全 文 ：红江橙体胚发生及影响因素的研究
贺　红　潘瑞炽
(华南师范大学生物系 , 广州 510631)
韩美丽　李耿光
(中国科学院华南植物研究所 , 广州 510650)
摘　要　红江橙花后 4 周的幼果 , 直径约 1 cm 左右 , 这时期的胚珠最适于胚性愈伤组织的诱导。
以 MT 为基本培养基 , 加上适当浓度的 IAA 、BA 和 ME 可显著提高胚性愈伤组织诱导率。体胚发
生 ,以 MT + IAA 0.1 mg 1-1+ BA (ZT)1 mg 1-1培养基较好 , 能诱导产生正常体胚 ,且频率较
高。胚性愈伤组织继代次数对体胚发生也有一定的影响 ,继代 6次以内 , 胚性愈伤组织具有旺盛产
生体胚能力;继代至第 9 次时 , 产生体胚的能力明显下降;至第 12 代时 , 不能产生胚状体。成熟胚
转换成小植株 ,以 M T +GA 2 mg 1-1+ NAA 0.1 mg 1-1培养基成苗率最高。
关键词　红江橙;胚性愈伤组织;体胚发生
　1998-02-17收稿
　第一作者简介:贺　红,女,1967年出生,博士,植物细胞工程专业。现在广州中医药大学中药所资源室工作。
The study on the factors affecting embryogenesis of
Citrus sinensis Osbeck cv.Hongjiang
He Hong　Pan Ruichi
(Department of Biology , South China Normal University , Guang zhou 510631)
Han Meili　Li Gengguang
(South China Inst ituteof Botany , Academ ia Si nica , Guangzhou 510631)
Abstract　Ovules excised from the 4-week-old f ruit of Hongjiang sweet orange af ter anthesis
were suitable for embryogenic callus induction.MT basal media containing IAA 、BA and ME
were effective to induce embryogenic callus with the induction f requency of 25.5%.An optimal
medium for somatic embryogenesis was MT + IAA 0.1 mg 1-1+BA(ZT)1 mg 1-1 , induc-
ing normal embryoids.Embryogenic callus was subcultured at intervals 30 days.Embryogenesis
frequency was high before the 6th subcuture with 10 ～ 19 embryoid/piece callus.Embryoid
numbers remarkably decreased af ter the 9th subculture.Continued subculturing at 12th did not
induce any embryoids.A mature embryoid could develop into a whole plant in the MT basal
medium with GA3 2 mg 1
-1 and NAA 0.1 mg 1-1
Key words　Citrus sinensis Osbeck cv.Hongjiang;embryogenic callus;embryogensis
广西植物 Guihaia　18(4):343—346 1998 年 11月　
红江橙是华南地区推广的优良柑桔品种 ,其果实外型美观 、肉红汁多 ,风味独特 ,是目前我国重
要的出口创汇果品 ,深受国内外消费者欢迎 ,但在品种稳定性与抗病性两方面仍有待改良。本文以
红江橙幼果胚珠为材料 ,对体胚发生及其影响因素作了系统的研究 ,从而建立高效的体胚再生系
统 ,为应用生物技术改良红江橙打下基础。
1　材料和方法
1.1　胚性愈伤组织的诱导及继代培养
