全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(3)：298— 301 2008年 5月
东亚砂藓取材部位对提取其总 RNA
及 DDRT-PCR的影响
沙 伟，师 帅
(齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘 要：分别采用新鲜东亚砂藓植物体先端、基部及中部作为材料，采用改良的SDS法，提取及纯化三部分的
总RNA。比较 RNA产率、纯度及分析电泳图谱来确定适于东亚砂藓 RNA分离的最佳部位。并运用mRNA
差异显示方法比较了东亚砂藓不同部位的差异。实验结果显示，东亚砂藓植物体的先端适于其总RNA提取
及 mRNA差异显示的研究。
关键词：东亚砂藓 ；RNA；mRNA差异显示；提取
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1OOO一3142(2OO8)03—0298—04
Efects 0f choosing different tissues 0f Racomitrium
i a ponicum 0n total RNA isolation and DDRT-PCR
SHA Wei，SHI Shuai
(Colege of Life Science and Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract：Total RNA was extracted from different tissues of R．japonicum by the method of SDS．We compared and
analyzed the rate of yield，purity of the total RNA from three parts of R．japonicurn．The mRNA differential display
method(DDRT-PCR)was used to study the differential expression of the three parts of R．japonicum．The results
showed that the top part of R．japonicum was better suitable for extracting total RNA and DDRT-PCR．
Key words：R．japonicum；RNA；mRNA differential display；isolation
基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核
心机制，分析不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、
不同生理状态下基因的表达状况，可为研究生命活
动过程提供重要信息(马小军等，2005)。Liang&
Pardee(1992)创立了 mRNA差异显示技术(DDRT—
PCR)，它具备需要 总 RNA 的量少 ，不需要纯化的
mRNA，操作简便、快速、灵敏、一次能分析多个样
品等优点(Arnold等，2003)，因而成为分离新基因
的首选方法，应用于体内和体外差异表达基因的筛
选，研究基因功能(Robb等，2001)。除成功应用于
动物及人类多种疾病与重要器官发生有关基因的鉴
定克隆外(俞作仁等，2003)，也成功应用于植物果实
发育、信号转导、植物抗逆与抗病性、胚胎发育、形态
发生等有关基因的分离与克隆，如水稻凝集素基因
表达、番茄果实膨大、小麦春化、水稻胞质雄性不育
及杂种优势相关基因等(秦庆明等，2003；Brummel
等，1999；江树业等，2001；谢晓东等，2003)。植物对
非生物胁迫的适应性研究主要集中于分离对胁迫作
出反应的相关基因，作为理解适应过程背后隐藏 的
分子事件的手段(刘艳等，2007)。
苔藓植物由于具有独特的抗旱能力，成为研究
植物抗旱机理和相关基因克隆的模式植物(欧阳浩淼
等，2004)。紫萼藓科(Grimmiaceae)砂藓属(Racomi—
trium)的东亚砂藓(R．japonicum)为典型的小型旱生
收稿 日期 ：2007—04—26 修回日期：2007-09-21
基金项目：黑龙江省农业攻关项目(GC06J101)；黑龙江省海外学人合作项目(1151hz022)；国家 自然科学基金(30470144)[Supported bytheKey
Agricultural Program of Science and Technology Department of Heilongjiang Province(Ge06J101)；the Abroad Cooperation Project Funds from Heilongiang
Education Department(115lhz022)；the National Natural Science Foundation of China(30470144)]
