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植物生长调节剂和蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织生物量及有效物质积累的影响



全 文 :北方园艺2016(19):171~175 ·中草药·
第一作者简介:张万博(1991-),男,硕士研究生,研究方向为植物
组织培养。E-mail:732635406@qq.com.
责任作者:金英花(1982-),女,博士,讲师,现主要从事长白山经济
植物生态特性与开发利用等研究工作。E-mail:yhuajin@ybu.edu.cn.
基金项目:吉林省博士后科研资助项目(RB201307)。
收稿日期:2016-04-18
DOI:10.11937/bfyy.201619043
植物生长调节剂和蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤
组织生物量及有效物质积累的影响
张 万 博,朴 炫 春,杨   帆,姜 银 姬,廉 美 兰,金 英 花
(延边大学 农学院,吉林 延吉133002)
  摘 要:以狼爪瓦松愈伤组织为试材,采用正交实验的方法,研究了 MS基本培养基浓度及
6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)2种植物生长调节剂对狼爪瓦松愈伤组织生物量和有效物
质含量的影响;同时,对适宜的蔗糖浓度进行了筛选。结果表明:MS+3.5mg·L-1 6-BA+
0.1mg·L-1 NAA组合,最有利于愈伤组织生长和多糖、总酚及黄酮的积累;MS+3.5mg·L-1
6-BA+0.1mg·L-1 NAA培养基中加入30g·L-1的蔗糖时,愈伤组织生长最佳,有效物质含量
最高,在此蔗糖浓度下狼爪瓦松愈伤组织可生产711.2mg·L-1多糖、165.1mg·L-1总酚和
154.5mg·L-1黄酮。
关键词:狼爪瓦松愈伤组织;MS培养基;植物生长调节剂;蔗糖浓度;生物量;有效物质
中图分类号:R 282.71 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)19-0171-05
  狼爪瓦松(Orostachys cartilaginous)属景天科瓦松
属植物,主要分布在我国的山东、内蒙古、辽宁、吉林和
黑龙江等地[1],多生长在干质山坡岩石上,其植物资源
多用于抗旱和观赏研究。瓦松属植物含有黄酮类、多酚
类、甾醇类、有机酸、强心苷、多糖等化学成分[2-3],具有极
大的药用价值。现代药理研究表明,该植物具有抗炎、
抗菌、抗癌、强心和免疫调节等作用[4]。目前,狼爪瓦松
野生资源有限,且人工栽植技术不完善,难以满足市场
需求。植物细胞培养具有增殖速度快和不受自然条件
限制等优点[5],故通过培养植物细胞、组织或器官的方
式对快速生产植物中有效物质具有重要意义。但对于
景天科瓦松属植物,特别是狼爪瓦松通过植物细胞培养
手段生产有效物质的研究尚鲜有报道[4,6]。因此,该试
验以长白山地区的狼爪瓦松无菌种子苗叶片诱导并增
殖的愈伤组织为材料,研究了MS培养基浓度、6-苄氨基
腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)及培养基中的蔗糖浓度
对愈伤组织生物量及有效物质(多糖、总酚和黄酮)积累
的影响,旨在筛选适宜狼爪瓦松愈伤组织生长和有效物
质合成的培养基,为其种质资源的开发利用提供一种新
的材料来源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取采集于吉林省龙井市东盛涌镇(海拔385m)的
狼爪瓦松种子,洗净后用75%乙醇处理30s,无菌水清
洗后,再用0.1% HgCl2溶液消毒10min,并用无菌水反
复冲洗4~5次,滤纸吸去多余水分后,将种子接种在
MS+蔗糖30g·L-1+琼脂7.8g·L-1(pH 5.8)的培
养基中。30d后待种子萌发,植株长成2~3cm高时,剪
取叶片,并切成0.5cm2 左右方块,接种到1/2MS+
4mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA+30g·L-1蔗
糖+7.8g·L-1琼脂(pH 5.8)培养基中诱导愈伤组织。
培养条件为相对湿度70%,温度(25±2)℃,光照强度