用红江橙开花后 30 ～ 70 d的幼果为材料 ,经 75%酒精擦洗表面 ,再用 0.1%HgCl2溶液浸泡 10
min后 ,在无菌条件下取出种子 ,剥取胚珠接种于愈伤组织诱导培养基上。诱导愈伤组织培养基为
MT ,附加不同的植物激素及有机附加物。形成的胚性愈伤组织在一定大小时 ,可继代于无激素的
MT 培养基上 ,每隔 30 d继代一次。
1.2　体胚诱导及植株再生
胚性愈伤组织接种于附加不同种类激素的 MT 培养基上 ,进行固体培养 ,以诱导体胚发生 ,胚
状体转绿后接种于附加有 GA3与 NAA的植株再生培养基上 ,可发育成完整植株。
所有培养基 pH为 5.8 ,使固化琼脂为 0.65%,培养温度 26 ±1 ℃,每天光照 16 h。
2　结果与分析
2.1　胚性愈伤组织的诱导及继代培养
红江橙幼果胚珠培养 ,产生两类愈伤组织 ,一类结构致密 、淡黄色;另一类为白色疏松状(图版
Ⅰ :1 , 2),分化试验表明前一类不能产生胚状体 ,后一类能诱导体胚发生 ,为胚性愈伤组织。试验
还观察到 ,大多数胚珠培养后 ,只形成前一类愈伤组织 ,只少量胚珠形成后一类愈伤组织 ,而且一般
在接种 2个月才开始形成。影响胚性愈伤组织诱导的因素很多 ,本试验研究了幼果发育时期及激
素和有机附加物对诱导率的影响。
2.1.1　幼果发育时期对胚性愈伤组织诱导的影响
表 1　幼果发育时期对胚性愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of the stage of frui t development on
embryogenic callus induct ion
幼果直径(cm)
Diameter of
fruits(cm)
胚珠数
No.of
ovules
发生胚性愈伤组织数
No.of ovules forming
embryogenic callus
诱导率(%)
F requency of
induction(%)
1 cm左右 215 43 20.0
1.5～ 2 cm 196 24 12.2
2～ 2.5 cm 204 4 2.0
红江橙幼果在不同时期采收 , 4 月初
至 4月中旬 ,果实直径 1 cm 左右;4 月中
旬至 5月中旬 ,果实直径 1.5 ～ 2 cm ;5月
中旬至 5 月底 , 果实直径则达 2 ～ 2.5
cm 。将不同直径幼果分成 3 组 ,分别取
其胚珠诱导胚性愈伤组织 ,结果列于表
1。果径1 cm左右 ,胚性愈伤组织诱导率
为 20.0%;果径为 1.5 ～ 2 cm和 2 ～ 2.5
cm ,诱导率分别为 12.2%和 2.0%,表明胚珠越小 ,其产生胚性愈伤组织的可能性越大。
2.1.2　植物激素及附加物对胚性愈伤组织诱导的影响
通过大量实验 ,找到了适当的诱导培养基。从表 2可见 , 10 号培养基胚性愈伤组织诱导率较
高(25.5%),其次为 8号和 9 号 ,诱导率分别为 20.8%和 16.0%,说明 IAA与 BA 或 ZT 结合 ,能促
进胚性愈伤组织的发生 ,BA比 ZT更加明显。2 , 4-D的作用效果不大 ,附加 2 , 4-D 的培养基 ,仅
6号具有一定的诱导率 ,为 5.2%,其余均不能诱导成功。表 2结果还表明 ,ME对胚性愈伤组织的
形成有良好的效果 ,在不加激素的情况下 ,诱导率就达 14.6%,根据以上结果得出:IAA 、BA 与ME
344 广　西　植　物 18卷　　
配合对胚性愈伤组织的形成有良好的作用。
待胚珠产生的白色 、疏松胚性愈伤组织长到一定大小时 ,可以进行继代培养 ,每隔 30 d左右继
代一次。继代培养基 ,以不加激素的 MT 培养基较好 ,既有一定的增殖速度 ,又不易形成胚状体;而
继代于附加激素或 ME的培养基上 ,对细胞的增殖有一定促进作用 ,但可能形成胚状体 ,因此 ,胚性
细胞的增殖 ,可以不需在 MT 培养基上加任何外源激素。
表 2　植物激素及附加物对胚性愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effect of plan t hormones and addi tional substances
in the medium on the embryogenic callus induction
编号
No.
