS medium containing
1．0mg／L 2，4-D)．Changes of superoxide dismutase(SOD)activities and isoenzymes and estrase(FAST)isoenzymes
in calli of E．grandiflOFUTi~cultured on ecIM and necSM for different days of cultures have been achieved．Experi—
mental results have been shown that SOD activities in calli of E．grandiflOVU?7I on ecIM and necSM were low in early
culture times and raised along with increasing days of cultures and maintained 3 higher level without an evident regu—
larity for the changes of SOD activities，and for SOD isoenzymes there was also 3 new band of SOD isoenzyme until 4
days of culture；Estrase(FAST)isozyme in calluses of E grandiflOVUln cultured on ecIM and necSM had an distinct
absence in the periods from 1 6 days tO 2O days．
Key words：Eustoma grandiflOVIAm；embryogenic callus；nonembryogeneic callus；superoxide dismutase；estrase；
isoenzyme
器官发生和体细胞胚胎发生是植物组织培养形
态建成的两种主要方式。目前，器官发生和体细胞
胚胎发生的分子生物学机理还了解得很少，主要来
自于模式植物，如对胡萝 卜和烟草的研究结果。很
可能对器官发生和体细胞胚胎发生的分子生物学机
理研究最终需要借助于基因组学和蛋白组学研究。
另一方面，对器官发生和体细胞胚胎发生的生理生
化变化的研究却有助于对器官发生和体细胞胚胎发
生的深入认识和了解，特别是不同诱导条件对器官
发生和体细胞胚胎发生所引起的内部的标志性生理
收稿 日期：2007—01—08 修回日期：2007-05-19
作者简介：刘明志(1963一)，男 ，湖南岳阳市人 ，副教授，主要研究方向为植物细胞工程。
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生化变化。
洋桔梗为龙胆科草原龙胆属的一种具有较高观
赏价值的植物种，近年来十分流行，在荷兰花卉市场
跻身十大切花之列。 目前，对洋桔梗 的研究主要集
在其病理(Uga等，2004；Okamoto等，2002；Furuya
等，2000；Yanagida等，2004)、生理(Mino等，2003)
和花色(Deroles等，1998)方面。虽然洋桔梗在组织
培养和无性快速繁殖方面也有一些报道 (Griesbach
& Semeniuk，1987；杨霞等，1997；李群等，2004)，但
均为器官发生实现植株再生，还没有洋桔梗体细胞
胚发生的报道。本研究首次报道了洋桔梗胚性愈伤
组织诱导，并比较分析了洋桔梗非胚性愈伤组织继
代和胚性愈伤组织诱导过程中的超氧化物歧化酶活
性及其同工酶和酯酶同工酶随培养天数的变化，有
助于了解体细胞胚胎发生的标志性生理生化变化。
1 材料与方法
1．1材料
洋桔梗(Eustoma grandiflorum)种子。
1．2方法
1．2．1胚性愈伤组织诱导与非胚性愈伤组织的继代
洋桔梗下胚轴 和子叶接种于 1．0 mg／L 2，4-D十
0．2 mg／L KT的MS培养基(Murashige& Skoog，
1962)上诱导形成非胚性愈伤组织，继代于相同激素
配比的上述非胚性愈伤组织继代培养基 necSM上。
将洋桔梗非胚性愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导
培养基 eclM(含 1．0 mg／L 2，4一D的 MS培养基)诱
导胚性愈伤组织形成。所有 MS培养基含有 3 蔗
糖，0．8 琼脂粉，高压灭菌前 pH值调至 5．8。
1．2．2 SOD活性测定及同工酶分析 SOD酶粗提
液制备及酶活性测定参照 Giannopolitis& Ries
(1977)的方法加以改进。分别取在 eclM 和 necSM
上培养不同天数的洋桔梗愈伤组织 1 g加入 2 mL
含 1 mmol／L EDTA的 50 mmol／L的磷酸缓冲液
(pH7．8)，冰浴研磨匀浆，在 4℃于 13 000 g离心
20 rain，上清液为酶粗提液，用于 SOD酶活性分析