1 600lx(光周期为16h)。60d后,将诱导出的愈伤组织
进行增殖培养(1/2MS+4mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1
NAA+30g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂)。以后每20d
继代1次,将增殖的愈伤组织作为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1 MS培养基浓度及6-BA和NAA对狼爪瓦松愈
伤组织生物量及有效物质含量的影响 试验采用三因
素八水平的正交设计法(表1),对MS不同浓度(1/4、2/4、
3/4、4/4、5/4、6/4、7/4、8/4)及6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5、3.0、3.5、4.0mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5、0.6、0.7、0.8mg·L-1)不同浓度进行组合。各处理
均加入30g·L-1的蔗糖,pH 5.8。将鲜物质量约为
171
·中草药· 北方园艺2016(19):171~175
250mg的愈伤组织团接种在含有50mL培养基的培养
皿(Φ×h=9mm×15mm)中,每个培养皿接种4团,每
个处理接种3个培养皿作为重复。在相对湿度70%、温
度为(25±2)℃、光照强度1 600lx,每天光照16h的条
件下培养。培养20d后,将愈伤组织从培养基上取出,
称其鲜物质量,随后放入55℃烘干箱中干燥48h至恒
质量后取出,称其干物质量。最后,用各处理的愈伤组
织干品测定多糖、总酚及黄酮含量,并计算这3种有效
物质的生产量。有效物质生产量(mg·L-1)=愈伤组织
干物质量(g·L-1)×有效物质含量(mg·g-1 DW)。
表1 MS培养基浓度及6-BA和NAA
浓度的正交实验设计
  Table 1 The orthogonal experimental design of MS medium
strengths and concentrations of 6-BA and NAA
序号
No.
MS浓度
MS
concentration
6-BA浓度
6-BA concentration
/(mg·L-1)
NAA浓度
NAA concentration
/(mg·L-1)
1  1/4  2.0  0.7
2  2/4  4.0  0.5
3  3/4  1.5  0.3
4  4/4  3.5  0.1
5  5/4  1.0  0.8
6  6/4  3.0  0.6
7  7/4  0.5  0.4
8  8/4  2.5  0.2
1.2.2 培养基中蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织生长和
有效物质含量的影响 为了调查培养基中蔗糖浓度的
效果,在表1正交实验中选定的最佳培养基(MS+
3.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA)中加入不同浓
度的蔗糖(20、25、30、35、40、45、50g·L-1),pH 5.8。培
养方法及条件同试验1.2.1。
1.3 项目测定
1.3.1 多糖含量的测定 精密称取干燥至恒重的葡萄
糖100mg,用100mL蒸馏水定容后取10mL溶液定容
至100mL,此为对照品溶液。精密量取对照品溶液
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分别置于试管中,加蒸馏
水稀释至2.0mL后加入1.0mL苯酚试液,混匀后加入
5.0mL浓硫酸,静置5min,置于40℃水中加热30min,
冷却至室温,以蒸馏水为空白。于490nm处测定吸光
度,绘制标准曲线。为提取多糖,精确称取愈伤组织粉
末0.1g,用10mL的80%乙醇于室温下浸泡6h进行
2次。然后加入20mL蒸馏水,超声处理30min,过滤收
集上清液,沉淀物以同样的方法超声处理3次,混合滤
液,与对照品在相同波长下测定吸光度。
1.3.2 总黄酮含量的测定 以芦丁为对照品,采用
李承范等[2]的方法测定黄酮含量。将10mg芦丁置于
50mL容量瓶中,加入适量乙醇后水浴加热,即得浓度
为0.2g·L-1对照品溶液。将芦丁对照品溶液配制成
