全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(5)：599— 603 2008年 9月
丹参 ISSR—PCR反应体系的建立与正交优化
李 嵘，王枯之
(陕西师范大学 生命科学学院，西安 710062)
摘 要：利用正交试验设计的方法，从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、MgZ+浓度、dNTP浓度4种因素3个
水平，对丹参 ISSR—PCR反应体系进行优化分析，并在此基础上对模板 DNA浓度、PCR反应过程中的退火温
度进行梯度检测。结果表明：2O L ISSR—PCR反应体系中各因素的最佳浓度为 1×PCR buffer、200 fxmol／L
dNTP、1．0／xmol／L引物、1．5 mmol／L Mg +和1 U Taq DNA聚合酶，最佳模板DNA浓度为20~60 ng，引物
UBC 835的最佳退火温度为51．7℃。
关键词：丹参；ISSR—PCR；反应体系；正交优化
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2008)05—0599-05
Establishment and orthogonal optimization of ISSR-
PCR amplification system in Salvia miltiorrhiza
LI Rong，WANG Zhe—Zhi
(Colege of Li Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)
Abstract：In this paper，the orthogonal design was used tO optimize the ISSR-PCR amplification system of Salvia
miltiorrhiza in four factors(the concentration of dNTP，Primers，Mg + and Taq DNA polymerase)at three levels
respectively．Then，based on the optimal ISSR-PCR amplification system ，the concentration of template DNA and an—
nealing temperature were proposed by gradient PCR．The results showed that：a suitable ISSR-PCR amplification
system of S．miltiorrhiza was established．In a total volume of 2O L ISSR-PCR amplification system，it contains 1×
PCR buffer，200／xmol／L dNTP，1．0／*mol／L primer，1．5 mmol／L Mg2+，1 U Taq DNA polymerase and 20~60 ng
template DNA．The optimal annealing temperature for primer UBC 835 is 51．7℃．
Key words：Salvia miltiorrhiza；ISSR-PCR；amplification system；orthogonal optimization
丹参(Salvia miltiorrhiza)属唇形科(Lamiace—
ae)鼠尾草属(Salvia)，为多年生草本植物，生于海
拔 100～l 300 m的山沟、溪边及林中阴湿处，主要
分布于我国的安徽、河北、河南、湖北、湖南、江苏、陕
西、山东、山西、浙江及 13本 (Li Hedge，1994)。
其干燥根及根茎人药，味苦，微寒，有祛瘀止痛，活血
通经，清心除烦的作用，主要用于月经不调，经闭痛
经，胸腹刺痛 ，热痹疼痛 ，疮疡肿痛 ，心烦不 眠，肝脾
肿大，心绞痛等(国家药典委员会，2005)。
简单重复序列间区(inter—simple sequence re—
peat，ISSR)是在简单重复序列(simple sequence re—
peat，SSR)分子标记技术基础之上，发展起来的一
种基于 PCR的新型 DNA分子标记技术，由 Zietk—
iewicz等(1994)提出。由于 ISSR标记技术结合了
RAPD标记技术和 SSR标记技术的优点，实验操作
简单、快速、高效、重复性高、稳定性好、耗资少，在不
知道 DNA序列的情况下即可用引物进行 PCR扩
增，其扩增产物所揭示的多态性比RFLP、RAPD和
收稿日期：2007—04—17 修回日期：2007—07—28
基金项目：国家“十五”科技攻关项目(20。4BA721A35)[Supported by Key Technologies Research and Development Program of State Tenth Five-Year
Plan Project(20O4BA721A35)]
