全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(4)：563— 567 2010年 7月
木聚糖酶菌株的筛选及酶切位点的分析
孙宇哲1，王彦超1，郝再彬1，2 ，张厚瑞3
(1．东北农业大学 农学院，哈尔滨 150030；2．桂林理工大学 化学与生物工程学院
广西桂林54104；3．； 篝 广西植物研究所，广西桂林54106)
摘 要：以甘蔗残渣木聚糖为原料，通过唯一碳源选择性培养基筛选水解木聚糖的菌株，并对该菌株酶解木
聚糖的条件进行了优化和酶切位点的推测。结果表明，温度 6o℃、时间 3O min、pH6．0时为最佳酶促反应条
件，在该条件下菌株不能完全降解木聚糖，说明该菌株含有对木聚糖酶解的单酶，其酶活达到6．494 U／mL；根
据对直链淀粉的酶切分析 ，酶切位点是以 16～18个葡萄糖为最小单位进行的，这种低聚糖 的产生可能为今后
的木聚糖或淀粉的应用开拓新领域。
关键词：菌株筛选；木聚糖酶 ；酶解 ；位点
中图分类号 ：Q946．5 文献标识码 ：A 文章编号：1000～3142(2010)04—0563—05
Xylanase strain screenlng ancI I．eStrlCtl0n sites analysis ⋯ 』 ● ● 1 』 ● 』● ●· ●
SUN Yu-Zhe1，Ⅵ NG Yan-ChaoI，HA0 Zai-BinI，2*，ZHANG Hou-Rui3
(1．Colege of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2．Colege of Chemistry and
Bioengineering，Cruilin University of Technology，Guilin 541004，China；3．Guangxi Institute of Bonny，
Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China)
Abstract：Taking the xylan of sugar cane residue as raw material，the authors screened hydrolysis of xylan bac—
terial strain through the only carbonous and selective medium，then optimized the conditions and estimated re—
striction enzyme cutting site on what had been selected．The results suggested that the optimum reaction con—
ditions were under 6O℃ ，pH= 6．0 and reaction time 30 min but xylan eouldn’t be degraded completely by
strains under this condition，it approved that the strains contained single enzyme of xylanase．Xylanase activity
could reach 6．494 U／mL；on the basis of restriction analysis of amylase，the restriction sites opened at the 16—
18 glucoses as the smallest unit．The discovered oligosaccharides might open a new field for application of xy—
lan and starch in the future．
Key words：strain screening；xylanase；zymohydrolysis site
木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是 木
糖，是植物半纤维素的重要组成部分，它占植物碳水
化合物总量的 1／3，在 自然界中是继纤维素之后第
二丰富的再生生物质资源(连惠芗等，2006)。木聚
糖酶(Xylanase E．C3．2．1．8)是一种 主要的木 聚糖
降解酶类，通过内切方式降解木聚糖中 1，4木糖
苷键，水解产物以低聚木糖为主，并伴有少量的木糖
和阿拉伯糖(吴克等，2001)。不同来源的微生物可
以降解半纤维素，由于不同来源的木聚糖在主链聚
合度，支链残基的种类、数量、长度及其在主链上结
