全 文 ： 制剂与炮制
收稿日期:2008-06-22;　修订日期:2008-11-20
基金项目:贵州省科技厅基金项目(No.黔科合 J字 [ 2005] 2068号)
作者简介:白　雪(1983-),女(汉族),云南玉溪人 ,现为贵阳医学院在读
硕士研究生 ,主要从事天然产物成分分析及质量标准研究工作.
＊通讯作者简介:郝小燕(1955-), 女(满族),贵州贵阳人 , 现任贵阳医学
院教授 ,学士学位 ,主要从事天然产物成分分析和中药制剂制备工艺及质
量标准研究工作.
延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定
白　雪 , 肖海涛 , 杨　杰 , 朱　洁 , 郝小燕＊
(贵阳医学院 ,贵州 贵阳　550004)
摘要:目的 研究延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定方法。方法 运用半制备高效液相色谱法分离纯化紫堇碱 ,
采用薄层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度 ,波谱法鉴定其结构 ,反相高效液相色谱法测定延胡索药材中紫
堇碱的含量。结果 制备的化合物鉴定为紫堇碱 , 纯度为 99.5%;含量测定在 0.131 2 ～ 1.131 2μg范围内呈良好线性关
系 , r= 0.999 997,平均回收率为 97.19%, RSD为 2.25%(n=9)。结论 该制备方法效率高 , 所得化合物纯度高 ,可用
于大量制备;含量测定方法准确 , 简便 ,可靠 , 重复性好。
关键词:紫堇碱;　半制备高效液相色谱法;　反相高效液相色谱法
中图分类号:R284.2;R283　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)02-0374-02
PreparationandQuantitativeAnalysisofCorydalineStandardSampleinCorydalisyan-
husuoW.T.Wang
BAIXue, XIAOHai-tao, YANGJie, ZHUJie, HAOXiao-yan＊
(GuiyangMedicalUniversity, Guiyang550004, China)
Abstract:ObjectiveTostudyapreparationanddeterminationmethodofcorydalineinCorydalisyanhusuoW.T.Wang.
MethodsThecorydalinewasseparatedandpurifiedbysemi-preparativehighperformanceliquidchromatograph.Itspuritywas
determinedbyTLCandHPLCanalysisandnormalizationofpeakareas.Thestructureofcorydalinewasidentifiedbyspectrum,
andthequantificationwasdeterminedbyRP-HPLC.ResultsThecompoundwasidentifiedascorydaline.Thepurityoftheco-
rydaliswas99.5%.Therewasagoodlinearitywithintherangeof0.131 2 ～ 1.131 2μg(r=0.999 997).Theaveragerecovery
was97.19%(RSD=2.25%, n=9).ConclusionThispreparationmethodisquickandconvenientforproducingthepurecom-
poundsfromherbswithlargecapacity.Themethodisaccurateandsimplewithgoodreproducibility, anditcancontrolthequality
ofthisherbandpreparationefectively.
Keywords:Corydaline;　Semi-preparativehighperformanceliquidchromatograph;　RP-HPLC
　　延胡索 CorydalisyanhusuoW.T.Wang.为罂粟科植物延胡
索的干燥块茎 , 具有活血化淤 、理气止痛的功效 ,是我国传统常用
中药。延胡索中主要含生物碱 , 其中延胡索乙素和丑素是延胡索
镇痛的主要活性成分 [ 1] , 2005年版《中国药典 》及成方制剂中均
