全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(5)：604— 607 2008年 9月
姜花属 SRAP—PCR体系的优化与建立
高丽霞1，3，刘 念 ，黄邦海3，张 伟4
(1．中国科学院华南植物园，广州 510650；2．仲恺农业技术学院，广州 510225；3．广州市
农业技术推广中心，广州 510520；4．华南农业大学 ，广州 510642)
摘 要：对姜花属的SRAP—PCR反应体系进行了Mg离子、dNTPs、Taq酶、引物以及模板 DNA浓度等方面
的优化，除 Mg离子浓度外，优化后的体系在其它各成分上，与原始体系相比，均显著降低了用量，节约了成
本。并用优化后的体系对姜科其它 14个属进行了扩增，均可得到良好的扩增效果，而且揭示的多态性很高，
说明 SRAP标记可以用来进行姜科各属内及属间分类和亲缘关系分析。
关键词：姜花属 ；SRAP；优化 ；分类；亲缘关系分析
中图分类号 ：Q949．71 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)05—0604—04
Optimization and formation SRAP
system in Hea’yct—uum
GA0 Li-Xia1，3，LIU Nian2 ，HUANG Bang-Hai3，ZHANG W ei4
(1．South China Botanical G口rden，the C inese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China；2．Zhongkai University
ofAgriculture and Technology，Guangzhou 510225，China；3．Guangzhou Agricultural Technology Extension
Center，Guangzhou 510520，China；4．South Ch ina Agricultural University，Guangzhou 510642，China)
Abstract：The system of SRAP in Hedychium was optimized including the concentration of Mg ，dNTPs，TaqE，
primers and DNA template etc．Compared with original system，this system reduced notably the consumption of al
components except Mg +．Amplified reactions of other fourteen genera in Zingiberaceae with this system appeared
clear bands and high polymorphism．The result showed that SRAP maker can be used in taxonomy and genetic con—
nection analysis of varieties，species or genera in Zingiberaeeae．
Key words：Hedychium；SRAP；optimize；taxonomy；genetic connection analysis
姜花属(Hedychium)隶属于姜科(Zingiberace-
ae)的姜亚科姜花族(吴德邻，1981)，是姜科中一个
具有约 8O个种的属，分布类型为热带亚洲至热带非
洲(吴征镒，1991)。中国国产的种类主要分布在西
南至华南地区，约有 29种及 3变种。姜花属植物是
极受欢迎的园林绿化观赏植物，全世界己培育出园
艺品种近百个。在中国，有关姜花属的研究工作甚
少，以致市场上姜花品种单一，完全没有开发出其作
为香型切花的巨大潜力。为加快姜花属的育种进
程，我们开始了其分子遗传学方面的研究，以对香
气、色彩、花序苞片排列方式等重要性状的遗传规律
进行研究定位。本文对姜花属的 SRAP—PCR体系
进行了优化，为姜花属遗传连锁图谱构建、QTL定
位打下基础。
SRAP(Sequence—Related Amplified Polymor—
phism，相关序列扩增多态性)技术由美国加州大学
蔬菜作物系 Li& Quiros于 2001年提出。该标记
通过一对引物对开放读码框(ORFs)进行扩增，分为
17个碱基的正向引物(F—primer)和 18个碱基的反
向引物(R—primer)。该标记的特点是：多态性高，产
收稿日期 ：2006—12—25 修回日期 ：2007—04—16
基金项目：广东省科技攻关项目(2006B20201044)[Supported by Science and Technology Key Program of Guangdong Province(20o6B202O1O44)]