合位点方面的不同，要彻底降解木聚糖需要多种酶
的共同参与(Wong等，1998)。木聚糖酶具有广泛
收稿 日期 ：2009—08—31 修回日期：2010—02—19
基金项目：桂林理工大学科研启动费；厦门唐传生物有限公司合作费；广西科学基金(桂科回0731021)[Supported byInitial ScientificResearch Foun—
dation of Guilin University of Technology；Xiarnen Tangehuan Biological Co．Ltd Cooperation Costs；Science Foundation of Guang~(0731021)]
作者简介：孙字哲(1981一)，男，黑龙江佳木斯市人，硕士研究生，从事植物化学研究，(E-mail)sunyuzhe83O158O@163．eom。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：haozaibin610@126．corn)
564 广 西 植 物 3O卷
的应用前 景，主要应 用 于造 纸 工 业 (徐 志兵 等，
2002)、食品行业(禹慧明等，2002)、发酵产业(禹慧
明等，2002)和饲料行业(程伟等，1998)等方面。木
聚糖酶切位点及木聚糖结构特性的研究还少见报
道。本研究是从自然界中筛选到了一株木聚糖菌，
通过该菌株发酵后产生的菌液酶解特性可知 ，此酶
能够使淀粉中的直链按照 16～18个葡萄糖的短直
链形式降解，表现出酶的相对专一性，因此可以为木
聚糖或淀粉的生物改性提供理论依据。
1 材料与方法
1．1材料与设备
蔗渣木聚糖(8O％，广西植物研究所张厚瑞研究
员提供)；直链淀粉和支链淀粉(96 和 66 ，本实
验室制备)(王彦超等，2009)；D-木糖、L_阿拉伯糖等
为HPLC纯，购 自Sigma公司；异麦芽糖、棉籽糖、
水苏糖和纤维二糖(日本和光制药有限公司)；3，5一
二硝基水杨酸、无水葡萄糖、麦芽糖和蔗糖等生化试
剂均为国产分析纯。
EL-303电子天平，梅特勒一托利多仪器(上海)
公司；TU一1901双光束紫外可见分光光度计(北京
普析通用仪器有限责任公司)；HH—S数显恒温水浴
锅(金坛市医疗仪器厂)；SIGMA 3K30离心机(德
国希格玛离心机有限公司)。
1．2试验方法
1．2．1木聚糖酶菌株的筛选 培养基的配制(代义
等，2008)：培养基均以100 mL为单位体积进行计算：
①富集培养基(g)：蔗渣木聚糖 1．0，蛋白胨 0．5，NaC1
0．5，pH7．5。②筛选培养基(g)A：蔗渣木聚糖 3．0，
KN 0．1，MgSO4·7H2O 0．05，NaCl 0．5，K2HPO4
o．05，琼脂 2，pH7．5～8．o。③筛选培养基(g)B：蔗渣
木聚糖 2．0，KNO3 0．1，MgSO,·7HzO 0．05，NaC1
0．5，K2HPo4 0．05，琼脂 2，pH7．5～8．0。④种子培
养基(g)：牛肉膏o．5，蛋白胨 1，NaC1 o．5，pH7．0。⑤
产酶培养基(g)：木聚糖 0．5，酵母膏 0．5，蛋白胨 1，
NaCl 0．5，MgSO4·7H2O 0．05，自然 pH。
菌种的初筛和复筛(代义等，20O8)：取两份土壤
样品各 1 g和 1种剑麻厂废水 1 mL分别放入装有
玻璃珠及 100 mL无菌水的三角瓶中150 r／rain，30
℃下振荡 30 rain，吸取 1 mL该溶液于①富集培养
基中，同样条件下振荡培养 48 h。将富集培养液梯
度稀释至 1O一，吸0．1 mL于②筛选培养基 A上涂
平板，于3O℃培养箱中倒置培养 48 h，观察菌落生
长情况。将在②筛选培养基 A上出现透明圈的菌
株挑至③筛选培养基 B上，仍能出现透明圈的菌株
进行发酵产酶实验。
1．2．2茵液的制备和酶解条件的优化 菌液的制
备：用接菌环从③筛选培养基 B上取单环菌落转移
至④种子培养液(100 mL)中，经 3O℃摇床培养 1O
h后，按0．5 接种到⑤产酶培养基上，再经 3O℃摇
床培养 60~80 h后，发酵液以 6 000 r／rain离心 15
min，制得菌液保存于 4℃冰箱中备用。木糖标准
曲线的制备：DNS试剂制备及操作步骤参见郝再彬
等(2004)的方法。
木聚糖酶活的测定(李彩霞等，2001)：取稀释一
定倍数的菌液 1 mL，加入 pH6．0的磷酸氢二钠一
柠檬酸缓冲溶液配制 的 1 mg／mL的木聚糖溶液 1
mL，6O℃恒温水浴 5 rain后 ，立即加入 2 mL DNS
试剂沸水浴5 min后终止酶反应，以相应的灭活酶
为空白，测定木糖含量。酶活单位定义为 1 min内
l mL酶液水解木聚糖生成 1 moI还原糖(以木糖
计)相当的酶量(U／mL)。
