全 文 ：广 西 植 物 Guih i 0【 )：!! =互立一
文 章 编号 ：1000-3142(2000)04 0351—05
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毛 白杨愈伤组织悬浮细胞耐盐性研究
、／ 牛P7
赵 素然 ，梁 宇 ，李德 森 ，王 颖 ，杜荣骞
t南 开大 学 ￡命 科学 芈 院．灭 津 300071
摘 要 ：把生 长在 垒盐 含量 为 0 36] 的土 壤 中的 毛 白杨 (J opzdus￡ 洲 Carr)愈伤组 织 悬浮
细胞培养在吉不同浓度 NaC1的液体培养基中．定期涮量各组的细胞密度 ，根据生长曲线研究其耐
盐 性 结 果 显 示 ．与 不 加 NaC1的 液体 培养 基 相 比 ．生长 于 含较 低 浓度 NaCl(2 7‰ 和 5 5‰ )液 体
培 养 基 中 的细胞 生 长较 好 ．而 在吉 较 高浓度 NaCl(8 2％0和 10．9‰ )的 液 体培养 基 中 ．细胞生 长受
到 鞋 强抑 制 。
关键词：王曲 ；
中圉分粪号 ：Q949 733 05
愈伤组织 悬浮细胞培养
文 献 标识 码 ：A
Investigation Oil sal t tol erance of suspended
cel l of Populus t omentosa Carr．
ZHA0 Su—ran，LIANG Yu+LI De—sen，
(L Scle~eCollege．Nar~za u⋯
W ANG Ying，DU Rong—qian
Tian~n 300071-China)
Abstract：The suspended cel of Pope．s tornenlosa Cart．was cultivated in the medium containing Na—
Cl of different concentration．The density of the cell was measured and the growth cu~-ve was studied
It shows that the cels cu]tivated in the medium with low concentration of NaCI(2．7‰ and 5．5‰ )
grow better than those grown in the medium without NaC]．W hen the cel was cultivated in the medi—
um with NaCI of high concentration (8．2‰ and 10 9‰ )．the growth was inhibited obviously The
coDcentratioD of total salt in the a，∞ where the plants grew was 0 361
Key words：Populus￡ e ㈨ Cart f salt—tolerance；calus1 suspended cel；growth curve
土壤的盐溃化会对植物造成极大的危害，据统计 ，全世界共有 38 000万 hm 盐碱地，在
灌溉区还有 33 的次生盐渍化土壤。： 在我国 1亿 hm 耕地中，有十分之一为盐溃化土壤，另
外还有 0．2亿 hm 的盐荒地 我国盐溃化土壤分布很广，主要分布在华北、西北、东北西部以
及从豆宁到广东的滨海地带。滨海地 区的人 口集 中、工业发达，但农业生产在很大程度上受
收 疆 日期 ：l999—05一i4
作者苘介：赵索然 <1954一)．女．工程师 南开太学生命科学学院遗传工程研究室
基金项目：天津市 自然科学基金资助项 目 【编号 983802511)
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352 广 西 植 物 20卷