不同浓度(0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL)后,
分别置于25mL 容量瓶中,依次加入70%乙醇
(10.0mL)、5%亚硝酸钠溶液(1.0mL)摇匀,放置6min
后,加入10%硝酸铝溶液(1.0mL)摇匀,放置6min后,
加入4%氢氧化钠溶液(10.0mL),用30%乙醇稀释后放
置15min后,于波长为510nm处测定,绘制的标准曲线。
为了测定样品中黄酮含量,精密称取愈伤组织粉末1g,加
入70%乙醇(v/v)25mL,水浴回流2次,过滤后合并2次
滤液定容,测定样品溶液的吸光度,求得总黄酮含量。
1.3.3 总酚含量的测定 以没食子酸为对照准品。精
密称取没食子酸0.025g,用蒸馏水溶解并定容至250mL,
得到浓度为0.1g·L-1的对照液。准确吸取0.005、
0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350mL置于棕色容
量瓶中,加蒸馏水至1.0mL,然后分别加入福林酚试剂
0.1mL,混匀,6min后加入2%的Na2CO3溶液0.5mL,
充分混合后在25℃避光放置1h,以1.0mL蒸馏水为空
白,于760nm处测定吸光值,绘制标准曲线。为测定总
酚含量,精密称取愈伤组织粉末0.1g,加入10mL的
80%甲醇,80℃温度下水浴1h,重复提取2次后,用
80%甲醇定容至25mL,与对照液在相同波长下测定吸
光度,求得总酚含量。
1.4 数据分析
试验采用完全随机设计,3次重复,利用Excel软件
进行数据整理分析,试验数据为3次重复的平均值±标
准差。
图1 MS培养基浓度及6-BA和NAA浓度组合对
狼爪瓦松愈伤组织生物量的影响
Fig.1 Efect of MS medium strengths and the concentrations of
6-BA,NAA combinations on calus biomass of
Orostachys cartilaginous
2 结果与分析
2.1 MS培养基浓度和6-BA及NAA浓度组合对狼爪
瓦松愈伤组织生长和有效物质积累的影响
根据正交实验设计方法,对不同浓度的 MS培养基
及6-BA和NAA进行组合。结果发现在不同浓度的
MS培养基和植物生长调节剂组合中,狼爪瓦松愈伤组
织生物量存在差异。由图1可知,培养20d后,第3、4、5
组处理中的鲜物质量均高于其它处理,第5组处理中的
271
北方园艺2016(19):171~175 ·中草药·
鲜物质量最高,为8.93g;愈伤组织干物质量在第3、4、
5、6组处理间差异不显著,且均高于其它处理。第8组
处理中的鲜物质量及干物质量均低于其它处理。
由图2可知,在不同 MS培养基浓度和6-BA及
    
图2 MS培养基浓度及6-BA和NAA浓度组合对
狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累的影响
Fig.2 Efect of MS medium strengths and concentrations of
6-BA,NAA combinations on efective compounds accumulation of
Orostachys cartilaginous calus
NAA浓度组合中,愈伤组织中多糖、黄酮及总酚的含量
和生产量均呈现相同的变化趋势,第4组处理的有效物
质积累量高于其它组合,多糖、黄酮及总酚含量分别达
到95.2、25.3、19.8mg·g-1 DW,生产量分别为476.2、
126.6、99.0mg·L-1。因此,第4组处理(MS+6-BA
3.5mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1)适宜狼爪瓦松愈伤
组织培养,用于进一步试验。
2.2 蔗糖浓度对愈伤组织生物量及有效物质含量的
影响
随着培养基中蔗糖浓度的升高,狼爪瓦松愈伤组织
的生物量及有效物质含量出现相应变化。培养20d后,
在25g·L-1的蔗糖处理中愈伤组织生长旺盛、饱满,且
多呈现出淡绿色,鲜物质量达到最高(图3、4)。当蔗糖
浓度继续增加时,愈伤组织鲜物质量则呈下降趋势;蔗
糖浓度对干物质量的影响不同于鲜物质量,蔗糖浓度为
20~50g·L-1时,干物质量随浓度的增加始终呈上升
趋势。
不同蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织中的多糖、总酚
