全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：269— 273 2010年 3月
半制备高效液相色谱制备 5种苯乙醇苷类单体
陈文娟 2，李典鹏1，陈月圆1，黄永林1，文永新1*
(1． 篝 毳广西植物研究所，广西桂林54106；2．广西师范大学生命科学学院，广西桂林54104)
摘 要 ：利用 MCI柱层析和半制备型反相高效液相色谱法从牛耳朵中分离制备了 5种苯乙醇苷类单体 。在
Eclipse XDB—C18(9．4 mm×250 mm，5 m)半制备柱上，以甲醇一水为流动相，流速为 4 mL／min，采用梯度洗
脱方式 ，制备得到 5个组分 。经波谱(El-MS、1H—NMR、13C-NMR)分析 ，分别鉴定为 plantainoside(1)、chirito—
side C(2)、plantaninoside B(3)、plantamajoside(4)和 desrhamnosylverbascoside(5)。高效液相色谱分析表明
所制备 5种化合物纯度均高于 98 。该方法分离条件简单 ，高效 ，一次可得到 5个单体，目标产物纯度较高。
关键词 ：半制备高效液相色谱 ；牛耳朵 ；苯乙醇苷类
中图分类号 ：Q946 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2010)02—0269—05
Preparation of five phenylethanoid glycoside
components by semiI。preparative HPLC
CHEN Wen-JuanI一，LI Dian-PengI，CHEN Yue_YuanI，
HUANG Yong-Lin ．WEN Yong-Xin
(1．Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chi~se Academy of Sciences，
Guilin 541006，China；2．College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China)
Abstract：A method was established for the isolation and preparation of five phenylethanoid glycoside components from
ChiHta eburnea using MCI column chromatography and semi-preparative HPLC．A semi-preparative Eclipse XDB-C18
(9．4 mm~250 mm，5 m)was used in the preparation process．By gradient elution with methanol—water as the mobile
phase at a flow rate of 4 mL／min，five phenylethanoid glycoside components were obtained from Chirita eburnea，and on
the basis of spectral data(EI-MS，1 H-NMR，¨ (2-NMR)，these compounds were identified as plantainoside(1)，chiritoside
C(2)，plantaninoside B(3)，plantam~oside(4)and desrhamnosylverbascoside(5)，and the purities of these five phenyle-
thanoid glycoside components analyzed by HPLC were all beyond of 98 ．The method is efficient，simple with high pur—
ification and got 5 components for one time．
Key words：semi-preparative HPLC；Chirita eburnea；phenylethanoid glycosides
牛耳朵(Chirita eburnea)为苦苣苔科唇柱苣苔
属植物 ，多年生草本 ，根粗壮 ；生于石山，丘陵或 山地
溪边 ，分布于广西 、广东 、湖南、湖北、四川及贵州等
地 。牛耳朵根茎或全草人药 ，性味甘、平 ，有清肺 、止
血 、止咳、除湿、解毒 、治肺结核等功用 ，广西民间广
泛用来治疗 肺结 核 、高血 压 等病 (江 苏新 医学 院 ，
1977；广西壮族 自治区中医药研究所 ，1986)。
药理研究表 明，苦苣苔科植物中苯 乙醇苷类化
