全 文 ：　1996-04-18　收稿
　第一作者简介:何若天 ,男 , 1935年出生 ,教授,从事植物生理学和植物细胞工程研究工作。
＊国家自然科学基金资助课题
广西植物 Guihaia　17(1):89—93　1997
甘蔗和烟草幼叶原生质体的核酸含量
与核酸酶活性及其影响因素＊
何若天　覃　伟
(广西农业大学实验中心 , 南宁 530005)
摘　要　与幼叶组织相比 ,酶法新鲜分离的甘蔗和烟草幼叶原生质体内的 RNA、DNA及总核酸含量均
降低。其原因可能是刚游离的原生质体内酸性和碱性 RNA 酶与 DNA 酶等活性提高所致。甘蔗叶原生
质体内的核酸降低量和 RNA 酶与 DNA酶活性的增加程度均高于烟草。
随用作渗透压稳定剂的甘露醇浓度增加 ,甘蔗和烟草叶原生质体的 RNA 酶和 DNA 酶活性均相应
提高 。其中以甘蔗叶原生质体的核酸酶活性增加水平较明显。在细胞壁降解产物的作用下 , 除了甘蔗
原生质体内的 RNA 酶活性略被促进外 , 其 DNA 酶和烟草叶原生质体内的核酸酶均不受影响。
关键词　核酸含量;RNA酶;DNA 酶;原生质体;甘蔗;烟草
NUCLEIC ACID CONTENT AND NUCLEASE ACTIVITY
IN YOUNG LEAF AND ITS PROTOPLAST OF
SUGARCANE AND TOBACCO
He Ruotian　Qin Wei
(Research Centre , Guang xi Agricultural U niversity , Nanning 530005)
Abstract　As compared with the tissue of y oung leaf , the contents of RNA , DNA and total nucleic acid in
freshly isolated pro toplasts from sugarcane(Saccharum of ficinarum L.)and tobacco (Nicotiana tabacum
L.)young leaves by using cell w all degrading enzymes w ere all decreased , resulting probably from the obvi-
ously increased activities of RNAase and DNAase in pro toplast of both species.The level o f nucleic acid de-
creased and activities o f both nucleases increased are markedly greater in sugarcane leaf protoplast than in to-
bacco one.
The activities of both nucleases in leaf protoplasts of both species are cor respondingly increased with an in-
crease of the concentration of mannitol used as osmoticum , and the level of activities o f both nucleases in-
creased are g reater in sugarcane leaf protoplast than in tobacco one in that case.Except that the activity of
RNAase in sugarcan leaf pro toplast was promoted , the activity of DNAase in it and the activities of bo th nu-
cleases in tobacco leaf protoplast w ere not influenced by the cell wall deg radation products.
Key words　Nucleic acid content;RNAase;DNAase;pro toplast;sugarcane;tobacco
　　用细胞壁降解酶分离甘蔗和烟草等幼叶原生质体的过程中 ,细胞内超氧自由基(O -2·)、膜脂过
氧化产物丙二醛等不断增加 ,说明其膜系受到损害〔1〕;甘蔗幼叶细胞的呼吸活力亦受到影响 ,并发
现细胞壁降解产物(CWDP)是导致呼吸活力下降的主要因素〔2〕 。本文仅就酶解分离原生质体对细
胞核酸含量 、核酸酶活性及其某些影响因素作了比较研究。
1　材料与方法
1.1　材料与原生质体分离
取栽培甘蔗(Saccharum of f icinarum ,粤糖 57/423)、野生蔗斑茅(S .arundinaceum Retz)
距茎尖约 6 cm 内呈卷筒状的2 ～ 3片浅黄色幼叶和烟草(Nicot iana tabacum NC89)全伸展幼叶 。
均纵切为两等份 。其中一份作为原供体组织 ,另一份供原生质体分离用。
分离原生质体所用酶液为 1.5%纤维素酶(Onozuka R10)、0.5%果胶酶(Serva)和 0.5 mol/ L
(不同浓度处理试验则按指定浓度)甘露醇所组成(pH5.6)。甘蔗原生质体用漂浮法纯化 ,烟草原
生质体用离心—洗涤法纯化。
1.2　测定方法
1.2.1　核酸含量　DNA 、RNA和总核酸含量按朱治平法〔3〕测定。
1.2.2　RNA 酶和 DNA 酶提取与活性　RNA 酶的提取按 Kaur-Sawhney 等法〔4〕稍加修
改。分别将含有 2×106 ～ 4×106 个甘蔗叶原生质体/mL 和 1×106 ～ 2×106个烟草叶原生质体/
