全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(1)：39— 43 2OO9年 1月
濒危植物峨眉野连 ISSR反应体系的建立与优化
张春平l，何 平 ，胡世俊 ，高 姗
(1．西南大学 生命科学学院 三峡库 区生态环境教育部重点实验室，重庆市三峡库区植物生态与
资源重点实验室 ，重庆 4。0715；2．中国科学院 昆明植物研究所，昆明 65O2O4)
摘 要：针对峨眉野连IssR的反应特点，建立稳定可靠的IssR—PcR分子标记反应体系，为进一步研究峨眉
野连的种质资源遗传多样性奠定基础。通过筛选引物并设定影响峨眉野连 ISSR～PCR反应诸因子的不同梯
度，检测其不同反应体系的扩增效果 ，分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化 ，建立 峨眉野连 ISSR—
PCR稳定可靠的反应体系 。首次建立了可用于峨眉野连 ISSR—PCR分析的最适宜的反应体系：25 L PCR反
应体系中，内含 1×PCR Buffer，1．5 mmol／LMg抖 ，20O m。l／L dNTP，0．3 mol／L引物，8O ng模板，1．o u
Taq DNA聚合酶。扩增程序为 94℃预变性 5 min，然后进行 35个循环：94℃变性 30 s，(据不同引物的退火
温度)复性6o s，72℃延伸 9O s，循环结束后 72℃延伸7 min，4℃保存。所建立的峨眉野连IssR反应体系具
有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点，可以较好地应用于峨眉野连的种质资
源多样性及居群鉴别的研究。
关键词 ：峨眉野连 ；ISSR；建立 ；优化
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1OO0—3142(2O09)O1一O039一O5
Establishmen t and 0ptimizati0n 0f ISSR reacti0n
SyStem t0r encIangeI．ed plant【／lD 0 Z Z 』 n 1 1 1 J ● ● ●
ZHANG Chun_Ping ，HE Ping ，HU Shi—Jun ，GAO Shan1
(1．S DD D厂L Sf P c s，SD“ “ ，KP 60m￡0 ( “r 0， “∞如 )o，Ec0_饥 r0n 0，丁^ P
G0r譬es RPsP r RP 0 ， 0 gq g K L 6。m￡0 0，Pz口 Ecoz0g 盘n ResD“ P 尺PsP口 ，0r丁^ e G0rg Res r伽打
R g 0 ，Chongqing 4OO715，China；2．K“ m g J “如“ 0，B0￡d ，C^ PsP A∞ 研 0，Sf 饥 s，Kunming 65O2O4，China)
Abstract：In 0rder t。study the genetic diversity 0f CDpf s 0m 8 s s germplasm ，ISSR-PCR system of C．Dm 8 s was
established and 0ptimized acc0rding to the characters 0f it．The efects of ISSR—PCR was examined by se1ecting prim—
ers and designing different concentrati。ns of the fact。rs in the ISSR，the reliable systems for C．o7 B B，zs 5 p0pu1ations
researching was established by amlyzing the reasons f。r occurrence of differential bands and optimizing reaction con—
diti0ns．The 0ptima1 ISSR—PCR system in C．0m 8 s s was estab1ished f0r the first time，that is，25 L amplificati0n
reactions system c。ntaining 1×PCR Bufer，1．5 mmoI／L Mg。+，2OO m。l／L dNTP，O．3 m。l／L primer，8O ng tem—
p1ate，1．O U 1 q DNA po1ymerase．The optima1 amplmed procedure was as fol1ows：after a pr denaturing of 5 min at
94℃ ，35 cycles were perf。rmed with denaturing of 3O s at 94℃，annealing。f 1min due t0 denaturing temperature Of