合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗辐射、抗 氧化、抗肿
瘤、免疫调节 、增强记忆、保肝 、强心等作用(靖会等 ，
2006)。目前国内外对苯 乙醇苷类单体的分离、纯化
研究大部分还处于实验室研究阶段 ，多采用大孔吸
收稿日期 ：2009—09-22 修回日期：2009-12-16
基金项目：广西科学研究与技术开发计划应用基础研究专项 (桂科基 0832022)[Supported by the Special Fund for Application Basic of Scientific
Research and Technological Development Program of Guangxi(0832022)]
作者简介：陈文娟(1983一)，女 ，广西钦州人，硕士研究生，主要从事天然产物研究 ，(E—mail)wenzi502@163．corn。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E—mal：wyx@gxib．cn)
270 广 西 植 物 3O卷
附树脂、硅胶、sephadex LH-20、ODS柱层析等反复
分离才能得到纯 品(贺震旦等，1989；南海函等，
2008)，由于苯乙醇苷类化合物在固相色谱上几乎是
不可逆吸附的，故经过反复柱层析后，纯品的得率非
常低。有学者采用高速逆流的方法对苯乙醇苷类化
合物进行分离、纯化 ，得到相对较多的纯品(Lei等，
2001；Li等，2005，2008)，但鲜见有文献详细报道牛
耳朵中苯乙醇苷类单体的制备、半制备方法及条件。
为了进一步研究和开发牛耳朵的资源，确定其药理
活性成分，对牛耳朵的苯乙醇苷类化合物进行了深
入研究。
本实验利用半制备高效液相色谱的分离纯化技
术对牛耳朵中的苯乙醇苷类化合物进行了系统的研
究，从牛耳朵中制备分离出 5个化合物。经高分辨
电子轰击质谱(EI—MS)，核磁共振谱(NMR)等技术
的鉴定，制备分离得到的化合物均属于苯乙醇苷类
化合物，分别为：3，4一二羟基苯乙醇一3一()-咖啡酰基一
D-葡萄糖苷 (plantainoside)(1)，3，4一二羟基 苯乙
醇一6一O-葡萄糖咖啡酰基 I)-葡萄糖苷(chiritoside
C)(2)，3，4一二羟基苯乙醇一2～()_咖啡酰基一 D～葡萄
糖苷(plantaninoside B)(3)，3，4一二羟基苯乙醇一pD一
葡萄糖 (1—3)一4一()_咖啡酰基一 I)-葡萄糖苷(plan—
tamajoside)(4)，3，4一二羟基苯乙醇一4一()_咖啡酰基一
D．葡萄糖苷(desrhamnosylverbascoside)(5)。其
中化合物3首次从该科植物中分离得到，化合物 1，
2，4，5均为首次从该植物 中分离得到。
1 仪器与材料
1．1仪器
Agilentl100分析型高效液相色谱仪：包括二极
管阵列多波 长检测器 (DAD)、四元梯度泵 、在线真
空脱气机、7725i手动进样器、HP化学工作站(美国
Agilent公司)；Agilent1200半制备型高效液相色谱
仪：包括 VWD检测器、四元梯度泵、在线真空脱气
机、标准自动进样器(G1329A)、安捷伦化学工作站
(美国 Agilent公司)；核磁共振波谱仪：AMx一500
MHz(德国 BRUKER公司)，以四甲基硅烷(TMS)
为内标；质谱仪：ESQUIRE HCT (美 国 Bruker
Daltonics公司)；超纯水仪(Milipore公司)；R一3000
旋转蒸发仪(瑞士 Bachi公司)；蒸发光散 射检测器
(ELSD>20O0ES(格雷斯 中国有限公司)。
1．2试剂与材料
色谱甲醇、乙腈 (美国 FISHER公司)；超纯水
为自制；薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品；MCI
柱层析(日本 TOKYO公司)；常用溶剂均为分析纯
(西陇化工厂)；样品于2008年 7月采自广西桂林市
雁山镇，经广西植物研究所韦发南研究员鉴定为苦
苣苔科唇柱苣苔属植物牛耳朵(Chirita eburnea)。
2 实验方法
2．1牛耳朵中苯乙醇苷类化合物的提取分离
新鲜牛耳朵根茎 1O kg，室内阴干，用 75％乙醇
加热回流提取两次(每次 3 h)，减压浓缩，得浸膏 A
700 g。用适量的水溶解浸膏 A，依次用石油醚、乙
酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩正丁醇萃取液得浸膏 B
200 g。取正丁醇部位浸膏 B 20 g进行 MCI柱层
析 ，依 次 用 1O 、2O％、3O％、4O 、50％、6O 和
100 9，6 MeOH梯度洗脱，经 TLC薄层色谱分析，合
并 3O 、4O MeOH洗脱部分，得浸膏 C 3 g。将