及电泳。SOD活性测定用 NBT光还原法。以缓冲
液代替酶液不经光照的反应液作为空白对照。以不
加酶液，经光照的样品反应液作为 NBT光化学反
应还原的标准液 。酶活性用抑制 NBT光化学反应
5O 9／6为一个酶活性单位表示。酶比活以每 1 mg蛋
白SOD酶单位数表示。可溶性蛋白含量测定用考
马斯亮蓝 G-250法 (Bradford，1976)。SOD同工酶
电泳 和 SOD 同工 酶活性染 色参照 Beauchamp&
Fridovich(1971)方法 。
1．2．3．EST 同工酶分析 EST粗提液制备 ：分别
取在 eclM和 necSM培养不同天数的洋桔梗愈伤组
织 1 g加入 2 mL TBE提取液(O．1 mol／L Tris，0．1
mol／L HNO ，0．1 mol／L EDTA)，在冰浴研钵内快
速磨成匀浆，匀浆液以 12 000 r／rain，4℃离心 5
min，取上清液作为酯酶粗提液用于电泳分析。
EST电泳及染色：本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝
胶电泳法进行电泳。浓缩胶 2．5 9／6，分离胶 7．5 ，
电极缓冲液为 pH8．3的 HC1一甘氨酸缓冲液，电流
为2mA／样。电泳完毕后进行酯酶染色。染色采用
醋酸萘酯一坚牢蓝 RR染色法室温下染色。
2 结果分析
2．1胚性愈伤组织诱导和非胚性愈伤组织继代
在本实验中，取洋桔梗无菌苗的子叶和下胚轴
切成小块和小段接种于 1．0 mg／L 2，4一D+0．2 mg／
L KT和 2．0 mg／L BA十0．1 mg／L NAA的 MS培
养基上培养时均可诱导外植体脱分化和愈伤组织形
成。在这两种培养基上外植体极易于脱分化形成愈
伤组织，愈伤组织形成为 100 9／6。随后将愈伤组织
转移至 necSM上继代培养时，这种愈伤组织为淡黄
色块状，较为疏松，为非胚性愈伤组织。分化培养
时，将愈伤组织转移至含 1．0 mg／L BA+0．2 mg／L
NAA的 MS培养基上诱导不定芽分化和器官发生
(图 1)。为诱导洋桔梗胚性愈伤组织形成，将在
necSM上继代培养的非胚性愈伤组织转移至 eclM
上培养。实验中观察到在 eclM上形成了颗粒状黄
绿色致密的胚性愈伤组织(图 1)。按每块愈伤组织
形成愈性组织计算，胚性愈伤组织诱导率为 9．4 。
如果将该胚性愈伤组织挑出转移至 eclM上继代培
养时，胚性愈伤组织难于保持其胚性愈伤组织状态。
2．2 SOD活性及同工酶变化
洋桔梗愈伤组织在 eclM 和 necSM两种培养基
上随着培养天数增加，其可溶性蛋白含量变化如表
1所示，其 SOD活性如表 2所示。在两种培养基上
洋桔梗的可溶性蛋白含量在第 1O天到第 12天时达
到最高，而这与愈伤组织的生长速度密切相关 ，因为
大部分植物材料的愈伤组织均在第 1O天到第 12天
左右达到其最高生长的速度。
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2期 刘明志等：洋桔梗体细胞胚性愈伤组织诱导过程中超氧化物歧化酶和酯酶变化 249
图 1 洋桔梗愈伤组织在 eclM 和 necSM
上的SOD活性随培养天数的变化
Fig．1 Changes of S0D activities of Eustoma
grandiflorum calli on ecIM and necSM
after different days of culture
从表 2看出，洋桔梗愈伤组织的 SOD活性在
eclM和 necSM上的变化趋势相似，即在培养早期
SOD活性较低，第 6天后活性逐渐升高，第 8天达
到较高值，然后稍微下降后又持续升高，第 22天时
SOD活性达到最高值，第 24天 SOD活性较第 22
天时稍低，但仍维持在较高水平上。总的来说，除了
在培养早期外，洋桔梗愈伤组织在 necSM 培养基上
的SOD活性比其在 ecIM培养基上的高。
洋桔梗愈伤组织在 ecIM和 necSM培养基上培
养不同天数后，其 SOD同工酶电泳如图2所示。从
图 2看出，在培养早期 ，即培养至第 2～4天看，仅有
一 条SOD同工酶带，其贯穿于整个培养周期，从谱带
判断可能为Cu，Zn_SOD，存在于细胞质中。在第 6天
后出现了一条新的 SOD同工酶谱带，从谱带判断可
能为Mn-SOD或 Fe-SOD，前者存在于线粒体中，后者
存在于叶绿体中。这也表明，愈伤组织进入旺盛生长
期后，对氧的需求增加，诱导了新的 SOD同工酶表
达，该SOD同工酶可能与细胞的生长及分化有关。
图 2 非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织在不同
培养天数的sOD同工酶酶谱变化
Fig．2 Changes of S0D isoenzyme of Eustoma
grandi florum calli after different days of cuhure
d：天数}E：胚性愈伤组织}N：非胚性愈伤组织。下同。