　　培养基
　　Media
　　(mg 1-1)
胚珠数
No.of
ovules
发生胚性愈伤组织数
No.of ovules forming
embryogenic callus　
诱导率(%)
F requency of
induc tion(%)
1 M T 56 0 0
2 M T +M E 500 48 7 14.6
3 M T +CH 500 50 0 0
4 M T + 2 , 4-D 0.2 52 0 0
5 M T + IAA 0.2 47 0 0
6 MT+2 ,4-D0.2+IAA0.2 58 3 5.2
7 M T+2 , 4-D0.2+ZT0.5 38 0 0
8 M T+IAA0.2+BA0.5 53 11 20.8
9 M T+IAA0.2+ZT0.5 50 8 16.0
10
M T+IAA0.2+BA0.5+
ME 50
51
　
13
　
25.5
　
2.2　体胚诱导及植株再生
胚性愈伤组织的分化分两种
情况:一是由胚珠上长出的白色 、
疏松的愈伤组织形成胚状体(图版
Ⅰ:3),胚状体转绿开始发育(图版
Ⅰ:4)并形成正常植株(图版Ⅰ:6);
二是已经分化的胚状体由于培养
基等条件不适宜 ,胚状体畸形 ,不
能正常发育(图版Ⅰ:5)。
2.2.1　植物激素对体胚发生的
影响
植物激素直接影响体胚发生
能力。从表 3 可见 , 2号和 3 号培
养基诱导产生正常体胚 ,胚发生频
率和同步化程度较高。BA、IAA
及ZT 单独使用时 ,体胚发生能力低 ,仅形成少量胚状体或畸形胚 ,甚至没有胚状体发生 ,BA与 ZT 结
合使用 , 细胞增殖多 , 但也无体胚发生 , 说明当 IAA分别与 BA 、ZT 配合使用时 , 能促进体胚发生。
表 3　植物激素对体胚发生的作用
Table 3 The influence of plant hormones on
somatic embryogenesis
编号
No.
　培养基
　Media
　(mg 1-1)
细胞增殖
Cell
proliferation
体胚发育情况
Development of
somatic embryoid
1 M T ++ 无胚形成
2 M T + IAA 0.1 + BA1 ++ 胚发育正常 、频率高
3 M T + IAA 0.1 +ZT1 ++ 胚发育正常 、频率高
4 M T + IAA 0.1 + 形成少量畸形胚
5 M T +BA1 ++ 胚发育正常 、但频率低
6 M T +ZT1 ++ 无胚形成
7 M T +BA1 +ZT1 +++ 无胚形成
　　注:+++愈伤组织细胞增殖很多;++愈伤组织细胞增殖较多;
+愈伤组织细胞少量增殖。
2.2.2　胚性愈伤组织继代次数对体胚发生
的影响
Kochba等〔1〕(1977)报道 ,每隔 4 ～ 5 周继
代一次的甜橙愈伤组织 ,随继代次数的增加 ,
胚状体发生能力减弱。我们的实验结果表明 ,
继代 6次以内 ,胚性愈伤组织具有旺盛的分化
能力 ,每块(约黄豆大)愈伤组织平均分化出
10～ 19 个胚状体;当继代到第 9 次时 ,愈伤组
织形成胚状体数量明显减少 ,平均在 5 个以
下;到第 12代时 ,虽然愈伤组织仍有一定增殖
速度 ,但未见胚状体出现。
将正常的子叶胚转移到再生培养基上 ,能
长成完整植株 ,培养基以 MT +GA3 2 mg 1-1
+NAA 0.1 mg 1-1为宜 ,胚状体成苗率可达
70.2%,GA3浓度升高 ,能提高成苗率 ,但植株发育不正常 ,上胚轴特别长 ,叶变小;NAA 浓度提高 ,
能诱导生根 ,但抑制长苗 ,并诱导出愈伤组织。一般随着培养时间的延长 ,生根与出苗将会进一步
提高。
345　　4期 贺　红等:　红江橙体胚发生及影响因素的研究 　
3　讨　论
红江橙幼果胚珠胚性愈伤组织的繁殖 ,不需任何激素 ,只在 MT 培养基中附加一定量的蔗糖 ,
就可以达到继代增殖的目的。这与文献中报导的其它柑桔类的结果相似(J.kochba等〔1〕 , 1977;邹
韵霞等〔2〕 , 1989;陈如珠等〔3〕 , 1990)。通过诱导柑桔胚性愈伤组织 ,并定期地继代培养 ,进而形成数
量多和结构完整的胚状体 ,这样的离体繁殖方式比之通过茎芽完成分化的途径是更有效的。
张进仁等〔4〕(1987)将 1976 年柳橙胚培养诱导的胚性愈伤组织 , 继代于 MT + IBA 0.5 mg
1-1或MT +GA3 1 mg 1-1培养基上 ,每隔 10 ～ 12周交替继代培养 ,已达 8年半 ,共 38 代 ,仍保持