浸膏 C用甲醇溶解至其质量浓度为 400 mg／mL，采
用 0．45 m的微孑L滤膜过滤到自动进样瓶中，进行
半制备型高压液相色谱分离，分别收集 1—5组分，如
图 l所示。1-5组分经减压浓缩，真空干燥后，得化
合物 1(81．8 mg)，化合物 2(65．9 mg)，化合物 3
(90．4 mg)，化合物 4(88．2 mg)，化合物 5(95．8
rag)(化合物 1—5对应为组分 1—5)。
2．2色谱条件
分析型 色谱柱 ：Eclipse XDB—C18(4．6 mm×
150 mm，5 m)；柱温 ：30℃ ；检测波长 ：218 nm；流
速：0．8 mL／min；流动相：乙腈一水(17：83，V：V)；
进样量 ：10 L；进样方式为手动进样 ，液相专用平头
针定量。
半制备色谱条件：半制备型色谱柱：Eclipse
XDB—C18(9．4 mm×250 mm，5 m)；柱温：38℃；
检测波长：218 nm；流速：4 mL／min；流动相：甲醇
(A相)一水(B相)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～5
rain，25 ～ 26 A ；5～ 10 min，26 A ；10～ 14
min，26 ～27 A；14～25 rain，27％～28 A。
进样量：16 mg；分析时间：26 min；进样方式：Agi—
lent标准 自动进样器(G1329A)自动进样；样品环
(100 L)定量；收集方式：手动收集。
蒸发光散射色谱条件：Eclipse XDB-C18(4．6 rnlTl
×150 mm，5 m)；流动相 ：乙腈一水(17：83，V：V)；
2期 陈文娟等：半制备高效液相色谱制备 5种苯乙醇苷类单体 271
图 1 样品的半制备 HPLC色谱图
Fig．1 Semi—preparative HPLC chromatograms of sample
图 2 5种苯乙醇苷类化合物的分析型 HPLC色谱图
Fig．2 Analytical HPLC chromatograms of five
phenylethanoid glycoside components
流速 ：0．8 mL／min；柱温 ：30℃；ELSD漂移管温度 ：
100℃；空气流速 ：2．7 L／min。
3 结果与讨论
3．1 HPLC法对制备的样 品进行纯度测定
按分析型的色谱条件，分别把 1—5组分溶液注
入分析型 HPLC中检测，得到 l一5组分色谱图，均为
单一色谱峰 ，如图 2所示 ，化合物 1-5的保 留时间分
别为 ：化合物 l(4．810 min)，化合物 2(5．707 min)，
化合物 3(7．705 min)，化合物 4(7．970 rain)，化合
物 5(9．921 rain)。通过采用面积归一化 法计算 1—5
组分的纯度，其纯度均高于 98 。为了进一步验证
1—5组分的纯度，分别把 1-5组分溶液注入连接有
ELSD 2000ES(蒸 发 光 散 射 检 测 器 )的 分 析 型
HPLC中检测，得到 l一5组分色谱图也均为单一色
谱峰(图 3)。通过面积归一化法计算 1—5组分 的纯
度均高于 99．0 ，故确定利用半制备色谱法制备的
1-5组分均为纯品。
3．2结构鉴 定
化合物 1 黄白色无定形粉末，具吸湿性，易溶
2 广 4
j
5
8
¨
』
图 3 5种苯乙醇苷类化合物的蒸发光散色检测色谱图
Fig．3 Evaporative light scattering detection
chromatograms of five phenyl ethanoid
glycoside components
于甲醇。遇 FeC1。一K。[Fe(CN)。]试剂显蓝色，示为
酚性物质。El—MS m／z：479[M+H] 。 H—NMR
(CD30D，500MHz)和”CNMR(CD3OD，125MHz)
数据与 Miyase等 (1991)报道 的 plantainoside A数
据一致 。故鉴定该化合物为 ：3，4-二羟基苯乙醇一3一
()_咖啡酰基一 D一葡萄糖苷(plantainoside A)。
化合物 2 黄白色无定形粉末 ，具吸湿性 ，易溶
于甲醇。遇 FeC1 一K。[Fe(CN)。]试剂显蓝色，示为
酚性物质。ESI—MS m／z：641：M+HI一。 H—NMR
(CD 0D，500 MHz)和¨CNMR(CD OD，125MHz)
数据与 Damtoft等(1994)报道 的 chiritoside C数据
一 致 。故鉴定该化合物为 ：3，4一二羟基苯 乙醇一6一O-
葡萄糖咖啡酰基一 D一葡萄糖苷(chiritoside C)。
化合物3 黄白色无定形粉末，具吸湿性，易溶
272 广 西 植 物 3O卷
于甲醇。遇 FeC1 一K EFe(CN)。]试剂显蓝色，示为