到土壤条件限制 ，同时也给绿化工作带来极大困难 。在人 口不断增长的今天，扩大耕地面积
和提高单位面积的产量是关系到人类衣食的头等大事 提高人 口聚集区的森林覆盖率，改善
生态环境是保障人民身体健康的重要措施。因此，改 良和利用大面积的盐渍化土壤 ，已成为
当务之急 长期 以来，国内外都投入了大量的人力和物力进行盐渍土的改良 多数运用工程
措施 ，这些措施虽然取得了一定的成绩 ，但是也有一些不可克服的缺点 ，如费用昂贵、效果
不能持久、消耗大量的淡水资源等。而运用生物学措施，研究植物耐盐性 、筛选和培育耐盐
植物就成了最优选择。我们以毛白杨为实验材料 ．应用悬浮细胞培养测定其愈伤组织在含不
同浓度 NaC[液体培养基中的生长状况，来研究细胞的耐盐性，以期对植物耐盐性的培育有所
帮助 。
1 材料和方法
I．1材 料
毛白杨 ~Populus t6vnentosaCarr．)幼茎．取 自南开大学校园 ，在诱导培养基上诱导出愈
伤组 织 。
1．2培养 基
1．2．1请导培养基 MS+ 2，4一D 0． mg／L十 NAA 0．1 mg／I + 6-BA 0．5 mg／L，pH 5．8。
1．2．2液体培养基 MS(不加琼脂)+2，4 D 0．j mg／L_一NAA 0．1 mg／I +6-BA 0．5 mg／L，
pH 5．8。
1．2．3盐胁迫液体培养基 MS(不加琼脂)+2，4-D 0．j mg／I 十NAA 0．1 mg／L+6-BA 0．5
mg／L+水 解 乳 蛋 白 0．5 g／I ，pH 5．8，每 L分别 加 入 0．000 g，3．000 g，6．000 g，9．000 g，
12．000 g NaCI，配成 5种盐胁迫培养基 。
1．3悬浮 细胞培养
取愈伤组织 3块 (约 4 g)压碎后放人装有 100mL液体培养基的 250mL三角瓶中，在
水浴摇床上 25。C 110 rpm振荡暗培养 3 d。取出，静置 5 min，弃去下层太的组织块和细胞团，
显微镜下观察 ，可见游离的细胞和较小的细胞团，即得到悬浮培养细胞。将此悬浮细胞置于
水浴摇床上 2j。C 105 rpm 继续振荡暗培养 2 d，备用。
1．3．1转移至盐胁迫培养基 中 取 5只 250 mL三角瓶，各加人 100 mI 盐胁迫培养基及 1O
mL悬浮培养细胞，摇匀。得到 0．0‰、2．7‰、5．5‰、8．2‰和 10．9‰ 5种盐胁迫培养细
胞 。
1．3．2分装培养 将上述每瓶盐胁迫悬浮培养细胞分装到 10个小培养瓶中，每瓶 10 mL，剩
余 的作细胞密度测定。标记好每一培养瓶，置于水浴摇床中 25。C，105 rpm暗培养 每 3 d从
每一盐浓度中取 1瓶，测定其细胞密度 。
1．3．3细胞密度的测定 取 l瓶待测悬浮培养细胞 ，摇匀 。用滴管取 9滴细胞悬浮液，滴于 比
色板上 ，再加 l滴 2．5 纤维索酶和果胶酶的混合酶液 ，25。c解离细胞 lo～15 min，用血球
计数板测其细胞密度。每一样品测 3次，重复取样 2次，以这 6个值的平均数作为该悬浮培
养细胞的细胞密度。
细胞密度按下式计算 ：
细胞密度 (个／mL)一9／j× (5个中格细胞总数)×10 ×10／9
一 (5个 中格 细胞 总数 ) ×2×1O
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4期 赵素然等：毛白杨愈伤组织悬浮细胞耐盐性研究 353
1．4土壤 样 品的采集和分析
在 毛白杨生长地取土样 用小铁铲取表层 (o～【J_5 cm)土．用开 口式土壤采样器 (土
钻)取 0．5～l5 cm、lj～25 cm、25~35 cm、35～4j cm、45～6o cm深度的土壤样品，风干
挑去风干后土样中的沙砾和植物残体 ，粉碎过筛 。用重量法测各层土壤全盐量。 。
2 实验结果
2．1细胞 生长 曲线