菌液对木聚糖酶解的单因素优化 ：(1)温度和时
间：酶解处理 1 mg／mL木聚糖溶液 1 mL，其中控制
发酵液的稀释浓度，在不同的水浴温度下恒温 3O
min或在 60℃恒温水浴中反应不同的时间，之后转
移到沸水浴中5 min，终止反应，其它按照制作木糖
标准曲线的方法进行(每个温度下或每个时间下都
有相对应的空白)。(2)pH：选用 0．2 mol／L磷酸氢
二钠和 0．1 mol／L柠檬酸配制不同pH值的缓冲溶
液，分别取2mL加入到酶解反应液中，在 6O℃恒温
水浴中反应30 rain后，转移到沸水浴中5 min，终止
反应后调 pH至中性，其它按照制作木糖标准曲线
的方法进行(每个 pH下都有相对应的空白)。
酶解木聚糖最佳菌液量的确定：取 18支 25 mL
的标准具塞试管，向每两管中依次加入稀释一定倍
数的菌液(mL)0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、
1．6、1．8、2．0，其中一组编号 1～9为待测样；另一组
编号 11～l9为对应的空白样。将空白组于沸水浴
中灭活 5 rain，于室温下冷却，各组管分别加入 1
mg／mL的木聚糖溶液 1 mL，再补水到 3 mL，于6O
℃水浴中恒温 30 rain，冷却后操作 同木糖标准 曲
线，在 498 nm波长下测定吸光度。
1．2．3木聚糖酶米氏常数测定(Km) 用PH6．0的
磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液溶解木聚糖，制备 1
4期 孙宇哲等 ：木聚糖酶菌株的筛选及酶切位点的分析 565
mg／mL的溶液，分别加入各种浓度的木聚糖菌液 1
mL，均补水 1 rnL，60℃恒温水浴 10 min后 ，立即加
入 2 mL DNS试剂沸水浴 5 min终止酶反应，以相
应的灭活酶为空白，测定木糖含量。由速度与底物
浓度的双倒数曲线求出米氏常数。
1．2．4酶切 位点的分析 蔗糖 、异麦芽糖、纤 维二
糖、棉籽糖和水苏糖溶液的浓度均为 1 mg／mL。以
灭活菌液作为空 白。
2 结果与分析
2．1酶解木聚糖菌株的筛选
两份土壤样品没有筛选效果。从剑麻厂废水溶
液中筛选到的酶解木聚糖菌种，在初筛和复筛的平
板上都可以看到清晰的透明圈(图 1)。将带透明圈
的复筛菌落进行划线培养、并保存。
～ 、=
图 1 菌种的初筛和复筛
Fig．1 Primary and secondary screening of strain
售
∞
谢 §
米 8
留量
盘
1．000
800
600
400
200
0．0 0．2 0．4 0．6 0．8 1．0
标准木糖含量 (mg)
The standard content of xyIose
图 2 木糖标准曲线
Fig．2 Standard curve of xylose
2．2木糖标准曲线
用DNS试剂法制作木糖标准曲线(图 2)。
2．3发酵液对木聚糖酶解的单因素优化
发酵液经离心处理可除去其中的菌体细胞，使
释放到细胞外的蛋白酶达到稳定的状态，减少对该
实验带来的影响。当其它反应条件固定时，该酶水
解木聚糖随着温度的升高，吸光度逐渐增大，最佳温
度为 60℃，其后随着温度升高时吸光度反而下降
(图 3)；pH在 6．0时有极大值 (图 4)；反应时间在
30 min时有最大值，以后将保持反应平衡(图 5)；在
此最佳条件下测得木聚糖酶活为 6．494 U／mL。
米 2
蓉
o
《
320
240
160
O 2O 40 60 8O 1OO
温度 Temperature(℃ )
图 3 温度对木聚糖酶水解的影响
Fig．3 Effect of temperature on enzymatic
hydrolysis of xylan
3．0 4．0 5．0 6 0 7 0 8 0 9．0
pH
图 4 pH对木聚糖酶水解的影响
Fig．4 Effect of pH va|He on enzymatic
hydrolysis of xylan
2．4酶解木聚糖最佳菌液量的确定
由图6表明，在酶解的最佳条件下，固定底物木
聚糖的量，通过控制菌液稀释后的用量使吸光度达
到最大平衡值，而通过这个数值的计算不能实现对
木聚糖样品的纯度进行鉴定 ，因此要想完全降解木
聚糖需要多种酶 的共同参与。
2．5米氏常数的测定(Km)
由图 7可以计算出横轴截距一1／Kin一一0．641，
即 Km=1．561 mg／rnL。
2．6酶切位点的推测
由表 1和图 8看出，菌液中含有的酶对非还原
糖(蔗糖、棉籽糖和水苏糖)中的糖苷键没有酶解作
O O O O 0
0 2 6 8
4 3 2 O
一llu∞等一 oc∞口』0∞D《
寒謦