d fferent primer，extension of 1．5min at 72℃ ，a final extension step of 7 min at 72℃ and hold at 4℃． The ISSR_
PCR systems，which were estab1ished in this paper for studying C．Dm已 8 s s，could pr0vide clear reliable abundant
polymorphisms molecular markers and were proved suitable for germplasm resource studying and identmcation of C．
07n e i ．
收稿日期：2。C8一O4—07 修回日期：20O8—1O一2O
基金项目：国家自然科学基金(3。。7。o8O)[Supported by the Nationa1 Natural ence Foundation。f china(3∞7o080)]
作者简介：张春平(1982一)，男，山东潍坊人．硕士研究生，主要从事植物保护生物学和系统进化等方面的研究。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：heping1 96373@1 26．com)
40 广 西 植 物 29卷
Key w0l s：C0声 s 0me ”s s；ISSR；establishment；optimization
峨眉野连( p s 0 沈 )为毛莨科黄连属
多年生草本植物 ，习称“岩连”，为国家二级濒危保护
植物(傅立 国等，1991)，主要分 布在 四川西部 的峨
眉、雅安与洪雅地区海拔 1()OO～1 7O0 m 的隐蔽悬
岩陡壁上。野连性寒、味苦 ，具有清热、解毒 、泻火、
燥湿和良好的抗菌作用。由于其叶片窄长，形似雉
尾，故又有“凤尾连”的美称，野连单枝略微弯曲，表
面黑褐，断面金黄，比家种黄连色泽更深，味道更苦，
质量更优。峨眉野连根茎及叶部的有效成份小檗碱
的含量高于属内其它各种，具值得重视的资源保护
与利用价值 ，但是现在野连居群数量及个体数濒危
稀少，野生资源相当匮乏。目前，对其药理、药化方
面的研究相对较多 (王立群等，20O4；郭志刚等，
2OO4；庄平等，1994)，但是对其种质资源的遗产多样
性研究，特别是运用像 IssR等分子手段的研究未
见报道。本研究 旨在建立重复性好、结果 明显而稳
定的 ISSR反应体系和扩增 程序 ，为进一步对野连
的鉴定和种质资源遗传多样性研究提供有效便利的
方法，为挖掘潜在药物资源和开发新药提供良好
基础。
ISSR由 Zietkiewiez等(1994)创建，是一种建
立在 PCR反反应基础上的 DNA分子标记。近年
来 ，ISSR—PCR已成功用于植物遗传多样性分析(邱
英雄等，2OO3)、DNA指纹图谱绘制(Ammiraju等，
2OO1)、分子生态学研究等领域(Casasoh等，2∞1；
李先文等，2。O6)。该技术无需预知受试材料基因组
序列，成本低、操作简单、灵敏性高且重复性好等优
点，被认为是非常理想的分子标记。研究峨眉野连
居群的遗传多样性时，发现改变 ISSR—PCR反应的
各因子会直接影响到实验结果的稳定性。为此，必
须对峨眉野连 ISSR—PCR的反应体系进行优化，分
析非特异性条带产生的原因，以建立适合峨眉野连
ISSR—PCR反应的可靠体系，为深入开展峨眉野连
种质资源的遗传多样性研究奠定基础。
1 材料
所用峨眉野连采 自我国野连的主产区：四川峨
眉、雅安与洪雅地区。选取当年生嫩叶，低温条件下
带回实验室洗净、晾干，冻于一8O℃的超低温冰箱中
备用。
2 方法
2．1基因组 DNA提取及检测
取新鲜 的野连 叶片 l g，采用改 良后的 CTAB
法提取野连的基 因组 DNA。用 Bio—Rad核酸蛋 白
分析仪测量所提 DNA浓度及纯度，同时用 1．5 的
琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA是否降解。
2．2优化实验设计
优化实验中选用筛选 好的 U8O7为扩增 引物，
对影响野连 ISSR—PCR反应的主要因素进行梯度实
验。分别为TaqDNA聚合酶与Mg 二因素梯度实
验，dNTP、模板、引物单因子梯度实验和引物退火
温度梯度单因子实验。在酶与 Mg 二因素梯度实
验中，Taq DNA聚合酶和 Mg。 分别设置了4个浓
度梯度，二因素交叉共 l6个处理 。引物的退火温度
梯度则是在其 Tm值附近设置 8个梯度进行筛选
(表 1)。
表 l ISSR—PCR反应体 系的实验设计
Table l Design of the experiment for ISSR—PCR
