全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 2O(4)：356— 360 2000年 11月
文童 编号 ：1oo0—31 42(2000)04—0356—05
∈ 亏
外植体龄和蔗糖浓度对黄瓜子叶
产 生毛状根的影响
＼／
施和平 ，李 玲 ，潘瑞炽
华南 师 范大学 生物 系 ．广东 一州 510631
摘 要 ：研究 了外植体龄和蔗糖浓度对发根农杆菌 R1601介导黄瓜子叶产生 毛状根的影 响。结果表
明 ：以 】0 d龄 于叶外植体产生毛状根 的能力最强，外植体的毛状根诱导率为 88 89 ；20 d龄子叶
外植体的毛状根诱 导率比 10 d龄子叶外檀体降低 52．86 ；30 d龄子叶外植体感染 发根 农杆菌
R1601后不产生毛状根 感染发根农杆菌 R1601的黄瓜子叶外植体在不加或加 1 蔗糖 的 MS培养
基上的毛状根诱导率板 低．子叶外植体逐渐变黄 ．腐烂 ：而培养基中添加 2 ．3 或 4 的蔗糖可
显著提高子叶外植体 的毛状根诱 导率 黄瓜毛状根能在无外褥植物激寨的 MS液体培养基中 自主
生长 。冠瘿碱的高压纸 电泳检测表明毛状根已被 RiT—DNA转化。
关键 词 ：
． 苎竺竺；垂塑整 !垄堡查 里!重 ；毛盐堡
中 图分类 号 ：Qg43．1 文献 标 识码 A
Effects of expl ant age and sucrose concentration
on hairy root formation from
cucum ber cotyl edons
SHI He—ping．LI Ling，PAN Rui—chi
(Sotah CFllnaⅣDt Unv~rsity-Guangzhou 510631-China )
Abstract：Effects of explant—age and SUCFOSe concentration on Agrobacterium rhlzogenes R 1601一medi
ated hairy root formation frorn cucum ber co*ytedons were studied． ~he results showed that the highest
rate of hairy root[nduction 88 89 was visiblein10 day-old cotyledon explants The rate ofhair3
root induction of 20 day—old explants was about 52．86 lower than that of 10 day—old one．but nQ
hairy root was obtained from 30 day—old cotyledon exp[ants after inecu[ation with A． rhizogenes
R】601． W hen M Smedium supplemented with O or 1 sucrose，cotyledon exp[antsin{eeted by A．
rhtzogenes R1601 slowly necrofized and died without any ro t differentiation If added 2 ．3 or 4
sucros~ to MS medium，the rate of hairy root induction from cotyledon explants infected with A．r^
2。g R1601 was enhanced．The hairy root of(Tucu~nis satiz．u．~L could have a rapid growth in Lktuid
收 {一日期 1999—03 29
作者 简 介 ：施和 平 (1964一)．男 ．博 士 ．副研 究员 一从 事植 物生 理厦 生物 学方 面 的科研教 学 工作
基 盒项 目 广 东省 自然科 学基 盒资 助 项 目 (990451)
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广 西 植 物 20卷
M S medium without exogenous phytohormones．Transfolmation was confirmed by opines(agropine】
analysis with high voltage page r electrophoresis．
Key words： Explant age；sucros,~ concentration； Cu~umis 5 ㈣ Agrobacterlum rhizogenes； hai ry
FOOl
对某一种发根农杆菌而言，如何提高其 Ri(root inducing)质粒对植物细胞的致根效率，
拓宽其寄主范围，一直是植物遗传转化 中亟待解决的问题。一些研究表明 ，在发根农杆菌与