作者简介：李嵘，男，主要从事植物分子生物学研究，(E-mail)lirong@snnu．edu．en。
600 广 西 植 物 28卷
SSR更高，并可提供多位点信息和揭示不同微卫星
座位个体问变异的信息(Dirlewanger等，1998；Blair
等，1999；Esselman等，1999；Gilbert等，1999；杜道
林等，2001)，因此，ISSR标记技术已广泛应用于遗
传连锁图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定、植物
分类、进化和遗传多样性等研究 中(Kantety等，
1 995；Nagaoka Ogihara，l 997；Ratnapapkhe等，
1998；Prevost& Wilkinson，1999；Ddvila等，1999；
Arcade等，2000；Joshi等，2000；Ammiraju等，
2001；Casasoli等，2001)。
进行 ISSR分子标记时，首先应对反应体系进
行优化，筛选出最佳反应条件。若以单因子试验进
行筛选，难免顾此失彼，忽略各因子间的互作效应，
而正交试验设计具有均衡分散、综合可比、伸缩性
强、效应明显、易于了解各因素之间的内在规律，从
而快速找到最优水平组合的特点(盖钧益，2000)。
鉴于此，本文在参考经典 PCR反应条件的同时，利
用正交试验设计的思路，从引物浓度、Taq DNA聚
合酶浓度、Mg 浓度、dNTP浓度 4种因素 3个水
平，对丹参 ISSR-PCR反应体系进行优化分析，并在
此基础上对模板 DNA浓度、PCR反应过程中的退
火温度进行梯度检测分析，旨在建立适合丹参 IS—
SR—PCR的最佳反应体系，为后期丹参遗传连锁图
谱的构建、基因定位、种质资源的优选、种群遗传结
构与分化等研究奠定一定的基础。
1 材料和方法
1．1材料
供试材料为丹参(Salvia miltiorrhiza)3年生
实生苗嫩叶，2006年 3月 25日采自陕西师范大学
丹参种质资源圃，该种苗于2005年 4月从陕西安康
引种 。
1．2试剂
实验所用 Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker
(DL2000)均购自TaKaRa(宝)生物工程(大连)有限
公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Univer—
sity of British Columbia，UBC)所设计的引物，由上海
生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序
列如 下 (5 一 3 )：UBC 807：(AG)8T；UBC 811：
(GA)8G；UBC 835：(AG)8YC；UBC 836：(AT)8YA；
UBC 842：(GA)8YG，Y代表 G和C。
1．3基因组总 DNA的提取
采用改良的 CTAB微量法提取基因组总 DNA
(邹喻苹等，2001；周延清，2005)，用 0．8 的琼脂糖
电泳检测 DNA质量，DNA 的纯度和浓度用美国
Thermo Electron Corporation公司生产的 Unicam
UV 300紫外分光光度计测定，并将 DNA浓度稀释
至 2O ng／#L。
1．4 ISSR-PCR反应体系正交试验设计与PCR扩增
采用 L。(3 )正交试验设计，对 dNTP浓度、引
物浓度、Mg。 浓度、Taq DNA聚合酶浓度进行 4因
素3水平筛选，方案如表 l、2。
表 1 ISSR-PCR反应体系的因素与水平
Table 1 Factors and levels of ISSR—PCR
amplification system
因素 Factors
水平(体系终浓度)
Levels(Final concentrati0n)
1 2 3
dNTP(#mol／L) 150 200 250
Primers(#mol／I ) 0．25 0．50 1．0
Mg (mmol／L) 1．5 2．0 2．5
Taq DNA polymerase(u／2o“L) 0．5 1．0 2．0
表 2 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计
Table 2 L9(3 )orthogonal design of factors and
levels of ISSR—PCR amplification system
T
处
re
理
at m ent
dNTP Primers Mg2+ T aq DN A
(#mol／L tzmol／I (mmol／I )( ) ) lu
根据表 1、2配制总体积为 2O L的PCR反应体
系，除表中变化因素外，每管中还含有 1×PCR bufer
和40 ng模板 DNA，引物选用 UBC835，每处理设 2
次重复。PCR扩增反应在美国Bio-Rad公司生产的
MyCyclerTM Thermal Cycler 580BR 4255型仪上进
行，预扩增程序：94℃预变性 10 min；94℃变性 30 S，
52℃退火6O S，72℃延伸 60 S，循环 35次；72℃延伸