反应成分 C。mposition 反应浓度 Reaction Concentrati0n
M g (mmol·I )
Taq DNA p0Iymerase(U)
dNTPs(mmol·I )
Primer( mol·I )
Temp1ate DNA (ng)
1．O、1．5、2．O、2．5
O．5、1．O、1．5、2．O
1O、20、4O、8O、16O、2OO、3OO、4OO
O．05、O．1、O．2、O．3、O．6、l_2
5、10、2O、4O、8O、12O、160、2OO
2．3 ISSR—PCR产物鉴定
反应产物在含 go1dview的 1．5 的琼脂糖凝胶
中电 泳 分 离，电压 5V／cm。用 DL2OOO的 DNA
marker(1∞～2。OO bp)作为标记，电泳结束后在
Bio—Rad Gel Doc2O0o凝胶成像系统下观察并拍照。
3 结果与分析
3．1基因组 DNA提取结果
所提取的基因组 DNA经电泳后显示出清晰整
齐的条带，表明 DNA并未发生降解。在 Bi0一Rad
核酸蛋白分析仪上测其原始浓度，然后统一将其稀
释至 4O ng／ L，供 ISSR—PCR实验所用(图 1)。
3．2反应体 系中各组分对扩增的影响
3．2．1 Taq DNA聚合酶与 Mg2 对ISSR扩增的影
l期 张春平等：濒危植物峨眉野连 ISSR反应体系的建立与优化 4l
图 l 基 因组 DNA的提 取结果
Fig．1 The result。f genomic DNA extraction
响 Mg计是 Taq DNA聚合酶的依赖性因素，Mg
浓度的大小可直接影响酶活性的发挥 。因此 ，选择
合适的Mg。 浓度，对 PCR的结果至关重要。本研
究采用 TaqDNA聚合酶与 Mg纠一的二因素交叉实
验，设置了 16个处理 。由图 2看出：当Mg。 浓度为
1．O mmol／L时，Taq DNA聚合酶从 O．5～2．O U
均无扩增产物生成 ；当Mg。 浓度达到为 1．5 mH ol／
L时，开始出现条带，并且当酶的量达到 1．0和 1．5
U时均产生清晰地条带，但相对来说酶量为 1．O U
时条带最为清晰，如图2中第 6泳道所示；当Mg
浓度为2．0 mm0l／L时，所扩增的产物有拖尾现象，
形成明亮一片，如第 9～l2泳道所示；当 Mg抖浓度
为2．5 mmol／L时，同样有拖尾现象出现。因此，第
6泳道的组合，即当 Mg 为 1．5 mmol／L，Taq
DNA聚合酶为 1．O U时，整体效果最好。
图 2 Taq DNA聚合酶与 Mg2+对 ISSR扩增的影响
Fig．2 Effect of Taq DNA polymerase and M +
concentration on ISSR amDlmcati0n
(1—4，5—8，9—1 2，1 3—16：1．O、1．5、2．0、2 5 mmol／L M ；
1，5，9，13：O．5 U Taq DNA p01ymerase；2，6，1O，14：1．O U Taq
DNA po1ymerase；3，7，11，15：1．5 U Taq DNA po1ymerase；
4，8，l2，16：2．O U Taq DNA poiymerase)．
3．2．2 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响 dNTP是
PcR扩增的原料，为了寻求最佳浓度，本实验设置
了从 1O～4OO mmo1／L共8个浓度梯度，结果如图3
所示。在 8个浓度梯度 中，1O～2O mmol／L范围内
无条 带 产 生。在 40～ 2∞ mmol／L范 围 内 随着
dNTP浓 度 的增 加 ，条 带 数 量 增加 ，并且 在 2OO
mmol／L时产生的多样性条带数量最多且清晰，如
泳道 6所示 。当 dNTP的浓度达 到 3OO mmol／L
时，仅产生少量条带，并且模糊不清。当浓度达到
400 mmo1／L时基本无条带产生 ，这表示无 PCR产
物生成。因此 ，2。0 mm0l／L的 dNTP为最佳浓度。
3 dN I P浓度对 ISSR扩 增的影响
Fig．3 Effect of dNTP concentrati。n
on ISSR amp】ificati。n
3．2．3引物浓度对 ISSR扩增的影响 引物是选定
模板中特定序列进行扩增的一段碱基序列，引物的
浓度也是决定 PCR扩增的重要因素。本实验中采
用筛选出的U8O7作为扩增引物，共设置 8个浓度
梯度 ，扩增结果如图 4所示。在所设计的 6个引物
浓度范围内皆有条带产生，在 0．O5～0．2 mo1／L
时，产生的多样性条带少且不清晰。引物浓度在
O．6～1．2 mol／L范围时，得到的条带模糊不清。
只有在 O．3 mol／L时，条带最清晰且数目最多，如
泳道 4所示 。所以，0．3 m0I／L被确定为反应的最
佳引物浓度。
3．2．4模板浓度对ISSR扩增的影响 本实验中，模