及黄酮含量影响不同。培养20d后,随着蔗糖浓度的增
加,3种有效物质含量变化均呈现先上升后下降的趋势,
    
图3 蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织生物量的影响
Fig.3 Efect of sucrose concentrations on biomass of
Orostachys cartilaginous calus
图4 蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织生长的影响
Fig.4 Efect of sucrose concentrations on Orostachys cartilaginous calus growth
371
·中草药· 北方园艺2016(19):171~175
当蔗糖浓度为30g·L-1时,多糖、黄酮及总酚含量和生
产量均达到最高,分别为92.8、21.6、20.2mg·g-1 DW
和711.2、165.1、154.5mg·L-1。当浓度超过30g·L-1
时,3种有效物质含量及生产量均下降。综合以上结果,
通过愈伤组织培养生产狼爪瓦松有效物质时,培养基中
的蔗糖浓度可确定为30g·L-1。
图5 蔗糖浓度对狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累的影响
Fig.5 Efect of sucrose concentrations on efective compounds
accumulation of Orostachys cartilaginous calus
3 讨论与结论
作为常用基本培养基之一,MS培养基早已在组织
培养中被广泛利用,但不同植物种类所适应的浓度不
同。该试验通过对不同 MS培养基浓度的筛选,结果表
明当MS浓度为1倍时,狼爪瓦松愈伤组织生物量及其
有效物质含量达到最佳。且添加适宜浓度的生长调节
剂也会促进植物的生长,该试验添加的2种植物生长调
节剂,NAA是生长素类物质,能明显促进细胞的生长,
产生愈伤组织;6-BA为细胞分裂素类物质,能促进细胞
分裂[7]。在多数情况下,根据植物生长调节剂之间相互
作用的机理,细胞分裂素需与一些植物生长素配合才能
促进细胞分裂,这些配合既可以促进细胞分裂,也可满
足植物生长的需要,而且能控制细胞分化[8]。该试验结
果表明,通过正交实验的方法,在 MS培养基中加入
3.5mg·L-1 6-BA和0.1mg·L-1 NAA时,狼爪瓦松
愈伤组织的生物量及有效物质含量显著增加,这与苏瑞
军等[9]的瓦松(Orostachyis fimbriatae)愈伤组织增殖生长
的最佳培养基为1倍的MS试验结果相似,但与之0.5mg
·L-1的6-BA为最佳的结论有所差异,说明不同种间的
植物所需生长调节剂浓度有所不同。
糖是提供植物能量的主要物质之一,而且糖浓度的
高低对植物生长有很大的影响[10]。在植物组织培养过
程中,培养基中的糖分是植物生长中不可缺少的碳源,
且能为细胞提供合成新化合物的碳骨架,为细胞呼吸和
代谢提供底物与能源,还可以维持一定的渗透压[11]。
经研究发现,狼爪瓦松愈伤组织的生物量及有效物质
的积累是随着蔗糖浓度的增加而呈现上升趋势,当蔗
糖浓度超过30g·L-1时,狼爪瓦松愈伤组织生物量逐
渐下降。因此,过高的蔗糖浓度会抑制狼爪瓦松愈伤组
织的增殖生长。这与张静等[12]得出的随着糖浓度的增
加,肉苁蓉细胞系中甜菜碱含量增加;当糖浓度达到
30g·L-1时,细胞系生长受到抑制,生长周期明显缩短
的结论有所差异,这可能由于不同植物细胞对不同的蔗
糖浓度要求不同。而该试验结论与赵松峰[13]的丰花月
季叶愈伤组织诱导的最佳蔗糖浓度为30g·L-1相同。
因此,组合为 MS+3.5 mg·L-1 6-BA+
0.1mg·L-1 NAA+30g·L-1蔗糖的培养基适宜狼爪
瓦松愈伤组织的生长,并能促进其有效物质的积累,进
而为种质资源的开发利用提供一种新来源。
参考文献
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471
北方园艺2016(19):175~177 ·中草药·
第一作者简介:程立君(1986-),男,湖南岳阳人,硕士,助教,研究
方向为食用菌与中草药资源开发。E-mail:chenglijun224@163.