酚性物质。ESI—MS m／z：479 EM+H] 。 H—NMR
(CD 0D，500 MHz)和¨CNMR(CD3OD，125MHz)
数据与Miyase等(1991)报道的 plantaninoside B数
据一致。故鉴定该化合物为：3，4一二羟基苯乙醇一2一
()-咖啡酰基一 D一葡萄糖苷(plantaninoside B)。
化合物 4 黄 白色无定形粉末 ，具 吸湿性，易溶
于甲醇。遇 FeC1。一K [-Fe(CN) ]试剂显蓝色，示为
酚性物质。ESI—MS ／2：641[M+H] 。 H—NMR
(CD OD，500 MHz)和¨CNMR(CD3 OD，l25MHz)
数据与 Henrik等 (1998)报道 的 plantamajoside数
据一致，故鉴定该化合物为 ：3，4一二羟基苯 乙醇一 D一
葡萄糖(1—3)-4一O-咖啡酰基一 【)．葡萄糖苷(plan—
tamajoside)。
化合物 5 黄 白色无定形粉末 ，具 吸湿性 ，易溶
于甲醇。遇 FeCI 一K EFe(cN) ]试剂显蓝色，示为
酚性物质。ESI—MS ／2：479 EM+H] 。 H—NMR
(CD OD，500 MHz)和¨CNMR(CD OD，125MHz)
数据与 Shimomura等(1987)报道的 desrhamnosyi—
verbascoside数据一致。故鉴定该化合物为：3，4～二
羟基苯乙醇一4一()_咖啡酰基一卢一D一葡萄糖苷(desrham—
nosy1verbascoside)。
3．3半制备色谱条件的建立
本实验选用乙腈一水和 甲醇一水作为流动相进行
分离制备，结果表明，两种流动相的分离效果相似。
从研究成本方面考虑，本文采用 甲醇一水系统作为流
动相进行制备，采用乙腈一水系统进行分析。
流动相确立后，本实验考察了 2、3、4 mL／min
的流速对 l一5组分分离效果 的影响(图 4)。结果表
明，低流速时，样品分离度较好 ，但 出峰时间推迟 ，分
离时间较长(流速为 2 mL／min时需要 50 rain才完
成一个洗脱单元)，且峰形变宽；流速加大，分离时间
缩短，但样品与杂质分离度下降。在保证一定的分
离度的情况下，流速的加大能缩短分离时间，故经综
合考虑本文采用 4 mL／min的流速。
在流速为 4 mL／min时分别考察进样量 4、8、12、
l6、20 mg的分离效果 。结果表 明，进样量在 4～16
mg范围内变化，对保留时间影响不大，但随着进样
量的增加，谱峰逐渐变宽，分辨率逐渐降低，分离度
减小，尤其对化合物 4和 5分离效果影响最大，当进
样量增至 20 mg后，谱峰展宽和拖尾现象严重，色
谱分辨率和分离效果急剧下降，说明进样量已超出
等温吸附的线性范围，因此进样量选择为 16 mg。
图 4 不同流速对 5种苯乙醇苷类化合物的分离色谱图
Fig．4 Isolation chromatograms of five phenylethanoid
glycoside components by different flow rates
在流速为 4 mL／min、进样 量为 16 mg时进行
洗脱条件的考察。本实验先考察 20 、25 、3O％、
4O 甲醇恒比例的流动相对 1—5组分的分离情况。
结果表 明 ，2O MeOH 恒 比例 的 流动相 洗脱 3O
min尚不能把 1-5组分洗脱下来 ；25 MeOH 恒比
例开始 10 rain分离效果很好 ，能把前面的杂质与 1
组分拉开2 min左右，但 1～5组分出峰时间很慢，峰
形也不对称 ，故 25 MeOH 恒 比例也不能用于制
备；3O MeOH恒比例的流动相对 1-5组分分离效
果不理想，1、2组分汇合成一个峰，3、4、5组分连在
一 起，之间没有 间隔 ，证 明 3O 9／6 MeOH 的极性 大
了。4O MeOH恒比例 的流动相在 8 rain内就把
所有物质冲下来，1-5组分完全没有分离开。故本
实验采用梯度洗脱，根据试验的几个恒比例，确定初
始比例为 25 MeOH，梯度在 3O MeOH以内缓
慢变化 ，梯度条件如前 2．1所述。
4 结论
粗提物经 MCI柱层析预处理富集苯乙醇苷类
混合物，降低了半制备高效液相色谱的分离难度，简
化了分离条件和提高了分离效能。本实验通过
MCI柱层析的前期 处理 ，在 Eclipse XDB-C18(9．4
2期 陈文娟等：半制备高效液相色谱制备 5种苯乙醇苷类单体 273
mm×250 mm，5 m)半制备色谱柱上，以甲醇一水为
流动相，流速为 4 mL／min，采用梯度洗脱方式，在
较短的时间内(26 min)一次可从牛耳朵中制备分离
得到5种苯乙醇苷类单体，高效液相色谱分析表明
所制备的 5种化合物 的纯度均 高于 98 。该方法
具有操作方便、高效、经济的特点，制备的 5种苯乙
醇苷类单体均可作为对照品。
参考文献 ：