采用延胡索乙素为对照品进行评价 [ 2 ～ 4] 。本课题组研究发现 ,延
胡索生物总碱具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶的作用 ,其中紫堇碱
是主要活性成分之一 ,因此 , 有必要对延胡索中紫堇碱进行定性
鉴别和含量测定。但是 , 目前市场上还没有紫堇碱对照品的销
售 , 并且也未见采用紫堇碱为对照品来评价延胡索质量的报道。
本文报道延胡索中紫堇碱对照品的制备方法和含量测定方法。
1　仪器与材料
X-4型显微熔点仪(国产 ,温度计未校正);INOVA-400型
核磁共振仪 (TMS为内标);KQ-250B型超声波清洗仪(昆山
市超声仪器有限公司);高效薄层层析板(GF254 , 青岛海洋化工厂
生产);甲醇 、乙睛为色谱醇 , 其他化学试剂均为分析醇 , 水为纯
净水。
延胡索药材采自浙江省东阳市 ,经贵阳中医学院陈德媛教授
鉴定为罂粟科植物延胡索 CorydalisyanhusuoW.T.Wang.的干
燥块茎。
2　方法与结果
2.1　紫堇碱粗提物的制备 延胡索块茎粗粉 5 kg,用 30倍量的
70%乙醇 40 ℃超声提取 1h,滤过 , 滤液减压回收溶剂 , 得乙醇提
取浸膏 。乙醇提取浸膏加入 1%的盐酸溶液溶解 , 滤过。滤液用
浓氨水调 pH9 ～ 10,用乙醚反复萃取 , 合并萃取液 , 减压低温回
收溶剂 ,得紫堇碱粗提物。
2.2　色谱条件
2.2.1　制备的HPLC色谱条件 XTerraPrepRP-18柱(10μm,
150 mm ×7.8 mm);柱温为室温;检测波长 280nm;流动相为甲
醇 -0.03 mol/L的磷酸二氢钠(61∶39);流速 3.00ml/min。
2.2.2　分析的 HPLC色谱条件 DiamonsilTM C18柱 (5 μm,
250 mm×4.6 mm),柱温 30 ℃;检测波长 280 nm,流动相为 0.10
%的磷酸 (三乙胺调 pH = 6.0) -乙睛 (48∶ 52), 流
速 1.00 ml/min。
2.2.3　紫堇碱对照品的制备纯化 取紫堇碱粗提物 1.0 g, 用
10 ml甲醇超声溶解 ,过 0.45μm滤膜 , 备用。吸取 1.0ml样品进
半制备型高效液相色谱仪 , 收集保留时间所在的组分 , 减压回收
溶剂 , 得紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解 , 重结晶 ,即得。
2.3　纯度分析
2.3.1　薄层色谱分析 薄层板:高效薄层层析板(GF254)。 3种
展开剂系统:正丁醇 -乙酸 -水(10∶1∶0.5);醋酸乙酯 -氯仿
-甲醇 -二乙胺(8∶2∶2∶ 1);乙醚 -环己烷 -甲醇(5∶3∶
0.5)。点样:在同一板上 , 按 20, 40, 60, 80, 100 μl不同的浓度点
样。展距 8 cm, 定位后经紫外 254nm、碘蒸气及碘化铋钾溶液显
色检视 。结果在薄层色谱同一位置处 , 均为单一斑点 , 未见杂质
斑点 , 符合化学品要求。
2.3.2　紫外检测 取紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描 ,
结果表明最大吸收波长为 280 nm, 因此 , 确定 280 nm为测定
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.2　
波长。
2.3.3　面积归一化法 精密称取紫堇碱对照品 , 用流动相制成
浓度为 0.13 mg· ml-1的样品溶液 , 按照 “分析 HPLC色谱条
件” ,进样 10 μl,样品显示为单峰 , 用面积归一化法计算含量为
99.5%(保留时间为 12.15 min), 符合中药化学对照品含量测定
用要求。结果见图 1。
2.4　结构鉴定 紫堇碱为无色棱状柱晶(乙醇), 熔点 135℃。1H
NMR(400MHz, CDCl3)δ:0.95 (3H, d, J= 6.8 Hz, CH3),
2.60 (2H, m, 5-H), 3.10 (2H, m, 6-H), 3.22(1H, m, 13
-H), 3.50 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8α), 3.69 (1H, s, 14-
H), 3.87 (12H, m, 4-OCH3), 4.20 (1H, d, J=16.0Hz, 8-Hβ), 6.61(1H, s, 4-H), 6.69 (1H, s, 1-H), 6.82 (1H,
d, J= 8.4 Hz, 11-H), 6.91 (1H, d, J= 8.4 Hz, 12 -H).