mL 的 0.5 mol/L 甘露醇悬浮液在 80×g下离心 10 min。在沉淀物中加入 4 mL 预冷的0.1 mol/ L
醋酸缓冲液(含 5%PVP ,pH6.0)。冰冻 1 h后 ,冰浴上匀浆 。12 000×g , 4 ℃下离心10 min。上清
液用作粗酶液。供体幼叶组织 RNA 酶按同法提取 。RNA 酶活性测定按 Arad 等法〔5〕稍加修改 。
反应系统为1 mL 2 mg/mL 的 RNA 、0.5 mL 酶液和 0.5 mL pH4.5或 7.5的 0.2 mol/L 醋酸缓冲
液。混匀后 ,吸取 0.5 mL混合液加 0.5 mL 含 0.75%醋酸双氧铀的 25%高氯酸 ,置冰箱中沉淀 。
余下反应液置 37 ℃水浴中保温 30 min后按上法处理。均于 12 000×g ,4 ℃下离心 10 min。分别
吸取 0.5 mL 上清液用重蒸馏水稀释至 2 mL。测 OD260值 。以每小时 OD260上升 0.1 为 1个酶活
性单位(U)。
DNA酶提取同 RNA 酶。反应系统中除含 0.5 mg/mL 的 DNA外 ,其余同 RNA酶的 。活性
测定按 Kunitz法〔6〕测 OD260值。以每小时 OD260上升 0.01为 1个酶活性单位(U)。以上各项测定
均重复 3次以上 。
1.2.3　CWDP　按前文〔2〕方法提制 。
1.2.4　酶蛋白含量　按 Bradfo rd法〔7〕测定 ,以 BSA 为标准蛋白 。
2　结果与讨论
2.1　核酸含量与核酸酶活性
90 广　西　植　物 17 卷　　
与甘蔗和烟草幼叶组织相比 ,它们经酶法新鲜分离的原生质体的核酸含量均明显降低(表 1)。
其中甘蔗和野生蔗叶原生质体的 RNA 含量分别约降低 21%和 49%,烟草叶原生质体的只减少
11%左右。甘蔗和野生蔗叶原生质体的 DNA含量均降低 16%左右 ,而烟草叶原生质体的约减少
10%。可见 ,栽培甘蔗和野生蔗叶原生质体的总核酸含量减少最多 ,烟草的降低最少 。再观其核
酸酶活性(表 2)可见 ,新鲜分离的甘蔗叶原生质体内酸性和碱性 RNA 酶活性分别为其供体组织的
6.7和 3.8倍;烟草叶原生质体的仅为其供体组织的 2倍左右 。甘蔗叶原生质体的酸性和碱性
DNA酶活性分别为其供体组织的 1.9和 8.2倍 ,烟草叶原生质体的则分别为其供体组织的 1.2和
1.1倍。据此 ,酶法分离的原生质体内 RNA 和 DNA 含量的减少 ,很可能与其 RNA 酶和 DNA酶
活性明显增强有关。
表 1　甘蔗和烟草幼叶及其原生质体的核酸含量
Table 1　T he nucleic acid content in young leaf and it s f reshly isolated protoplast s of sugarcane and tobacco
供试植物
Plant　　
　　含量C ontent(μg·g -1FW)
RNA DNA
总核酸
Total nucleic acid
甘蔗 Sugarcane 原生质体 Protoplast 339.64±19.9 69.21±1.8 408.85±12.6幼叶 Young leaf 375.72±12.7 82.77±0.7 458.49±12.9
斑茅 Reedlike Sw eetcane 原生质体 Protoplast 257.78±96.8 115.26±11.2 373.04±86.3幼叶 Young leaf 503.85±17.7 138.05±12.6 641.91±19.8
烟草 T obacco 原生质体 Protoplast 398.56±27.8 53.98±31.5 452.54±59.2幼叶 Young leaf 562.03±61.1 60.30±20.9 622.33±82.3
表 2　甘蔗和烟草幼叶及其原生质体核酸酶活性
Table 2　The nuclease activity in young leaf and its f resh ly isolated protoplasts of sugarcane and tobacco
反应系统
Reaction
system
pH
酶活性 Activity of enzyme(U.mg-1 protein)
甘蔗 Sugarcane
幼叶
Young leaf
　　　　原生质体
Protoplast
斑茅 Reedlike Sw eetcane
幼叶
Young leaf
　　　　原生质体
Protoplast
烟草 Tobacco
　 幼叶
Young leaf
　　　　原生质体
Protoplast
　
RNA ase
4.5 47.19±12.31 318.25±69.43 39.33±11.53 209.78±32.31 20.31±8.50 40.00±11.24
7.5 64.10±9.73 246.18±73.25 43.72±8.42 187.64±43.22 0.97±0.08 1.71±0.32
DNA ase
4.5 3.29±1.05 6.19±1.38 2.85±0.74 4.03±0.26 2.12±0.65 2.50±0.60
7.5 2.76±0.54 12.54±4.07 2.37±0.63 6.67±0.16 7.88±0.93 8.83±1.27
2.2　影响核酸酶活性的某些因素
为了了解细胞壁酶促降解过程中那些因素引起细胞内核酸酶活性增强 ,测定了酶液中作为渗
透压稳定剂的甘露醇浓度和细胞壁降解产物对核酸酶活性的影响 。随甘露醇浓度增加 , RNA 酶和
DNA酶活性均有不同程度的提高(图 1)。其中以甘蔗叶原生质体的核酸酶活性增加较明显 。
91　　1 期 　何若天等:　甘蔗和烟草幼叶原生质体的核酸含量与核酸酶活性及其影响因素
　　我们曾见 CWDP 能明显降低甘蔗幼