板设置8个浓度梯度进行扩增，结果如图5所示：模
板对扩增没有太大的特异性。当模板的浓度在 4O
ng、8O ng和 l6O ng时，如泳道 4、5所示。扩增产物
没有太大的影响，只是在浓度大于 16O ng时，出现
轻微的拖尾现象，条带模糊不清。但是，反应体系中
如果模板过少，分子碰撞的机率降低，过多反而又会
产生非特异性产物。所以，本着高效、节省的原则，
选择 8O ng作为最佳的模板浓度。
广 两 植 物 29卷
图 1 引物浓度对 I sR扩增的影H向
Fig．4 EfrecL()f I)rimer c()ncentration
on ISSI{amuMicati(jn
图 摸板浓度对 ISSR扩增的影响
Fig．5 Effect(jf ten1p1 e c。ncentration
0n ISSR amp icati0n
3．2．5退火温度对扩增的影响 退火温度有时候并
不严格等于其 Tm值 ，而是在 Tm值附近波动。在
PCR反应中，过低的温度在保证模板与引物结合的
同时，也使得模板与引物之间未完全配对的位点得
到扩增，产生了所谓的错误扩增。因此 ，在允许的温
度范围内，较高的温度会提高反应的特异性，减少非
特异性产物的生成 。在本实验中，在引物的 Tm值
附近共设置 8个梯度。其结果如图 6所示 ：当在第
j个温度梯度时，扩增出的多样性条带数目多，并且
清晰明亮，可以选为最佳退火温度 。
3．3野连反应体系和扩增程序的建立
通过对上述各反应条件的分析，建立了适合峨
眉野连扩增的反应体系和扩增程序。反应体系为：
25 pL PCR反应体系 中，内含 l×PCR Bufer，1．j
mmol／L Mg 一，2OO mol／LdNTP，0．3 m0l／I 引
物，8O ng模板，1．O U Taq D A聚合酶。扩增程序
为 94。C预变性 j min，然后进行 35个循环：94℃变
㈠ 退火温度对扩增的影响
Fig．6 Effect()f the anneahng ten1peratI】re
gradient()n ISSR a1]1plificati()n
性 3O s．(据不同引物退火温度)复性 6O s，72。C延
伸 9O s，循环结束后 72℃延伸 7 min，4℃保存。
3．4优化体系对峨眉野连的扩增效果
利用此优化体系 ，对 ()个 ISSR引物进行 了筛
选，结果筛选出 18个扩增条带清晰、重复性好、稳定
性高的引物作为正式扩增引物。利用筛选好的引物
U8O7对峨眉野连的 24个个体进行了扩增，结果得
到了背景清晰、多态性稳定 丰富的 D A扩增片段
(图7)，可见优化后的体系可用于峨眉野连的居群
鉴别及遗传结构分析研究。实验 中对来 自 1O个不
同居群的峨眉野连进行了遗传多样性研究，结果得
到峨眉野连的遗传多态性为 77．6 ，各种群间的平
均遗传～致度为 O．647 9，平均遗传距离为 O．388 3，
这明显的表明了野连有比较高的遗传多样性。
4 讨论
高质量的模板是保证 ISSR—PCR成功的基础，
所以模板 DNA的提取是非常关键的，本实验中采
用的是改进后的 CTAB提取法 ，针对峨眉野连次生
代谢产物高的特点，采用氯仿一异戊醇进行反复抽
提的方法，有效地去除了蛋白质和多糖，为下一步扩
增提供良好的模板。
在影响扩增 的众多因子中，酶是一个很重要的
因素，TaqI) A聚合酶的浓度直接决定扩增的成功
与否，没有酶的催化 ，反应无法进行 。因此，寻找合
适浓度的 TaqI) A聚合酶是实验的重要任务。但
是，酶的活性又与 M 相关联 ，合适的 Mg 浓度
又是决定酶活性的重要因素。所以，本实验采用了
酶与 M 。的二因子交叉实验，通过不同的搭配，找
出最适的浓度组合。值得注意的是，不同厂家，甚至
张春平等：濒危植物峨眉野连 ISSR反应体系的建立与优化 43
同一厂家不同批次的酶，其活力都存在着差异。为
了减少实验误差，因该尽量使用同一厂家生产的同
一 批次的酶。
dNTP是扩增 的主要原料，浓度过高会 与部分
M 相结合 ，从 而与酶竞争 Mg ，使得酶 的活性
降低，扩增产物大大减少，并且还会导致 P( R错配，
出现非特异性扩增，影响结果。浓度过低，又会影响
扩增的产量。因此，合适的 d TP浓度也是十分关
键的。本 实验 中，通 过 梯度 设 置，得到 了合适 的
dNTP浓度。
Fig．7 The resI】1t of
由于 ISSR—PCR所用的每条引物碱基组成和数
量是不同的，因此 ，每条引物都有适合 自己的退火温
度。在实验中，每条引物都要单独摸索退火温度，其
基本的原则是逐步递缩法(I)ieffeI1I]ach等，1 998；姜
静等 ，2 O(]3)。即首先没置较宽的温度梯度，找到大
体合适的温度范围之后 ，再把此范围的温度细分 ，直
到找到合适的温度为止。
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