广西壮族自治区中医药研究所．1986．广西药用植物名录I-M]．
南宁：广西人民出版社
江苏新医学院．1977．中药大辞典[ ．上海：上海人民出版社
Damtoft S，Jensen SR． 1994．ThFee phenyIethanoid glucosides of
unusual structure from Chirita sinensis(Gesneriaceae)l,J-I．Phy—
tochemistry，37(2)：441—443
He ZD(贺震旦)，Yang CR(杨崇仁)．1989．The advances of pheny—
lpropanoid glycosides in plants(植物中苯丙素甙类成分的研究进
展)[J]．Nat Prod Res Develop(天然产物与开发)，2：29～41
Henrik F。Tommy LH，S0~ren Rj．1998．A caffeoyl phenylethanoid
glycoside from Plantago myosuros[J]．Phytochemistry，47(6)：
l 161— 1 l62
Jing H(靖会)，Zuo JF(佐建锋)，Li JS(李教社)．2006．The ad—
vances in study on pharmacological of phenylpropanoid glycosides
(苯乙醇苷类化合物的药理研究进展)I-J]．LishizhenMedicine
Materia Medica Res(时珍国医国药)，17(3)：440-441
Lei L，Yang FQ。Zhang TY，et a1．2001．Preparative isolation and
purification of acteoside and 2’一acetylacteoside from Cistanches
salsa(C．A．Mey)G．Beck by counter current chromatography
rJ]．J Chromatography A，912：181—185
Li L，Tsao R，Liu ZQ，et a1．2005．Isolation and purification of
acteoside and isoacteoside from Plantago psylium by high-
speed counter-current chromatographyl,J]．J Chromatogra—
phy A，1 063：161— 1 69
Li L，Isao R，Yang R，et a1． 2008． Isolation and purification of
phenylethanoid glycosides from Cistanche deserticola by high-
speed counter-current chromatography[J]． Chemistry，
108 702— 710
Miyase T，Ishino M ，Akahori C，et a1．1991．Phenylethanoid glycosides
from Plantago n n￡ [J]．Phytochemistry，30(6)：2 O15—2 018
Nan HH(南海 函)，Yin H(尹浩)，Zhang x(张佩)．2008．Pheny—
lethanoid glycosides from Clerodendrum inerme(许树 中苯乙醇
苷类化合物 的研究)[J]．Nut Product Res Develop(天然产物
与开发)，20：l 008一l O11
Shimomura H ，Sashida Y。Ogawa K．1 987． Iridoid glucosides and
phenylethanoid glycosides in Ajuga species of Japan[J]．Phyto—
chemistry，26(7)：1 981—1 983
0 ●0 ●0 ●o ●0 ●<> ●o ●o ●o ●0 ●0 ●<> ●0 ●o ●o ●o ●o ●o ●< >●o ●( >●0 ●0 ●o ●0 ●0 ● o ●< >●o ●o ●o ●0 ●0 ●<> ●<> ●0 ●0 ●0 ●0 ●0 ●0 ●0 ●o ●o ●o ●o ●o ●0 ● 0 ●
(上接第 260页 Continue from page 260)
及始花节位的基因定位[J]．自然科学进展 ，15(2)：167—172
Budak H ，Shearman RC，Gaussoin RE，et a1．2004．Application of
sequence-related amplified polymorphism markers for character—