10 rain，4℃保存。PCR产物用 1．3 9／5琼脂糖凝胶(含
EB 0．5／~g／mL)于 4 V／cm电压下电泳2 h，电泳结果
用美国 Media Cybernetics公司生产的 UVP GDS-
5期 李嵘等：丹参 ISSR—PCR反应体系的建立与正交优化 601
8000凝胶成像系统拍照分析。
1．5 ISSR—PCR反应体 系中模板 DNA浓度的优化
根据正交试验结果选出最佳反应体系组合后，
再对模板 DNA浓度进行梯度试验，优化筛选合适
的模板 DNA浓度。2O L反应体系中模板 DNA
设 1O、2O、4O、6O、80、i00、120 ng七个处理，每个处
理设 2次重复，其它反应程序和体系组合均与正交
试验设计中最佳反应体系相同。
1．6 ISSR-PCR反应体系中退火温度的优化
在上述试验确定的最佳反应体系基础之上，对
退火温度进行梯度试验，优化筛选最佳退火温度。
在 PCR梯度扩增仪上设置最小退火温度为 48℃，
最大为 58℃，PCR仪 自动形成 8个梯度，即 48、
48．7、49．9、51．7、54．1、56、57．2、58℃，每个梯度设
2次重复，其它反应程序和体系组合均与试验确定
的最佳反应体系相同。
1．7 ISSR—PCR反应体系的稳定性检测
选择另外 4个 ISSR引物 UBC807、UBC811、
UBC836、UBC842对优化确定的丹参 ISSR—PCR反
应体系的稳定性进行检测，每个引物设 2次重复。
2 结果和分析
2．1 ISSR-PCR反应体系的正交优化
参照何正文等(1998)的方法，对 PCR扩增结果
依据谱带的强弱和杂带的多少进行直观分析。由图
1看出，不同处理间，由于 dNTP、引物、Mg抖和 Taq
DNA聚合酶的浓度不同，其扩增结果存在明显差
异。组合 1的扩增效果最差，谱带弱且多态性低，其
原因可能是反应体系中 dNTP浓度和引物浓度较
低所致。组合 3与 8扩增谱带较强，但多态性较低，
究其原因，组合 3可能是反应体系中 dNTP浓度过
低，反应不完全，扩增产率较低；组合 8可能是反应
体系中dNTP浓度较高，对 Mg。 产生抑制作用，从
而影响 Taq DNA聚合酶的活性，导致反应不充分。
组合 2、5、9扩增谱带的多态性较高，但谱带较弱，致
使条带无法区分，其原因，组合 2可能是反应体系中
dNTP浓度过低，反应不完全，导致 PCR扩增量不
足；组合 5可能是反应体系中Mg。 浓度过高，非特
异性扩增产物增加，导致 PCR扩增结果受背景噪音
干扰；组合 9可能是受反应体系中 Taq DNA聚合
酶浓度较低和 dNTP浓度较高的双重影响，过高的
dNTP浓度抑制了Mg 的作用，减弱 Taq DNA聚
合酶的活性，这就使本身 Taq DNA聚合酶浓度较
低的反应体系更加无法充分完成反应，导致扩增产
物大为减少。组合 4、6、7扩增谱带清晰，且多态性
高，但组合 4、7有严重的 Smear现象发生，其原因
是组合 4、7反应体系中的引物浓度较低，其与模板
DNA结合位点少，导致 PCR扩增产量下降。最佳
组合应选择特异性谱带清晰、谱带多态性高，且谱带
稳定的组合，故本实验选择组合 6为最佳组合，即
2O L ISSR—PCR反应体系中含 1×PCR buffer、
200／~mol／L dNTP、1．0／2mol／L引物 、1．5 mmol／L
Mg。 和 1 U Taq DNA聚合酶。
图 1 正交试验设计 ISSR-PCR反应体系的扩增结果
Fig．1 The results of ISSR—PCR amplification
system according to orthogonal design
1-9：表2的处理组合编号；M：DNA maker
DL2000，下同；引物：UBC835。
2．2不同模板 DNA浓度对 ISSR-PCR反应体系的影响
根据正交试验结果选择组合 6对模板 DNA浓
度进行梯度筛选。由图 2看出，由于模板 DNA浓
度不同，其扩增结果也存在一定的差异。在 2O L
ISSR—PCR反应体系中，模板 DNA浓度由 1O～120
ng虽均能扩增出谱带，但模板 DNA浓度为 1O ng
时，由于浓度过低，造成扩增谱带的缺失；模板 DNA
浓度为 8O、100、120 ng时，由于浓度过高，引起非特
异性扩增，导致背景呈弥散状，难以区分谱带。模板
DNA浓度为 20、4O、6O ng时，谱带清晰、多态性高，
且较稳定。因此，本实验确定 2O L ISSR—PCR反
应体系中，最佳模板 DNA浓度为 20~60 ng。
2．3不同退火温度对 ISSR-PCR反应体系的影响
根据正交试验和模板 DNA浓度的筛选结果，
选择组合 6(模板 DNA浓度为 40 ng)对引物 UBC
835的退火温度进行梯度筛选。由图 3看出，由于
退火温度不同，其扩增结果也存在明显的差异。在
2O L ISSR—PCR反应体系中，退火温度由48℃升
到58℃虽均能扩增出谱带，但退火温度为 48～
49．9℃时，由于退火温度过低，特异性较差，除主带
6O2 广 西 植 物 28卷
外，杂带多，背景模糊；随着退火温度升高(54．1～58
℃)，引物与模板的特异性增强，但多态性偏低，且谱
带亮度越趋减弱。退火温度为51．7℃时，谱带主带