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320
240
160
0 15 3O 45 60 75
时间 Tifle(Ⅲin)
图 5 时间对木聚糖酶水解的影响
Fig．5 Effect of time on enzymatic
hydrolysis of xylan
0．080
0．000
0．0 0．5 1．0 1．5 2 0 2 5
菌液稀释后的用量(mL)
The amount of dj Iuted bacteria sOIutjon
图 6 菌液用量对酶解木聚糖的影响
Fig．6 Effect of amount of strain on enzymatic
hydrolysis of xylan
用；如果对麦芽糖、异麦芽糖和纤维二糖有酶解作
用，那么在酶的存在下，有活酶存在下数据应当为灭
活酶时的2倍，从表中没有该现象，所以该菌也不能
断裂麦芽糖的 a一1，4、异麦芽糖的a一1，6和纤维二糖
p_1，4糖苷键；但是对直链和支链淀粉都有酶解作
用，并且对直链淀粉的作用效果大于支链淀粉，说明
该酶只能酶解 多聚葡 萄糖 (淀粉 )中的 a一1，4糖苷
键。通过该酶对直链淀粉(96 oA纯度)的水解率计算
可知，酶解位点是以 16-~18个葡萄糖为最小单位进
行酶切的，产物为 比糊精更小的葡聚糖。对该酶酶
切位点的初探，将会为木聚糖和淀粉的生物改性成
小分子葡聚糖(大小在 2O个葡萄糖)的低聚糖工业
8O 0
64．0
￡
48．0
之 32
． 0
16．0
0，0
O．0 2．0 4．0 6．0
1／Is](mg／mL)
8．0
图 7 酶反应速度与木聚糖底物浓度双倒数作图
Fig。7 Double reciprocal plot illustrated the relation
between the speedy of enzyme and consistancy
of xylanase substrate
表 1 酶解木聚糖的酶其酶切位点的推测
Table 1 Speculation of zymolytic xylanase enzyme restriction sites
注：吸光波长为 498 ilia。 Note：Absorbance wavelength 498 rim．
倒米留
∞ 加 ∞ 3 20 O O
c∞ r)口oc日0k
划米蓉
o∞0《
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图 8 菌液对直和支链淀粉的作用效果
Fig．8 Interaction of strain with amylose
and amylopectin
a：空白．b，c：直链淀粉与酶和灭活酶；d，e：支链淀粉与酶和灭活酶
a：blank；b，c：amylose with enzyme and amylose with
inactived enzyme；d，e：amylopectin with enzyme
and amylopectin with inactived enzyme
化生产奠定基础。
3 结论
从剑麻厂废水溶液中筛选到 1株含有木聚糖酶
的菌种，经微生物培养基培养、分离，制备成粗菌液。
最佳酶 促反应条 件：温度 6O℃、pH6．0和 时间 3O
min。在此最佳条件下菌液酶解木聚糖证实，它不能
完全降解蔗渣木聚糖，还需要其它多个酶共同参与；
根据菌液对直链淀粉作用的酶切分析，酶切位点是以
16~18个葡萄糖为最小单位进行的，这种低聚糖的
产生可能为今后木聚糖或淀粉的应用开拓新领域。
参考文献 ：
郝再彬 ，苍晶，徐仲．2004．植物生理实验l-M]．哈尔滨 ：哈尔滨
工业大学出版社 ，65—67
程伟，刘太宇，王彩玲．1998．小麦型日粮添加木聚糖酶对生长
育肥猪生产性能的影响EJ]．河南农业科学，(11)：4o一41
Dai Y(代义)，Lv SX(吕淑霞)，Ljn Y(林英)，et a1．2008．Study
on screening and identification of a highly xylanase-producing
strain and the enzyme production conditions(高产木聚糖酶菌
株筛选、鉴定及产酶条件的研究)[J-I．Biotechnology(生物技
术)，18(2)：7O一73
Lian HX(连惠芗)，Wang SH(汪世华)．2006．Application and
study of microorganism xylanases(木 聚糖酶 的研究 与应用)
EJ-I．J Wuhan Polytechn Univ(武汉工业学院学报)，25(1)：42
— 46