植物细胞双向作用的复杂过程中，毛状根的产生除取决于农杆菌菌株致病力外，还与感染部
位、植物种类、极性和 NAA浓度等因素密切相关 ～ 。 黄瓜是一种重要的蔬菜作物，但具有
严重的有性不亲和杂交障碍“ 。目前 对黄瓜遗传转化的研究较少。本文报道外植俸龄和蔗糖浓
度对黄瓜子叶产生毛状根影响的实验结果 ，为今后用 质粒载体建立黄瓜的高教遗传转化系
统提 供可能性
1 材料和方法
1．1材料培养
黄瓜 (Cucumis sativus L)津研四号种子 ，按不同时间用 0．1 HgC1 消毒 26 min，接种至
盛水湿润的无菌脱脂棉的三角瓶中，25℃ 暗萌发 48 h后，置于光强 2000 Ix，每天 1 2 h光照
25 下萌发成无菌苗 。取萌发 l0 d，20 d和 30 d的幼苗子叶分别切成 0．5 cm。小块置于无激
素的 MS培养基上预培养供感染用。另取萌发 10 d的幼苗子叶切成 0．5 em 小块 ，分别接至
添加 l ，2 ，3 ，4 蔗糖的 MS培养基上预培养供感染用 。
1 2细菌 苗株及培养
发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)R1601具有质粒 pRiA4b，并且其 中HindⅡ片段
2l上整合 NPT I (neomycin phosphotransferaseⅡ)基因，染色体背景与C58相同，同时该
菌还具 有超致病 根癌 农杆 菌 (A ·tumefaciens)的 vir(virulence，毒 性) 区的’粘性质 粒
pTVK291 。农杆菌在含卡那霉素的 AB培养基上暗培养和保存。感染植物材料之前，将农杆
菌接于 YEB液体培养基28℃ 中暗培养30 h。
1．3毛状根 的诱导 和培养
上述预培养l d的子叶外植体放人含发根农杆菌 R1601的液体培养基中，取出吸干放回至
原培养基上共培养2 d后，转人 MS+ 500 mg／I 头胞壤肟钠 (cefotaxime)的培养基上，25
c散射光下诱导毛状根 。切下毛状根除菌培养后 ，置于无激素的 MS液体培养基 中振荡培养
(i00 r／min)。实验重复3次
1．4毛状根冠瘿碱 的检测
基本参照 EUis等的方法 。将毛状根直接研磨成浆状离心，取上清液进行高压纸电泳 ，电
压40 v／cm，90 min后，将纸吹干显色定影水洗后吹干即可显出冠瘿碱带。
2 结果和分析
2．1外植体龄对黄瓜于叶产生毛状根的影响
从表l可见，未感染的萌发10 d，20 d和30 d的黄瓜子叶外植体在无激素的 MS固体培养
基上培养后均不生根。而感染发根农杆菌 R1601后2～3 d，10 d龄，20 d龄的子叶外植体的形
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358 广 西 植 物 20卷
图1 A 感 染发根 农杆 菌 R1601的10 d龄黄 瓜子叶 外 植体 产生 的毛状根 ；B 感 染 R1601的20 d龄黄瓜 子叶 外植 悻
产生的毛状根：C 发根农杆菌 Rl601诱导的黄瓜毛状根在无激素的 MS液体培养基中生长 }D 非转化报
【正常根)在无澈摩的 MS液体培养基中生长，
Fig 1 A．Hairy from 10 day-0 cucumber coty~don exp~nt infected with Agrobacte~um rtuzogenes R1 601：B Hairy
o0ts fr[ⅪlI 20 day—old cucumb~ ~ tyIedon explant inkcted with A 0 5 R1601；C Hairy~-oots with R1601 grew in
ho~ nes—It-ee][quid M S medium ： D Non trar~formed roots (normal root) grew in hormone—Eree liquM MS med_um
态学下 端 中脉处产 生 白色或淡 黄色愈伤组织
并 陆续 生根 ，至lO d时已从愈 伤组织上 长出
许 多毛状 根 (图1，A，B)。但20 d龄子叶外植
体 的毛状 根诱 导率 比10 d龄 子 叶降低 约
52 86 ，生根频率也降低。30 d龄的子叶外
植体感染发根农杆菌后不生根 ．子叶外植体
逐渐变黄 。黄瓜子叶外植体产生的毛状根在
头胞 噻肟钠 的培 养基 上 3～4次 除菌培 养后 ，
能在无激素的 MS液体培养基中快速生长；
襄 1 外檀体 龄对黄 瓜 子 叶产 生毛 状 根的影 响
Table 1 Effect 0f exp]ant 8ge o1,hairy root
form ation from cucum 。ber cotyledons
对照根t黄瓜子叶 自然生根率极低，故以O．1 mg／l NAA(萘乙酸)诱导子叶产生的不定根作对
照)生长极其缓慢(图1，c，D)。
2．2蔗糖浓度对黄瓜子叶产生毛状根的影响
从表2可见 ，感染发根农杆菌的子叶外植体在不加或仅加1 蔗糖的培养基中的毛状根诱
导率较低，根诱导频率也极低(仅1条根)，且子叶外植体逐渐变黄，仅在其形态学下端产生很少