作者简介：高丽霞(1980一)，女，山东泰安人，博士，主要从事园林植物的分子遗传学研究。
通讯作者(Author for coresp0ndence，E—mail：liunian678@163．corn)
5期 高丽霞等：姜花属 SRAP—PCR体系的优化与建立 605
率中等，重复性好，操作简单，在基因组中分布均匀，
较易对扩增得到的目标片段进行测序，引物具有通
用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组
合，因此用少量的引物可组配得到多个引物对，提高
了引物的使用效率，降低引物合成成本。此标记最
早是在芸薹属作物 (Li& Quiros，2001)中开发利
用，目前已在马铃薯、水稻、莴苣、花椰菜、油菜和大
蒜等植物中使用，并且应用于遗传多样性分析、比较
基因组学、图谱构建等方面(林忠旭等，2003，2004；
Ferriol等，2003，2004)。
本文在 Li& Quiros(2001)的反应体系的基础
上，对 Mg 浓度、dNTPs浓度、Taqase浓度、模板
DNA浓度、引物浓度进行了优化。并以建立的优化
体系对姜花属的近缘属进行扩增，以期将该标记用
于姜科分类与亲缘关系分析中。
1 材料与方法
1．1材料
用于 SRAP分析的姜科材料见表 1。
表 1 用于 SRAP分析的姜科材料
Table 1 Materials of Zingiberaeeae for SRAP analysis
表 2 SRAP体 系优化试验设计
Table 2 Design for SRAP system optimizing
不同水平 Level 1 2 3 4 5 6 7 8
M 浓度 0．5 1．0 1．5 2．0 2．5 3．0 3．5 4．0
(mmol／L)
dNTPs浓度 0．05 0．10 0．15 0．20 0．25 0．30
(mmol／I )
Taqase浓度 0．5 1．0 1．25 1．5 2．0
(U／25 L)
引物浓度(pmo1) 2．5 5 7．5 10 12．5 15 17．5 20
DNA模板用量(ng) 15 30 45 60 75 90 105 120
1．2试验方法
(1)DNA提取方法：按 Murray& Thompson
(1980)的 CTAB法，并稍作改动。(2)SRAP反应
体系的优化试验：体系优化试验是以 Li& Quiros
(2OO1)的反应体系为原始体系，分别对 Mg 浓度、
dNTPs浓度、Taqase浓度、模板 DNA浓度、引物浓
度进 行优化，具 体如 表 2示。选 用 引物 ME一2
(TGAGTCCAAACCGGAGC)／EM一2(GACTGCG—
TACGAATTTGC)(Li&Quiros，2001)，反应体积
25 L，在 PTC-200热循环仪上进行。(3)属间扩增
试 验：选 用 引 物 ME一5(TGAGTCCAAACCG—
GAAG)／EM-5(GACTGCGTACGAATTAAC)(Li
&Quiros，2001)，其余同(2)。
2 结果与分析
2．1 M 浓度对扩增体系的影响
Mg 浓度对于 PCR反映的成功与否关系密
切，它与产物的特异性、产物的忠实性、引物二聚体
的生成、酶活力以及产物的产量等诸多因素有关。
对 0．5～4．0 mmol／L的 Mg 浓度进行对比。由图
1可见，Mg。 浓度在 3．O～4．0 mmol／L之间变化不
大，低于 2．5 mmol／L时，几乎元任何谱带。因此
Mg 浓度应该不低于 3 mmol／L。
606 广 西 植 物 28卷
1 2 3 4 5 6 7 8
图 1 不同 Mg2+浓度对SRAP扩增的影响
(ME一2／EM一2扩增峨嵋姜花 ，下同)
Fig．1 Effect of different Mgz+ concentrations
on the SRAP profiles
1～8．Mg0 浓度 Concentration(mM)；0．5，
1．0，1．5。2．0。2．5，3．0，3．5，4．0
2．2 dNTPs和 TaqE浓度
2 3 4 5 6
图 2 不同 dNTPs浓度对 SRAP扩增的影响
Fig．2 Effect of different dNTPs concentrations
on the SRAP profiles
1～6．dNTPs浓度 Concentration(mM)：
0．05，0．10，0．15，0．20，0．25，0．30。
2 3 4
图 3 不同 TaqE浓度对 SRAP扩增的影响
Fig．3 Effect of different TaqE concentrations
on the SRAP profiles
1～5．TaqE浓度 Concentration(mM)：0．5，1．0，1．25，1．5，2．0。
2．3引物浓度
dNTPs浓度和 TaqE浓度与 PCR的产量以及
产物的忠实性有关，由图 2、3可见，dNTPs从 0．05