ization of Turfgrass species[J]．HortSci，39：955—958
Chen JL(陈京荔)，Huang LQ(黄璐琦)，Shao AJ(邵爱娟)，et a1．
2002．RAPD analysis on diferent varieties of Rehmannia gluti—
nosa(地黄不同品种的 RAPD分析)[J]．Chink J Chin Mat
Med(中国中药杂志)，27(7)：505—507
Fan HH(樊洪泓)，Li TC(李廷春)，Qiu J(邱婧 )，etal，2008．Stu—
dius on genetic deversity of medicinal Dendrobium by SRAP(药
用石斛遗传多样性的 SRAP标记研究)[J]．China J Chin Mat
Med(中国中药杂志)，339(1)：6—10
Li G，Quiros CF．2001．Sequence-related amplified polymorphism
(SRAP)，a new marker system based on asimple PCR reaction：
its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]．
TheoreticalApplied Genetics，103：455—46l
Ren Y(任羽)，Wang DY(王得 元)，Zhang YD(张银 东)，et a1．
2004 Optimization of SRK —PCR in hot pepper(Capsicum ann-
UUZ~)(辣椒 SRAP-PCR反应体系的建立与优化)[J]．Molecu—
lar Plant Breeding(分子植物育种)，2(5)：689—693
Wu ZP(武 志朴 )，Yang WX(杨 文香)，Liu DO(刘大 群)，et a1．
2005．Establishment of SRAP techmque system in wheat ge—
nome(d,麦基因组 SRAP扩增体 系的初步研究)[J]．J Agric
Univ Hebei(河北农业大学学报)，28(3)：665—669
Xu XY(许晓燕)，Yu MY(余 梦瑶)，Luo X(罗 霞)，et a1．2008．
Molecular diversity of Auricularia polytricha revealed by
and SRAP(利用 AFLP和 SRAP标记分析 19株毛木耳的遗传
多样性)[J]．Southwest China J Agric Sci(西南农业学报)，21
(1)：121— 124
Xu Q(徐 晴 )，Zhang GH(张桂 华 )，Han YK(韩 毅 科)，et a1．
2008．Construction and analysis of the molecular genetic linkage
map for cucumber(黄瓜远缘群体分子遗传连锁图谱的构建和
分析)l-j]．Agric Boreal Sin(华北农学报)，23(1)：45-49
Zhou JY(周俊英)．2002．Chromosome studies of Rehmanniaglu—
tinosa of traditional Chinese medicine(中药地黄的染色体研究)
[J]．ShandongSci(山东科学)，15(1)：2O一22
Zhou YQ(周延清)，Jing JZ(景建 洲)，Li ZY(李 振勇)，et a1．
2004a．Assessment of genetic diversity of Rehmannia glutinosa
germplasm detected by RAPDS and ISSRS(利用 RAPD和 IS-
SR分子标记分析 地 黄种质遗 传 多样性)[J]．Hereditas(遗
传)，26(6)：922—928
Zhou YQ(周 延清 )，Jing JZ(景 建 洲)，Li ZY(李振 勇)，et a1．
2004b．Optimization of ISSR—PCR amplification in Huai Rah—
mannia glutinosa(怀地黄 ISSR扩增条件优化的研究)l-J]．Ac—
ta Bot Boreal-Occident Sin(西北植物学报)，24(1)：6一ll
Zhou YQ(周延 清 )，Jing JZ(景 建 洲)，Li ZY(李 振 勇)，et a1．
2005．ISSR identification of genetic diversity of Rehmannia glu—
tinosa in Huai zone(怀区地黄遗传多样性的ISSR鉴定)[J]．
C in Trad Herb Drugs(中草药)，36(2)：257—261