Li CX(李彩霞)，Fang GG(房桂 干)，Liu SC(刘 书钗)．2001．
Methods for xylanase activity determination(木聚糖酶酶活的具
体测定方法)[j]．J ch咖 Industry Fore Products(林产化工通
讯)，35(1)：20—23
Wang YC(王彦超)，Hao ZB(郝再彬)，Li zY(李子院)，et a1．2009．
Separation and determination of arnylose and amylopectin from
cassava starch(直、支链 木薯淀粉 的分离 纯化及检 测)EJ]．J
Northeast Agric Univ(东北农业大学学报)，40(3)：47—51
Wong KKY，Tan LUL，Saddler JN．1998．Multiplicity of B_1，4-
xylanase in microorganisms：function and applications[J]．Mi-
crobiology，52：305—317
wu K(吴克)，Liu B(刘斌)，Zhang J(张洁)，et a1．2001．Trichoder—
n1a viride~ylanase purification and properties(绿色木霉木聚糖酶
的纯化和性质)[J]．J Biol(生物学杂志)，18(6)：15—16
Xu ZB(徐志兵)，Zhang Q(张群)，Xia WY(夏万燕)．2002．Applica-
tions of the enzym es to the pulp bleaching (酶在纸浆漂白中的应
用)口]．Industrial Microbiol(2E业微生物)，32(1)：54—56
Yu HM(禹慧明)，Lin Y(林勇)，Xu YL(徐有 良)，et a1．2002．
Breeding of the strain of A．niger with high-yielding xylanase
(木聚糖酶高产菌株选育)I-J]．IndustrialMicrobiol(2E业微生
物)，32(1)：43—44
(上接第 562页 Continue from page 562)
研究)[J]．Chin Trad Herb Drug(中草药)，39(5)：661-664
Li ZL(李占林)，Li DY(李丹毅)，Wu Y(吴瑛)，et a1．2008．An—
tibacterial constituents from the flowers of Trollius chinensis(金
莲花抗菌有效成分)[刀．J Shenyang Pharm Univ(沈 阳药科
大学学报)，25(8)：627—629
Li Q(李钦)，Sheng YM(沈月毛)，Li P(李萍)．2008．Study on
、flavanoids in the leaves of Premna szemaoensis(思茅豆腐柴中的
黄酮类化学成分研究)I-J]．Chin Pharm J(中国药学杂志)，43
(6)：417—419
Ye G(叶冠)，Fan MS(范 明松)，Huang CG(黄 成 钢)．2005．
Pheonlic constituents from the whole plants of Limonium aure-
um(黄花矶松中的酚性化学成分)l-J]．Res Development Natu—
ral Products(天然产物研究与开发)，17(5)：583—584
Yuan JQ(袁经权)，Yang JS(杨 峻山)，Miao JH(缪剑华)．2007．
Studies on flavonoids of Eu torium odoratum(飞机草黄酮类成
分的研究)[J]．Trad Chin ivied Mat(中药材)，30(6)：657-660
Zhou Q(周 欣)，Yang XS(杨小生)，Zhao C(赵超)．2001．Chem—
ical componenm of volatile oil from Blumeae balsamiferae Foli—
um et Cacumen originated from Ouizhou(艾纳香挥发油化学成
分的气相色谱一质谱分析)FJ-I．J Instrurvental Analysis(分析
测试学报)，20(5)：76～78
Zhu TC(朱廷春)，Wen YX(文永新)，Wang HS(王恒 山)，et a1．
2008．Chemical constituents in Blumea balsamifera(I)艾纳香
的化学成分研究(I)[J]．Cruihaia(广西植物)，28(1)：76—78