作者简介：沙伟(1963一)，女，教授，博士生导师，研究方 向为植物遗传学，(E—mail)Shwl129@263．net。
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3期 沙伟等：东亚砂藓取材部位对提取其总 RNA及 DDRT—PCR的影响 299
藓类，植物体粗壮，密集或松散丛生，主要生长在裸露
的岩石表面或岩石表面的薄土或砂土上。上无树木
遮蔽，下无湿润的土壤，而且，单层细胞的叶片没有特
殊的抗旱、抗寒及抗紫外线的结构(张晗等，2006)。
本文改良了王玉成(2006)的RNA提取方法，找到了
适合东亚砂藓的RNA提取方案，建立了比较完善的
东亚砂藓 mRNA差异显示技术体系，比较了不同取
材部位对于东亚砂藓总 RNA提取及 DDRT-PCR的
影响，为进一步深入开展东亚砂藓抗旱机理的研究奠
定基础。同时，为其它旱生苔藓植物 RNA提取及
mRNA差异显示技术反应体系建立提供参考。
1 材料和方法
1．1供试材料
东亚砂藓(R．japonicum)采 自五大连池(位于
黑龙江省的北部地区，地处高纬度)老黑山，装入干
燥的封口袋带至实验室，室温培养，其上覆盖一层塑
料膜，以保持水分。用镊子小心剥离出单个个体，用
蒸馏水冲刷 3次以去除沙粒及其他杂质。取材部位
分三组：植物体先端、基部、中部，一8O℃冷冻保存。主
要试剂：TaqDNA酶(BBI)；dNTPs(BBI)；锚定引物：
T13A(上海生工公司合成)；随机引物序列：AAGCT—
TACGATGC(上海生工公司合成)；RNase抑制剂
(BBI)；DEPC(BBI)；Tris酚(购 自上海生工公司)；
Mercaptoethanol(Biotech Grade，AMREDCO)。
1．2实验方法
1．2．1总 RNA提取 (1)每组取 0．5 g实验材料，在
液氮中研碎后放入 l_5 mL离心管，加入 0．4 mLTris
酚 ，混匀后 0．6 mLSDS提取液 (1_4 SDS(w／v)，
LiCl 0．09 mol·L- ，EDTf 4．5 mol·U ，KC1 0．2
mol·L- ，蔗糖 0．3 mol·L ，Tris 0．18 mol·L )，
0．06 mI2-巯基乙醇。旋涡振荡器剧烈振荡 3 min；加
入 0．15 mL无水乙醇，0．10 mL 3 mol·L- KAc，0．20
mL氯仿，摇匀 10 min；(2)4℃，12 000 r·min 离心
15 min，转移上清至新离心管中，加入等体积酚／氯仿
／异戊醇(25：24：1)，摇 匀 10 min，4℃，12 000 r·
mif 离心 5 min；(3)取上清加入 1／3体积 2 mol·L
NaAc，冰浴 30min；(4)4℃ ，12 000 r·rain 离心 15
min，取上清加入 1／3体积 4 mol·L- LiC1，混匀，-20
℃沉淀过夜；(5)4℃，12 000 r·mif 离心 15 min，弃
上清，7O 乙醇洗涤沉淀，4℃，12 000 r·rain 离心 5
mini(6)弃上清，400 L DEPC处理的超纯水溶解沉
淀，1／10体积 3 mol·L KAC，400 L酚／氯仿／异戊
醇(25：24：1)，混匀 10 min，4℃，12 000 r·rain 离
心 15 rain；(7)取上清，加 1／10体积 2 mol·L NaAe，
2．5倍体积无水乙醇，一7O℃沉淀 1 h；(8)4℃，12 000
r·rain 离心 15 rain，弃上清，7O 乙醇洗涤沉淀，4
℃，12 000 r·min 离心 5 min，30 L DEPC处理的超
纯水溶解沉淀，一2O℃保存备用。
1．2．2总 RNA 中污染 DNA 的去除 取 2O g总
RNA，加 2OI-1人胎盘 RNA酶抑制剂、2OU无 RNA酶
的 DNaseI、10 L 0．1 mol·L Tris·C1、1O L 0．1
mol·L Bufer、10 tL 0．1 mol·L MgClz，2 L锚定
引物 T13A，混匀，37℃孵育 30 rain。加等体积酚／氯
仿／异戊醇(25：24：1)，振荡，4℃，12 000 r·min
离心 15 rain。转移上清至新离心管中，加1／10体积 2
mol·L NaAe，2．5倍体积无水乙醇，一7O℃沉淀 1 h。
4℃，12 000 r·rain 离心 15 min，弃上清，7O％乙醇
洗涤沉淀，4℃，12 000 r·min 离心 5 min，20 L
DEPC处理的超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。
1．2．3 mRNA差异显示 (1)cDNA第一条链的合
成：反应体系：4 L 5×RT缓冲液，2 g总 RNA，2
,uL 0．1 mol／L DTT，20U 人胎盘 RNA酶抑制剂 ，1
L 10 mmol／L dNTPs。65℃5 rain，37℃10 min，加 1
L RT-反转录酶，37℃反转录 50 min，95℃处理 5