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黄绿色愈伤组织 ；随着培养时间的延长 ．子叶严重缺绿变黄，以致腐烂。经感染的子叶外植体在
添加2 ，3 或4 蔗糖的培养基 中不变黄褪绿 ．子叶外植体的毛状根诱导率明显提高．且生根
部位主要集中在子叶形态学下端切口附近．其中仅添加4 蔗糖培养的子叶外植体的形态学上
端和下端均可产生毛状根，但形态学上端产生的毛状根数 目明显少于形态学下端。
2、3毛状根鉴定
从 图 2可 见 ，发 根 农 杆 菌
R1601感染的黄瓜子 叶外植 体
产生 的毛状根 能合成农杆碱 ，这
表 明发根农 杆 菌 TR—DNA (T—
DNA 右 臂 ．the right—hand of
transferred DiN A of Ri pLasmid)
区编码的冠瘿碱合成酶基 因已
在黄 瓜基 因组 中表达 ；对 照根 未
检 测到农杆碱 ，也不 能在 无外 源
激素 的 MS培养基 上 自主生 长 。
3 讨 论
表 2 蔗糖浓度对感染发根农杆菌 R160I的黄瓜
子 叶产 生毛 状根 的 影响
Table 2 Effect of SHCrOF4~concentration on hairy rooI
lornlation from cucu~nher cotyledon infected
with Agrobacterium rh~ogenes R1 601
有关外植体龄对黄瓜子叶产生毛状根的影响
目前尚未见正式报道。但有研究表明，不同苗龄的
外植体的器官或胚胎发生的潜力不同 3～7 d龄
的黄瓜幼苗子叶可100 地再生出芽 ，但7 d龄以
上的幼苗子叶的芽再生能力却显著降低 ，甚至于
完全 丧失 。用根癌农杆 菌转 化生菜 叶外 植体 时 ，
以 1～3 d苗龄的子叶转化效 果最佳 ，4～j d龄 的
子叶未能 得到转基 因植株 。 。甜瓜 ，西 瓜的遗传转
化也 以5～6d苗龄 的子叶再生和转化效果最好
(贾士荣等1995)。以花生3～10 d龄的叶片作外植
体进行转化时，根癌农杆菌感染和转化效果以荫
发10 d的深绿色幼叶最好。 ，这与本实验的结果
类似。在本实验中发根农杆菌 R1 60I感染幼嫩的
10 d龄黄瓜子叶外植体的转化效果最好 ，20 d龄
子叶外植体的转化效果次之，而感染30 d龄的子
叶外植体就不能产生毛状根，这表明外植体龄可
明显影响发根农杆菌的遗传转化效率．同时也说
明外植体的发育时期不同，对农杆菌感染可能存
在 一个最佳感 受态 的问题 。
【刳2 黄瓜毛状根中冠瘿碱 (农杆碱)的植刊
1遣 标 准品 ；2遭 R1601诱导 的 毛状 根提取 馥 ．
3遣 0 1【 儿 NAA诱导的黄皿不定根提取j丧、
Agr．袁 扦碱 }N s．中性 糖
Fig 2 Det~tion of opines ( r0 耻 )in hairy
r00t3 of C⋯ I_
】a| I standard ag~ ine=h ! cxtTac【s hairy⋯ ⋯ th
R1 60】； lane 3 e⋯ ts of ndvemitious⋯ si~ducedh 0 I
mg／L NAA Agr ．Agroptne．N S． neutral uEaTs
在研究 Ti(tumor inducing)质粒 v r基因激活实验中发现 ，某些糖类和植物酚类化合物
之间具有协同作用“ ，但它们对非诱导表达的 vir基因不产生作用 ，而且某些被农杆菌利用的
单糖如 核糖 ，D一阿拉伯糖和 L一甘露糖及一些还原糖如 山梨糖醇 ，甘露醇及蔗糖和乳糖等
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4期 施 和平等 ：外植 体龄和蔗糖 浓度对 黄瓜子叶产 生毛状根 的影响 360
却对提高 1、质粒的 vir基因表达没有作用 ；相反 ，不能被农杆菌代谢的 a一脱氢一 葡萄糖却能
产生作用，但这种糖效应在 virA蛋白胞外质部位编码区缺失的突变体中则不复存在 ，而乙酰
丁香酮仍可诱导 v_r基 因在这类突变体中表达“ 。考虑到这些单糖在l mmol／l 时就可产生诱
导活性 ，因而排除它们是仅通过影响渗透压的变化而发挥作用。最近的研究发现，发根农杆菌
R 质粒的 rolC生根基因的启动子活性受蔗糖浓度的调节“ 。在本 实验中不加蔗糖或少加
蔗糖预培养和共培养的黄瓜子叶外植体被发根农杆菌感染后，不仅子叶外植体的毛状根诱导
率极低，且子叶很快缺绿变黄，腐烂；而高浓度 (4 )蔗糖却能使黄瓜子叶外植体形态学上
端也产生毛状根。因此我们认 为蔗糖对感染发根农杆菌的黄瓜子叶产生毛状根的影响 ，除其主
要起维持渗透压和提供碳源的作用外，还可能与其调节 ro1C基因表达水平有关。
致谢 原中科院植物所林忠平先生书法国国家科 学研究中t0 Jacques Tem 先生分别馈赠
发根 农杆菌 菌种 和冠瘿碱标 准 品。
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