每 3 d记 录 1次在 不同浓 度 NaC1培养 液中 ，毛 白杨愈伤组 织悬浮细胞 的密 度 (见表 1)。
用 4次多项式拟合上述 5条曲线，结果见图 1。得回归方程如下 ：
Y1(不 含 NaC1)一5．974 7+1．642 8 x一0．277 1 x +0．O13 9 X 一0．000 2 X ；
Y2(含 2．7‰NaC1)一5．275 9+3．318 3 X一0．361 3 X +0．013 7 X 一0．000 2 X ；
Y3(含 5．5‰NaC1)一5．524 l一1．868 1 x一0．079 8 x +0．OJ 4 0 x 一0．000 2 x ：
Y4(含 8 2‰NaC1)一4．900 5—0．65I 7 X一0．141 2 X +0．007 7 X 一0．000 1 X ；
Y5(含 10．9‰ NaC1)一5．376 5—0．868 3 X+0．073 5 X 一0．002 5 X +0．000 0 X 。
上述 5条 曲线的最 大值 如下 ：
曲线 1：当生长到第 4．165 5 d时有
最大值，此时的细胞数量为 895．42个 ；血
线 2：当生长到第 6．998 4 d时有最大值，
此时的细胞数量为 l 501．92个；曲线 3：
当生长到第 5．102 3 d时有最大值，此时
的细胞数量为 949．56个；曲线 4：当生长
到第 3．066 9 d时有最大值，此时的细胞
数量为 578．44个 ；曲线 5：当生长到第
0．000 0 d时有最大值，此时的细胞数量
为 537．65个 。
从 以上结果 可 以看 出 ，在不 含 NaC1
的培养基 中，虽然细胞能很快达到最大
值，但细胞生长情况并不是最好的。在上
述 5种培养基中，古 2．7goNaCI的培养基
裹 l 舍不同浓度 NacI培养液中的
阚胞密度 (×104十／mL)
TaMe 1 Cel density in medium with NaC1 of
different concentration (×10 十 ／mL)
培养 天数 (d)
The⋯ mbe of
NaCI澉度 ~o~emradon (‰ )
dayto cu Ltivate 0·0 2 7 5·5 8 2 10-9
中细胞生长情况最好。由图 l可以看出，从开始培养起，它的生长势就很强劲，一直高于同
期其它培养基中的细胞。生长到第 7 d时达到最大值，细胞个数为 1 502个／mL。其次为含
5．5‰NaC1培养基 中的细胞 。它的各个时期的生长势仍高于不舍 NaCI的培养基中的细胞，当
其生长到第 5 d时 ，细胞数量达到最大值，细胞数量为 950个／mL。不古 NaC1培养基中的细
胞生长到第 4 d时 ，细胞数量就不再增加，只有 895个／mL。古 8 2‰和 10 9‰NaCI的培养
基 中，细胞生长在整个培养期都受到强抑制，特别是在含 10．9‰NaCI的培养基中，接种后细
胞数量急剧下降，虽然在培养 12 d以后略有增长 ，但终未达到接种时的细胞量 。
2．2土壤 全盐量
各层土壤含全盐量，如图 2所示 。60 cm 土层全盐量加权平均为 0．36l 。
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3j4 广 西 植 物 2O卷
3
植物对盐的耐受能力与许多因素有
关，而且植物在漫长的演化过程中盐生
植物 可以通 过 以下几种方 式来适 应环境
中的盐 胁迫⋯ ：泌盐植 物通过 盐腺细胞
将过多的盐分排出体外；稀盐植物通过
组织 肉质化 稀释盐分 ；拒盐植 物主要依
靠对盐的不透性适应盐渍化环境 。非盐
生植 物也可 通过生理性 适应在较 低盐浓
度条件 下生 长 虽然植 物整株 的耐盐性
与单个 细胞 的耐盐性并 不完全 一致 ，但
不管是那种 方式 的适应 ．在细胞 水平上
都应有所体现。因此，通过组织培养的方
法研究 愈伤 组织在 含盐 培养基上 的耐盐
性，已成为研究耐盐机理和选育耐盐植