13CNMR(100 MHz, CDCl3)δ:18.3 (-CH3), 29.2 (C-5),
38.2 (C-13), 51.3 (C-6), 54.4 (C-8), 55.7 (OCH3),
55.8 (OCH3), 56.0 (OCH3), 60.0 (OCH3), 62.9 (C-14),
108.5(C-1), 110.8 (C-4), 111.0(C-4), 124.0 (C-12),
128.5, 128.4, 128.2 (C-4a, -14a, -8a), 134.8 (C-12a),
144.7(C-10), 147.0(C-2), 147.5 (C-3), 150.0(C-9)。
以上波谱数据与文献报道 [ 5]的一致 , 故鉴定为紫堇碱。
2.5　延胡索中紫堇碱的含量测定
2.5.1　色谱条件与系统适应性实验 照 “分析 HPLC色谱条
件” ,样品的理论塔板数均大于 10 000, 分离度均大于 4.0。结果
见图 2。
2.5.2　供试品的制备 取延胡索粗粉约 1 g, 精密称定 , 至 50ml
具塞三角瓶中 ,加入 70%的乙醇 30.00ml,称重 , 40℃超声提取 1
h,取出 ,补足减失重量 , 冷却 , 滤过 , 取续滤液 10.00 ml, 回收乙
醇 , 流动相定容至 10.00ml, 过 0.45μm滤膜 , 备用。
2.5.3　线性范围考察 精密称取紫堇碱对照品 0.016 4 g于 50
ml容量瓶中 , 用流动相定容 , 得对照品储备液。取 5.00 ml对照
品储备液于 25 ml容量瓶中 , 用流动相定容 , 得质量浓度为 65.6
μg· ml-1的对照品标准溶液。分别精密吸取对照品标准溶液 2,
4, 8, 12, 16, 20μl注入色谱仪 , 记录峰面积。 以色谱峰面积为纵
坐标 (Y), 紫堇碱的进样量为横坐标 (X), 绘制标准曲线 , 得回
归方程:Y= 942.131 6X+0.293 7, r=0.999 997, 样品在 0.131
2 ～ 1.131 2 μg范围内线性关系良好。
2.5.4　精密度实验 精密吸取同一对照品标准溶液 8 μl, 照前
述色谱条件重复进样 6次 , 测得紫堇碱峰面积的 RSD为 0.25%,
表明测定仪器精密度良好。
2.5.5　稳定性实验 将同一份供试品溶液放置 0, 2, 4, 8h后 , 照
前述色谱条件进样 20 μl,测得紫堇碱在 8 h内峰面积的 RSD为
0.21%,表明供试品溶液在 8h内稳定性良好。
2.5.6　重复性实验 取同一批样品 , 按 “ 2.5.2”项下方法 , 平行
制备供试品溶液 6份 , 按前述色谱条件进样 20 μl,测得延胡索中
紫堇碱含量平均值为 0.977 8 mg· g-1 , RSD为 0.41 %, 表明测
定方法重复性良好。
2.5.7　回收率实验 取已知含量的样品约 0.5 g, 共 9份 , 精密
称定 , 分别加入不同量的紫堇碱对照品 , 按 “ 2.5.2”项下方法制
备 , 按前述色谱条件进样 20 μl, 测得紫堇碱的平均回收率为
97.19%, RSD为 2.25%(n=9), 表明测定方法准确可靠。结果
见表 1。
表 1　回收率实验
编号 取样量m/g
样品中含紫
堇碱量 m/mg
紫堇碱
加入量 m/mg
实测
含量 m/mg
回收率
(%)
平均
回收率(%)
RSD
(%)
1 0.501 1 0.490 0 0.420 0 0.906 8 99.24
2 0.504 0 0.492 8 0.518 0 0.992 9 96.55
3 0.505 2 0.494 0 0.616 0 1.085 3 96.99
4 0.502 6 0.491 4 0.420 0 0.894 6 96.00
5 0.504 2 0.493 0 0.518 0 1.003 7 98.58 97.19 2.25
6 0.504 2 0.493 0 0.616 0 1.108 1 99.86
7 0.502 8 0.491 6 0.420 0 0.898 9 96.98
8 0.504 9 0.493 7 0.518 0 0.999 4 97.62
9 0.504 5 0.493 3 0.616 0 1.063 3 92.53
　　n= 9
图 1对照品的色谱图 　　　　图 2样品的色谱图
3　讨论
延胡索生物碱类大部分属于小檗碱或原小檗碱型 ,它们性质
相差较小 , 极性相近 ,利用常规的分离方法很难得到高纯度的单
体 , 而高效液相色谱具有柱效高 、操作简单 、分离出来的化学单体
纯度高的特点。我们在利用常规的分离方法制备高纯度的紫堇
碱效率较低的情况下 , 尝试用半制备高效液相来制备紫堇碱单
体 , 结果发现效率高 ,成本低 , 适合紫堇碱对照品的大量制备。
延胡索总生物碱在酸水或乙醇中有较好的溶解性能 , 对于其
总生物碱的提取方法 , 文献报道以回流法为多 [ 6] ,但此法整个工
艺耗时较长 , 提取率较低。另有文献报道 , 以氨 -乙醚为溶剂 ,采
用超声 、冷浸 、回流 3种方法提取延胡索 ,结果表明超声提取方法
含量高 ,操作简便。本实验中 , 紫堇碱的含量测定采用 30倍量
70%的乙醇 40 ℃超声提取 1 h, 在确定的色谱条件下 , 分离度已
达到要求。而在制备色谱中 ,采用乙醚进一步萃取纯化 , 提高了
制备效率。
参考文献:
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