叶原生质体的呼吸活力及钝化有关呼吸酶
活性〔2〕。但在本试验中 ,随 CWDP 浓度增
加 ,除了甘蔗叶原生质体的 RNA 酶活性
略有提高外 ,其 DNA酶和烟草的 RNA 酶
与 DNA 酶活性均不受影响 (表 3)。因
此 , Premecz等〔8〕认为介质中的渗透压是
诱导游离原生质体内 RNA酶水平大幅度
提高的主要因素的看法与本试验结果一
致。
3　小　结
鉴于在原生质体培养中 ,甘蔗幼叶原
生质体的细胞分裂能力极差 ,远比不上烟
草叶原生质体的那么容易(未发表资料)。
其原因除了与酶法分离原生质体期间 ,与
烟草的相比 ,甘蔗的细胞膜受损较为严
重〔1〕和呼吸活力为 CWDP 等毒性因子影
响较大〔2〕外 ,与本研究所见酶法新鲜分离
的甘蔗幼叶原生质体内核酸含量的减少和
核酸酶活性的增强均明显高于烟草幼叶原
生质体的亦是个重要因素 。
图 1　细胞壁降解酶溶液中甘露醇浓度对甘蔗
　和烟草幼叶原生质体内核酸酶活性的影响
F ig.1 The effect of mannitol at defferent concentrations
in cell wall degrading enzymes mix ture on the activities
of RNAase and DNAase in young leaf protoplasts
of sugarcane and tobacco
表 3　CWDP对甘蔗和烟草叶原生质体核酸酶活性的影响
Table 3　The effect of cell w all degradat ion products(CWDP)on the
nuclease activity in isolated protoplast s of sugarcane and tobacco
细胞壁降解产物浓度
CWDP1)Conc.
(μg.mL -1)
酶活性 Activity of enzyme(U.mg -1 p rotein)
甘蔗 Sugarcane 烟草 Tobacco
RNAase DNAase RNAase DNAase
0 270.32±12.41 26.40±3.70 24.32±6.31 7.54±1.23
100 275.45±15.20 28.65±4.23 25.17±5.42 7.60±2.06
300 253.62±18.65 27.53±2.81 24.68±0.96 8.31±1.75
500 307.86±26.78 26.21±2.54 26.37±7.23 7.42±2.52
700 367.86±46.34 29.33±0.79 28.92±3.05 7.83±4.05
900 385.37±39.52 28.06±1.47 25.26±2.84 8.25±1.78
1)CWDP中约含 7.8%DW 低聚糖。 The content of oligosaccharide in CWDP is about 7.8%DW。
92 广　西　植　物 17 卷　　
参　考　文　献
1　何若天 , 覃　伟 , 李任强.甘蔗和烟草叶原生质体分离期间的膜损伤及有关酶活性变化.植物生理学报 , 1994 , 20(1):100～
104
2　何若天 , 覃　伟.甘蔗幼叶原生质体分离过程中呼吸的变化及其影响因素.植物生理学报 , 1995 , 21(1):80～ 86
3　朱治平.植物组织中核酸含量的测定.见薛应龙 , 夏镇澳编.植物生理学实验手册.上海:上海科学技术出版社 , 1985 , 44～
46
4　Kaur-Saw hney R , Altman A , Galston A W.Dual mechanisms in polyamine-mediated cont rol of ribonuclease activity in oat leaf
protoplasts.Plant Physiol , 1978 , 62:158～ 160
5　Arad S(M), Mizrahi Y , Richmond A E.Leaf w ater conten t and hormone effects on ribonuclease act ivi ty.Plan t Physiol , 1973 , 52:
510～ 512
6　Kunit z M.Crystalline desoxyribonuclease Ⅱ.Digest ion of thymus nucleic acid(desoxy ribonucleic acid)The kinetics of the reaction.
J Gen Physiol , 1950 , 33:363～ 377
7　Bradford M M.A rapid and sensit ive method for the quant itation of microgram quant ities of protein ut ilizing the principle of p rotein-
dye binding.A nal B iochem , 1976 , 72:248～ 254
8　Premecz G , Ola′h T , Gulya′s A , Nyi trai A′, Pa′lti G , FarkasG L.Is the increase in ribonuclease level in isolated tobacco protoplast s
due to osmot ic stress? Plant S ci Lett , 1977 , 9:195～ 200
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93　　1 期 　何若天等:　甘蔗和烟草幼叶原生质体的核酸含量与核酸酶活性及其影响因素