物 的基 本手 段之一 。
周 荣仁 等“ 用逐 步增加 NaCI浓度
的 方 法，筛 选 出 烟 草 (Nicotiana
toOag~m)耐盐愈伤组织变异体 ，能耐 2
NaCI，但仅属 于生理 性适应 ，将 耐盐愈
伤组织移人无盐培养基后 ，其耐盐性逐
渐退化。从耐 2 NaCI的愈伤组织中再
生 出的植株后 代再 没表 现 出耐 盐性。
Croughan等 ：将苜蓿 (Medicago sati~,a)
子叶置于修改 的 blaydes培养 基 中．形成
愈伤组织．然后接种愈伤组织进行液体
O 3 6 0 1 2 1 5 18 7 30
培养时 间 ~u]tmetim t／d
罔 1 杨 树悬 浮 细胞 在 同 NaCt铱 度下 的生 长 由线
Fig 】 The chrom~ ome I]Utubers and karyotype of
Caltistephus chiaensis
1 o o (1 2 1 一 3 5 5 ％ ：4-8 2 5 】o 9％
土层 深度 Sol deplh／era
图 2 各层 土壤全 盐 量
Fig 2 The concentration of total salt oR each layer
培养，再将单细胞和小细胞团接种到含 l NaCI培养基中，每 5～6周转一次培养基 ，共计 8
个月后培养出一个耐盐的细胞系。此耐盐系在含 1 0 NaCI的培养基中生长量为非选择系的
4倍。而且 ，耐盐系在无盐条件下生长很差，需要一定浓度的 NaCI才能正常生长。
然而，也有许多人通过逐步提高盐浓度的方法获得可稳定遗传的植株 。赵瑞堂等人 将小
麦花药培养愈伤组织以 0．1 、0．3 和 0．5 的梯度逐步增加盐浓度筛选法获得可稳定遗传
的耐盐花培株系，其变异率约为 l／4。Dix 对辣椒的研究也得到类似结果。
一 些术本植物也可通过该途径获得耐盐突变体。王兴军等人 运用逐步提高盐浓度的方
法获得术槿耐盐愈伤组织 ，由愈伤组织再生的植株继续保持其耐盐性。张望东等“ 利用不断
提高群众杨悬浮细胞培养基中的 NaCI浓度获得耐盐体细胞突变体 。
毛白杨属轻耐盐碱植物 ，能在含盐 0．3 以下的土壤中生长 本实验材料的树龄已达
10 a以上，长期生长在盐胁迫的环境中。与生长在甜土中的同龄植株相比，植株较矮，胸径
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4期 赵素然等 ：毛白杨愈伤组织悬浮细胞耐盐性研究 355
较小 ，虽能生长，显然生长受到抑制 。从细胞生长状况看，植株已经适应于有盐环境 ，因此，
悬浮培养细胞在含 2．7‰和 5．5‰NaC[培养基中的生长状况反而好于无盐培养基中的细胞 。
当把适应于低盐的细胞转入高盐环境中之后 ，如图 1中的曲线 3和曲线 4，开始时尚有少量细
胞增殖，形成第一个峰 由于盐离子的毒害作用 ，随之，细胞生长受到强烈抑制。其 中少数
适应高盐环境的细胞大量增殖后 ，形成第二个峰。进一步提高了这些细胞对盐的耐受性 。
由本研究结果可以看出，通过盐胁迫作用 ，提高植物耐盐性 ，不仅在细胞水平上作用明
显，在整株水平上也是很明显的。以多年生长在含盐 0 3 左右土壤 中的毛白杨为外质体，诱
导出耐盐愈伤组织 ，以及愈伤组织耐盐性的进一步提高，给我们提 出一种新的思路：与用种
子繁殖的物种不同，对于营养繁殖的树种．可在细胞水平上通过盐胁迫提高其耐盐性，不管
这种耐盐性是遗传的还是生理的。将分化出的再生植株种植在盐土中，以保持其耐盐性 ，通
过营养体进行繁殖 ，使这种耐盐特性一代代传递下去，以这种方法获得绿化树种，可以说是
一 种 简捷 有效 的途 径 。
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(5 ： 4】8～ 4】8
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