com。 
收稿日期:2016-04-18
DOI:10.11937/bfyy.201619044
一株乌天麻共生萌发菌培养条件的优化
程 立 君1,李 世 辉1,胡 志 芳2,段 相 程1,赵 艳 娟1
(1.昭通学院 化学与生命科学学院,云南省高校昭通高原特色农产品工程研究中心,云南 昭通657000;
2.昭通苹果产业研究所,云南 昭通657000)
  摘 要:以天麻共生萌发菌MY-001为试材,采用单因素试验和正交实验分析法,以菌丝生长
速率和菌丝体生物量为主要指标,对萌发菌MY-001培养环境条件及培养基营养条件进行优化。
结果表明:MY-001最适宜的环境条件为温度25℃,培养基质含水量200%下进行暗培养;MY-001最
易利用的氮源和碳源分别是酵母膏、葡萄糖,复合维生素B也能促进菌丝生长,最佳的营养条件
为酵母膏3g·L-1、葡萄糖20g·L-1、复合维生素B 0.005g·L-1,通过多元回归分析建立回归
方程(Y=0.362+0.084A-0.014B-0.007C),方差分析显示方程为极显著。
关键词:天麻;萌发菌;环境条件;营养条件
中图分类号:S 567.9 文献标识码:B 文章编号:1001-0009(2016)19-0175-03
  天麻(Gastrodia elata Blume)为名贵的传统中药,云
南省昭通市是我国公认的天麻道地药材产地,特别是昭
通市彝良县小草坝所产的天麻,以优良的品质而驰名中
外[1]。天麻属兰科多年生草本植物,无根无绿色叶片,
不能进行光合作用,其种子发芽必须依靠萌发菌侵染后
才能正常发芽[2]。课题组前期对昭通小草坝分离的萌
发菌进行过筛选和萌发对比试验,并将筛选出的菌株在
昭通实施了推广[3]。大量研究表明天麻种子萌发菌属
      
于小菇属(Mycena)的一类真菌[2,4-5],该属的多数种类试
验有抗癌作用,对小白鼠肉瘤180和艾氏癌有抑制效
果[6]。由于菌种来源不同,生物学特性也存在差异,为
加快萌发菌的扩繁,降低生产成本,同时为深入开发利
用萌发菌奠定基础,有必要对萌发菌的生长环境条件和
营养条件进行研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试萌发菌菌株为 MY-001由昭通乌天麻原球茎
上分离获得,于昭通学院保存。供试碳源分别为葡萄
糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉。供试氮源分别为硝酸钾、
硝酸铵、蛋白胨、酵母膏和尿素。供试维生素分别为维

  
Effect of Plant Growth Regulators and Sucrose Concentrations on the Proliferation,
Growth and Effective Compounds Content of Orostachys cartilaginous Calus
ZHANG Wanbo,PIAO Xuanchun,YANG Fan,JIANG Yinji,LIAN Meilan,JIN Yinghua
(Agricultural Colege,Yanbian University,Yanji,Jilin 133002)
Abstract:Orostachys cartilaginous calus was used as experiment material,the efect of MS strength and concentrations of
plant growth regulators,6-BA and NAA on calus biomass and efective compound accumulation was explored by
orthogonal experiment method.The suitable sucrose concentration was also selected.The results showed that,MS
medium supplemented with 3.5mg·L-16-BA and 0.1mg·L-1 NAA was favorable for calus growth and efective
compound accumulation,the maxium fresh and dry weigth of caluses were found when the medium was supplied
30g·L-1 sucrose,711.2mg·L-1 of polysaccarides,165.1mg·L-1 of phenolics and 154.5mg·L-1 of flavonoids were
obtained in Orostachys cartilaginous calus.
Keywords:Orostachys cartilaginous calus;MS medium concentration;plant growth regulators;sucrose concentrations;
biomass;efective compounds
571