～ o．30 mmol／L对扩增产量影响不大，谱带一致；
Taqase用量在 0．5～2U／25 L之间无差异。所以，
dNTPs浓度可选用 0．05 mmol／L，Taqase可以用
0．5u／25 L。
由图 4可见，引物用量大于 5pmol时谱带较为
清晰，7．5～20 pmol之间的谱带无明显差异，2．5
pmol用量时几乎无谱带，说明提高引物的用量可以
提高产量，但是引物过多时会在反应过程中形成二
聚体，应该设置引物浓度不低于 5 pmol。
2 3 4 5 6 7 8
图 4 不同引物浓度对SRAP扩增的影响
Fig．4 Effect of different primers concentrations
on the SRAP profiles
1～8．引物浓度 Primers concentration(pmo1)：2．5，
5，7．5，10，12．5，15，17．5，20。
1 2 3 4 5 6 7 8
图 5 不同 DNA模板用量对 SRAP的影响
Fig．5 Effect of different DNA template
contents on the SRAP profiles
148．DNA模板用量 DNA template(ng／25~L)：15，
3O，45，60，75，90，105，12O。
2．4 DNA模板用量
为了找到适宜的 DNA模板用量，对 15～120
ng／25 L之间的不同DNA模板用量进行比较。从
5期 高丽霞等：姜花属 SRAP—PCR体系的优化与建立 6O7
图 5中可以看出在 15～120 ng／25#L范围内，模板
用量对扩增的影响不大。这便省却了样品量较大时
测量 DNA浓度这一琐碎步骤。
2．5优化后的体系
综合以上结果，在保证扩增产量和特异性的基
础上，为节约成本，优化后 25 tLL反应体系见表 3。
表 3 优化前后的反应体系比较
Table 3 Comparison of optimized reaction
system and former system
反应体系
reactt0n
system
原 始 体 系 Former
systemfLi& Qui—
ros，2001)
优 化 体 系 Opti一 15
mized system
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 O 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5
图 6 利用引物 ME一5／EM-5对姜科 l5个属的扩增结果
Fig．6 Result of SRAP profiles to fifteen genus in
Zingiberaceae based on primer ME-5／EM一5
1～15．单叶姜；茴香砂仁；单叶拟豆蔻；砂仁；艳山姜；生姜；舞花
姜；土田七；心叶凹唇姜；山奈；喙花姜；闭鞘姜；黄白姜花；姜黄；
黄花大苞姜。
1～ 15．Elettariopsis monophylia，Etlingera yunnanensis，Elet—
tariopsis monophylla，Amomum villosum ，Alpinia zerumbet
Zingiber of]icinale，Globba racemosa，Stahlianthus involucra—
tus，Boesenbergia longiflora，KaempJ)ria galanga，Rhynchant—
hus beesianus，Costus speciosus，Hedychium chrysoleucum ，Cur—
CUTnfZ longa，CaulokaempJ~ria coenobialis．
2．6优化体系对不同属 的扩增
利用优化后的体系对姜科十五个属进行扩增，
其扩增结果如图 6所示。都能获得较为清晰的谱
带，而且揭示的多态性很高，说明 SRAP标记可以
用来进行姜科各属内、属间，乃至种间和种内的分类
和亲缘关系分析。
3 讨论
姜花属乃至姜科中有大量具开发价值的花卉资
源，由于尚未得到大多研究者的重视，致使美丽、幽
香的姜花属花卉仍大都野生于丛林深处。姜花属植
物的花期大都集中在夏秋季，有的种则在春节前后
开花，前者弥补了夏秋季香型切花缺乏的现状，后者
则为我国传统节日增加了喜庆。所以开展姜花属引
种、育种工作对丰富我国香型切花种类具有重要
意义。
为加快姜花属育种速度、提高育种水平，有必要
将分子标记技术引人到姜花属育种工作中来。由于
这方面的工作尚未开展，选择没有物种特异性的分
子标记是可行的。SRAP标记与 RAPD相似，没有
物种特异性，操作较简单，却有更好的重复性，是用
来研究基因组未知的物种的理想手段；而且同一反
应体系可在不同属间应用，因此该标记也是进行分
类学研究的理想标记。
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