rain灭活反转录酶。(2)PCR扩增及琼脂糖电泳检
测：PCR扩增反应体系2O L，反转录混合物 2 L，1O
×PCR缓冲液 2 L，25 mmol·L MgC121．2 L，1O
mmol·L dNTPs 1．0 L，10 pmol锚定引物 1．5 L，
10 pmol随机引物 1．2 L，taq酶 0．5 L，ddH20补足
至2O L。PCR程序为：94℃5 rain，40℃ 2 rain，72
℃ 1．5 rain一个循环后 ，94℃ 45 S，42℃ 2 rain，72℃
1．5 rain 40个循环后 72℃延伸 5 rain。配制2％琼脂
糖凝胶，电泳检测。(3)差异带的回收、重扩增、琼脂
糖电泳检测：从凝胶上切下差异条带后，按 BBI公司
试剂盒说明书方法制备模板、对差异条带进行 PCR
再扩增，反应体系和程序同前，注意引物一致性。取
重扩增后反应 液，用 2％琼脂糖电泳检测，小心切下
琼脂糖单一条带的DNA回收，留作阳性鉴定。
2 结果与分析
2．1改良SDS提取东亚砂藓不同组织总RNA产量、
纯度比较
使用改良的 SDS法分别提取东亚砂藓植物体
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300 广 西 植 物 28卷
先端、基部、中部的总 RNA，结果见表 1，ODzso／
OD 。值均大于 1．8。这些数据均为典型的RNA紫
外吸收值比值，表明所获得 RNA纯度已达要求。
比较三部分 OD 。／OD 。表明端部 RNA纯度高于
基部及中部。从总RNA的产率上看，端部，中部总
RNA产率较基部高。
表 1 改良 SDS提取东亚砂藓不 同部位
总 RNA产量、纯度比较
Table 1 Comparisons of RNA yield from different
citrus parts of R．japonicum with modified SDS
2．2改良SDS提取东亚砂藓不 同组织 总 RNA完整
性比较
对东亚砂藓不同部位的总 RNA进行了 1．2 9／6
琼脂糖凝胶电泳检测，如图 1所示。28S和 18S的
带型均清晰完整，且28S的带大约是 18S的两倍，说
明所提的总 RNA完整性较好。从图中可明显看出
东亚砂藓尖端部及中部比基部的总RNA条带亮且清
晰，提取结果较为理想。试验中所获取不同部位的总
RNA样品在纯度和完整性方面均符合要求，可以顺
利进行后续的 DI)RT_PCR工作。
1 2 3
图 1 改 良SDS提取东亚砂藓不同
部位所得 RNA的电泳图谱
Fig．1 ElectroDhoresis of RNA from different parts
of R． nponicum with modified SDS
泳道 1：尖端总 RNA)泳道 2：基部总RNA)泳道 3：中部总 RNA。
Lane 1：total RAN from the top part of plants；Lane 2：
total RAN from the base part of plants；Lane
3：total RAN from the middle of plants．
2．3改良 SDS提 取东亚砂藓 不同组织 DDRT-PCR
检测
据Genespec测定结果调整反转录获得的 cDNA
的最适浓度。并以此为模板选择差异锚定引物与随
机引物进行差异显示 PCR扩增，扩增产物经2 9／6琼脂
糖凝胶电泳检测(图2)，尖端部比中部及基部条带清
晰，差异条带明显。分子量标准分析表明，cDNA条
带长度主要集 中在 500 2 000bp之间，且差异显示
明显，cDNA扩增带的丰度及长度均能满足 DDRT-
PCR技术的要求，进一步证明，东亚砂藓的尖端部是
获取高质量总 RNA及DDRT—PCR的理想材料。
图 2 东亚砂藓不同组织总 RNA的
DDRT-PCR琼脂糖凝胶 电泳图
Fig．2 Agarose gel electroDhoresis analysis of DDRT-
PCR product from different parts of R．canescens
M：分子量标准物；1：模板：东亚砂藓尖端；锚定引物T13A；随
机引物 AAGCTTACGATGC；2：模板：东亚砂藓基部；锚定
引物 T13A；随机引物 AA0C1vrACGATGC；3：模板：东亚砂
藓中部；锚定引物 T13A；随机引物 AA0c1vT-AcGATGc。
3 讨论
正确选择材料是应用差异显示技术克隆基因的
关键(董海涛等，2001)。本实验分别采用新鲜东亚
砂藓植物体先端、基部、中部作为材料。采用改良的
SDS法 ，提取及纯化三部分的总 RNA并进行 比较 ，
应用 DDRT—PCR方法对比了东亚砂藓植物体不同
部位的差异。表 明其 尖端 部适于其总 RNA 及
DDRT—PCR的研究。
苔藓植物 RNA提取的难点在于苔藓植物次生
代谢产物较多，如生物碱、黄酮、萜类、固醇类以及酚
类化合物等(欧阳浩淼等，2004)。这些物质造成
RNA的化学降解、酶解或影响 RNA的纯度。本文