d：days of culture；E：enbryogenic calli}N：non—
embryogenic calli．The same below．
2．3 EST同工酶的分析
洋桔梗愈伤组织在 ecIM 和 necSM两种培养基
上的酯酶同要酶电泳见图 3。从图 3看出，在第 16
～ 2O天时，在两种培养基上的洋桔梗愈伤组织的
EST同工酶酶谱带呈现显著缺失。但在第 24和 28
天时同工酶酶谱带增多，但随着培养时间的延长
EST同工酶酶谱带减少，在两种培养基上 EST同
工酶谱带减少，这表明EST同工酶谱带的数量与愈
伤组织的生长发育状况相关。
3 讨论
3．1 SOD与愈伤组织生长和分化有关。与胚性愈伤
组织诱导过程无相关性
SOD与细胞内氧气的吸收及代谢有关。通常，
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衰老的组织细胞(Del Rio等，2003)，协迫条件下
(G6mez等，2004)，出现新的 sOD同工酶谱带，
SOD活性也升高 。在血红蛋 白诱 导的棉花体细胞
胚胎发 生过 程 中，sOD 活性 升高 (Ganesan等，
2OO4)。在松柏体细胞胚 中 SOD活性升高(Mathieu
等，2006)。在耐盐 植物 冰花研究 中发 现，Cu，Zn—
SOD出现于 所有愈 伤组 织 中，而 Fe—SOD 和 Mn-
sOD仅出现于具再生潜力 的组织 中(Libik等，
2005)。这些结果表明，sOD与细胞分化和体细胞
胚形成有关。本实验观察到在两种培养基上，SOD
活性在第 6天后当愈伤组织进入生长期后，其活性
升高， 说明随着细胞生长和代谢活动增强，对氧
图3 洋桔梗愈伤组织在 eclM和 necSM上
培典不同天数的酯酶 同工酶变化
Fig．3 Changes of EST isoenzyme of Eustoma
grandiflorum ealli after different days of culture
气的需求增加。另一方面 ，也 出现了新的 SOD同工
酶谱带，同工酶谱带增加，使 SOD活性维持在一个
较高水平上。sOD活性与同工酶的变化趋势是一
致的。随着培养时间的延长，虽然在上述两种培养
基上含有抑制细胞分化的 2，4一D，但培养的植物细
胞均出现不同程度的分化，这也是必然趋势。比如，
随着培养时间的增加，叶绿体和线粒体以及胞质内
细胞器的分化是必然趋势。此外 ，随着培养时间延
长 ，代谢废物的积累，细胞内产生 的包括活性氧在内
的自由基必然增加 ，这必然导致 SOD活性 的增加 ，
以及新的sOD同工酶的表达。从本实验的研究结
果看，SOD活性及其同工酶与胚性愈伤组织诱导并
无明显的相关性。但在体细胞胚胎发生的不同发育
阶段以及器官发生时芽和根形成时，SOD是否有显
著差异，还需要进一步深入研究。
3．2酯酶与分化有关
酯酶(estrase)是体内具有广泛生理作用的一类
酶，在植物中的种类繁多。酯酶与细胞分化有关的
酶(Balen等，2003)。在脱分化过程中，酯酶出现特
征酶带，可作为脱分化的标志酶(赵洁等，1994)，失
去分化能力时，酯酶同工酶谱带减少(盛腊红等，
1999；张改娜等，2003)。本实验观察到，在两种培养
基上，当愈伤组织生长到第 16～20天时，酯酶同工
酶呈显著缺失，此前或此后酯酶同工酶均显示 10条
左右的谱带 。为何出现这种现象?据观察，在这期
间两种培养基上的愈伤组织的生长速度最快，进入
了旺盛生长期。那么在这期间细胞内部的生理生化
活动表现为合成代谢为主，而酯酶作为一种水解酶，
活性受到抑制 而为何出现这种急剧变化，目前很
难作出合理解释。随着培养时间延长酯酶同工酶谱
带逐渐减少，可能与细胞衰老有关。
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2期 杨德奎等：葫芦科 8属 11种植物花粉形态的扫描电镜观察 153
外壁均为较大清晰的网状雕纹，但从网眼大小、数量
及网脊和网眼内有无颗粒雕纹，3属间存在明显区
别。(3)黄瓜属花粉粒为近球形，具 3孔，外壁具坑、
穴状雕纹。(4)南瓜属花粉为球形，具散孔，外壁具
刺状雕纹。
从属内种间关系来看 ，葫芦属 中的葫芦和瓠子 ，
花粉粒大小相近，均为近球形，具 3孔沟，外壁为不
规则的网状雕纹，种问差异不明显，花粉形态特征上
无分类价值，支持瓠子为变种的观点。黄瓜属花粉
为近球形，具 3孔，外壁具坑状或穴状雕纹；黄瓜花
粉最大，外壁雕纹为坑状，大小深浅不等，甜瓜和小
马泡花粉大小相近，前者外壁为少量的穴状和大量
坑状雕纹 ，后者为大量的坑状 和大量穴状雕纹，外壁
雕纹的特征可作为种问分类 的依据 。
前人对西瓜属的西瓜 已有研究 报道 ，花粉为近
球形(王伏雄等，1997)，笔者研究 的结果为长球形 ，
这是否是利用不同的研究手段造成的，有待进一步
研究。
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