愈伤组织的增殖和再分化植株的能力。长期继代培养的愈伤组织 ,不仅是建立细胞无性繁殖系和
作为种质资源保存的一种材料 ,也是突变育种 、遗传转化的理想试材。这主要有材料一致 、容易处
理 ,不受季节和植物发育阶段的限制等优点。本试验得到红江橙胚性愈伤组织继代至 12 代以上
时 ,仍具有较高的增殖速度 ,但不能诱导体胚发生 ,这可能与品种差异性有关 ,能否改善培养条件 ,
再次“激活”其再分化能力 ,尚待研究。
Kochba〔5〕(1978)首次报道赤霉素具有促进胚状体后期发育作用。王大元等〔6〕(1978)报道 GA3
和高浓度无机盐使胚状体发育成完整植株。随后 Gmitter等〔7〕(1986),陈如珠等〔3〕(1990)的研究结
果也充分肯定了无机盐和 GA 3对胚状体再生植株的作用。本试验进一步证实了前人的结果并发
现适当浓度的 GA3与 NAA结合 ,对胚状体芽端发育及生根都有良好效果。
参 考 文 献
1　Kochba J , Spiegel-Roy P.T he effect o f auxins, cytokinins and inhibito rs on embryogenesis in habituated ovular callus of the`shamouti orange.
Z .Pf lanzenphysiol , 1977 , 81:283 ～ 288
2　邹韵霞 , 许丽萍 , 李宝健.贡柑体胚发生和成苗的研究.中山大学学报(自然科学论丛 [ 18]), 1989 , 8(4):110 ～ 117
3　陈如珠 , 李耿光 , 张兰英等.柑桔珠心培养胚状体发生及植株再生的影响因素探讨.中国科学院华南植物研究所集刊 , 1990 , 6:75 ～ 79
4　张进仁 , 吴安仁 , 高　峰.长期继代培养的柳橙胚愈伤组织再分化能力和遗传性研究.园艺学报 , 1987 , 14(3):213～ 216
5　Kochba J , Spiegel-Roy P , Neumann H et al.Stimulation of embryogensis in Cit rus ovular callus by ABA , ethephen , CCC and Alar and its sup-
pression by GA3.Z .Pflanzenphy siol , 1978 , 89:427～ 432
6　王大元.用组织培养法繁殖柑桔.遗传学报 , 1978 , 5(2):133 ～ 137
7　Gmitte r F G , Moo re G A.Plant regenera tion from undeveloped ovules and embryogenic calli of Ci trus:embryo production , germ ination and plant
surviv al.Plant Cel l , Tissue and Organ Culture , 1986 , 6:139 ～ 147
346 广　西　植　物 18卷　　
贺　红等:红江橙体胚发生及影响因素的研究 图版 Ⅰ
He Hong et al .:The study on the factors affecting embryogensis of Plate Ⅰ
Citrus sinensis Osbec cv.Hongjiang
1.红江橙胚珠培养形成的愈伤组织 ,此类愈伤组织不能产生胚状体;2.红江橙胚珠培养形成的胚性愈伤组织 ,能诱导体胚发生;3.胚性
愈伤组织形成胚状体;4.胚状体开始发育;5.胚状体形成的畸形苗;6.胚状体发育成正常植株。
1.Callus from ovules-deriv ed of Hong jiang swee t orange could no t induce any embryoids;2.Embryogenic callus from ovules-derived of Hongjiang
sweet o range could induce normal embryoids;3.Embryoids from the embryogenic callus;4.Embryoids initial differentiate;5.Anomalous plantlets
f rom the embryoids;6.Normal plantle ts from the embryoids.