改良了王玉成 SDS方法，在操作方法上与其不同的
是：(1)向液氮磨碎的植物组织中先加 Tris酚以释
放出的内源 RNA酶迅速变性，再加人 RNA提取缓
冲液和 p巯基乙醇，而后剧烈振荡以增强变性效果。
(2)为避免剧烈振荡对大分子核糖体 RNA(rRNA)
的破坏，我们采取了在提取缓冲液中加人蔗糖和氯
化钾的办法，以增加溶液的渗透压，从而对 RNA分
∞∞∞∞
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3期 沙伟等：东亚砂藓取材部位对提取其总 RNA及 DDRT—PCR的影响 301
子起到很好的渗透保护作用。(3)考虑到材料中含
有较多的次生代谢物质，加人较高浓度的 8巯基乙
醇和PVP，可以防止酚类等次生化合物被氧化而与
RNA结合，避免匀浆液变为褐色，影响 RNA的分
离纯化；而且 PVP能与这些化合物稳定地结合并在
以后的抽提步骤中被除去。8一巯基乙醇具有抗氧化
的作用，适当增加其浓度，可以防止氧化褐变(侯义
龙等，2003)，获得较好的 RNA提取效果。(4)采用
酸酚抽提，有效去除了蛋白质 。另外 ，酸酚不但抑制
RNase的活性，而且在酸性条件下，DNA和蛋白质
进人有机相，而 RNA留在水相中，提高了纯度与产
率。(5)抽提过程中加人低浓度的 KAc，能使植物
多糖形成沉淀，一起离心除去。这样第一次离心上
清液澄清，只需抽提一次就无蛋白层，减少 RNA损
失，提高 RNA产量。本实验方法应用于紫萼藓、拟
垂枝藓、绢藓等，也取得了较好的效果。
完整和均一是 评价 RNA 质 量 的最关 键标 准
(刘阁玲等，2006)。本试验提 取的总 RNA 完整性
好，无降解现象，三组总 RNA 的 OD。 。／OD。。值均
在 1．8～2．0之间，表明样品纯度高，且端部及中部
高于基部。为了检测所提取的 RNA的完整性，通
常采用甲醛变性电泳的方法，但是，RNA变性电泳
的步骤繁琐，费时费力。
本试验直接采用 1．2 非变性普通琼脂糖电泳
进行检测，电泳时所用电泳槽需用去污剂清洗，水冲
洗，乙醇干燥，最后用 DEPC水浸泡过夜 ，用水冲洗
干净。该方法简单、方便，检测结果清晰。
实验选用总 RNA作为反转录的模板，效果很
好。总RNA或纯化的mRNA作模板的差异结果基
本一致 ，用 Oligo(dT)法纯化 的 mRNA含有少量 的
Oigo(dT)片段，反而增加了差异表达的背景(Zim-
mern2ann& Schultz，1994)，因此在众多试验中均应用
总RNA作为模板。本试验用 2 琼脂糖凝胶电泳显
示 DDRT-PCR产物，将差异 eDNA条带直接切下，回
收纯化，进行二次 PCR。因为 2 琼脂糖凝胶可以有
效分离 1OO～3 000 bp的 DNA，且分离后 的 DNA有
足够高的产量用于亚克隆，避免了聚丙烯酰胺凝胶电
泳只能分离 100~600 bp大小的 DNA片段。实验设
备和操作均很简单，可准确容易地回收差异片段，省
时成本低，无污染，一般实验室就可进行。
采用改良SDS法提取东亚砂藓总 RNA，经其
mRNA差异显示体系扩增，于琼脂糖凝胶检测，可
以应用于东亚砂藓的抗性相关基因的表达研究，经
进一步优化，也可以应用于苔藓其他重要性状的分
子鉴定与功能基因的分离、克隆。
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(下转第 306页 Continue on page 306)
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306 广 西 植 物 28卷
花率低，可能与较长时间的花前生长期和资源竞争
有关；黄帚橐吾和箭叶橐吾 的结实率虽然 只有
13．2 和 12．4 ，但因花序大、花数量多，因此，有
性生殖在其种群扩散和物种的繁衍中仍起着重要作
用；黄帚橐吾、箭叶橐吾的 P／O比均明显低于多年
生草本植物的平均值，即存在着突出的花多果少现
象；三种橐吾的繁育系统以远交为主、部分 自交亲
和、虫媒、需要传粉者；传粉者缺乏和蝇类幼虫侵食
是三种橐吾有性生殖过程 中所 经历 的主要压力 ，是
影响其有性生殖效率的重要因素；植物为了保证生
殖成功所采取的适应对策有 ：大量开花 ，延长雌 、雄
配子体的功能期和传粉媒介泛化。
箭叶橐吾和黄帚橐吾，作为草原危害严重毒杂
草，在自然条件下，克隆生长的根状茎受到了草场其
它生物的竞争，其繁殖方式以有性生殖为主。提示
我们在保护青藏高原东缘的高寒草甸时，应该针对
植物有性生殖的器官，如抽出的花梗，开放的花序以
及形成 的种子等 ，抑制其后代 的散布和种群的扩大，
还要注意退化草场的生态恢复和物种保护，避免土
地沙化，使橐吾的克隆生长始终受到抑制，以防止其
在缺乏竞争环境中克隆繁殖得以释放，占据更为广
泛的生境。这些都启发我们，在未来的草场生态治
理工作中，需要考虑多重因素，采用综合办法，具有
针对性的采取科学合理的防治措施。
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