清晰、杂带少，且多态性较高，因此，本实验确定引物
UBC 835的最佳退火温度为 51．7℃。
图 2 ISSR—PCR反应体系中不同模板
DNA浓度的扩增结果
Fig．2 The results of ISSR—PCR amplification system
with different concentrations of DNA template
1：10 ng；2：20 ng；3：40 ng；4；60 ng；5：8O ng；
6：100 ng；7：120 ng；引物：UBC835。
2．4 ISSR-PCR反应体 系的稳定性检测
根据正交试验和模板 DNA浓度的筛选结果，
选择另外 4个 ISSR引物 UBC 807、UBC 81l、UBC
836、UBC 842对优化确定的丹参 ISSR—PCR反应
体系(正交试验设计组合 6，模板 DNA浓度为 4O
ng)的稳定性进行检测 (图 4)。由图 4看 出，所选 4
个ISSR引物均能扩增出清晰明朗、多态性高、重复
性好的谱带，表明优化确立的丹参 ISSR-PCR反应
体系是稳定可靠的。
图 3 ISSR-PCR反应体系中不同退火温度的扩增结果
Fig．3 The results of ISSR—PCR amplification
system with different annealing temperature
1：48℃ ；2：48．7℃ ；3：49．9℃ ；4：51．7℃ ；5：54．1℃ ；
6：56℃ ；7：57．2℃ ；8：58℃ ；引物：UBC835。
3 讨论
由于 ISSR分子标记技术是基于 PCR的一种
分子标记技术，其扩增结果受模板 DNA浓度、引物
浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg。 浓度、dNTP浓
图 4 ISSR—PCR反应体系中不同引物的扩增结果
Fig．4 The results of ISSR—PCR amplification
system with different primers
1：UBC807；2：UBC811；3；UBC836；4：UBC842。
度等多种因素的综合影响。本研究的结果也表明，
采用不同的反应体系组合及不同的反应程序，其扩
增结果差异很大。
Taq DNA聚合酶的浓度是影响 ISSR—PCR扩
增结果的重要因素。酶浓度过高，不仅增加实验成
本，而且易引起非特异性扩增，导致背景弥散；酶浓
度过低，则无扩增产物或产物不稳定，其常用浓度为
1～2．5 U(Bruno Rhonda，1993)。此 外，Taq
DNA聚合酶是 Mg。 依赖性酶，在 ISSR—PCR反应
体系中，Mg 浓度也极为重要，浓度过高，容易生成
非特异性扩增产物，使背景噪音加强，浓度过低，扩
增效率下降，甚至不能扩增出谱带，适宜的Mg抖浓
度为 0．5～2．5 mmol／L(张青林 等，2004)。但
Mg抖最终反应浓度还会受体系中其它成分，尤其是
dNTP的影响，因为 dNTP分子中的磷酸基团能定
量地与Mg 结合，使实际参加反应的Mg抖浓度下
降，对 Mg 产 生抑制 作用 (李文表 等，2006)。
dNTP是靶序列扩增的原料，浓度过高易引起非特
异性扩增，过低则不足以完成设定的循环数就终止
反应，导致 PCR扩增产量不足，不利于结果的检测，
常用 dNTP浓度为 200／xmol／L(郑景生等，2003)。
引物浓度也是影响 ISSR—PCR扩增结果的一个重要
因素，浓度过高，易引起碱基错配和产生非特异性扩
增，还易形成引物二聚体，浓度过低，其与模板DNA
结合位点减少，扩增产物下降，并有可能出现 Smear
现象(冯富娟等，2004)。本研究中，采用 (3 )正交
试验设计，对 dNTP浓度、引物浓度、Md 浓度、Taq
DNA聚合酶浓度进行 4因素 3水平筛选，确定组合 6
为最佳组合，即20 L ISSR-PCR反应体系中含 1×
PCR buffer、200#mol／L dNTP、1．0 gmol／L引物、1．5
mmol／L Mg 和 1 U Taq DNA聚合酶。
模板 DNA浓度对 ISSR—PCR扩增结果也有一
定的影响，浓度太高，非特异性扩增加强，电泳图谱
5期 李嵘等：丹参 ISSR—PCR反应体系的建立与正交优化 6O3
背景弥散模糊，浓度过低，扩增出的谱带亮度较弱，
抑或无扩增产物。但总的来说，模板 DNA浓度的适
宜范围较宽，在此适宜范围内，不同的模板 DNA浓度
不会对ISSR-PCR扩增结果造成明显的影响(王彦华
等，2004)。本研究的结果表明，20／xL ISSR-PCR反
应体系中，最佳模板 DNA浓度为 20~60 ng。
本研究利用正交试验设计具有均衡分散、综合
可比、伸缩性强、效应明显的特点(盖钧益，2O00)，对
影响 ISSR—PCR反应体系的主要因素进行优化筛选
分析，快速选出了最佳实验组合，避免了单因素试验
结果的不足。由此看来，对受多因素综合影响的
ISSR—PCR反应体系来说，正交试验设计在了解各
因素之间的内在规律，从而为快速找到最优水平组
合的实验体系方面，是一种值得借鉴的方法。
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