全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(4)：536— 540 2011年 7月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．04．022
融安金柑雌雄配子发育相关性
及 2n配子诱导研究
黄桂香，刘福平，刘丽君，潘介春 ，周 琼 ，周瑞阳*，何新华
(广西大学 农学院，南宁 530004)
摘 要 ：以融安金柑为试验材料 ，观察了 2n花粉 自然发生率、雌雄配子发育过程及减数分裂行为，以不同秋
水仙素浓度及处理时间对花蕾进行 2n配子诱变。结果显示：(1)融安金柑 2n花粉自然发生率为 0．31 ；(2)
花蕾纵径为 0．228~0．270 cm时 ，为花粉母细胞减数分裂 I前期；花蕾纵径为 0．274~0．318 cm时，大孢子处
于减数分裂 I前期 ，而此时花粉母细胞处于减数分裂 中后期至四分体期，融安金柑雌雄配子发育不 同步；(3)
0．25 秋水仙素处理 2 d时 2n雌配子的诱导率为 9．09 ，杂种染色体有加倍现象；(4)0．3％秋水仙素处理 4
d，2n花粉发生率为 0．67 ，2n花粉萌发较 n花粉迟 3 h。
关键词 ：融安金柑 ；花粉母细胞；雌配子体；减数分裂；2n配子
中图分类号：$603．6 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)04—0536—05
Study on the development correlation
and female gametes and the induction of 2n
gamete of Rongan kumquat(F．crassifolia)
HUANG Gui—Xiang，LIU Fu-Ping，LIU Li—J un，PAN Jie-Chun。
ZHOU Qiong，ZHoU Rui-Yang ，HE Xin-Hua
(Colege of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004，China)
Abstract：With Rongan kumquat(F．crassifolia)as the experiment materia1．the process of meiosis and the develop—
ment of microsporocyte，female gametophyte and the natural incidence of 2n polen were observed and buds were in—
duced mutation with colchicine of different concentrations and times．The main results showed that：(1)The propor—
tion of 2n pollen of Kumquat was 0．31 under natural state． (2)When the longitudinal diameter of the bud Was
0．228一O．270 em，the microsporocyte was pre-meiosis I；When the longitudinal diameter of the bud was 0．274—
0．318 cm，the megaspore mother cell was in the early stage of meiosis，and the microsporocyte was in the stage from
meiotic metaphase to tetrad，male and female gametes did not develop synchronously．(3)The induction rate of 2n fe—
male gametes was 9．09 when treated with eolchicine of 0．25 for 2 days．(4)O．67 of 2n po len was observed
when treated with colchicine of 0．30 4 days after treated．It was found that 2n pollen germinated 3 hours later than
n polen and 2n polen tube growth rate was also lower．
Key words：Rongan kumquat(F．crassifolia)；microsporocyte；female gametophyte；meiosis；2n gamete
收稿 日期 ：2010—12-23 修 回 日期 ：2011-03—12
基金项 目：科技部国际合作项 目(2008DFA30900)；广西自然科学基金(桂科 自0991040)；广西研究生创新项目(2008105930901D21)[Suported bv
International Cooperation ProjectsMinistry of Science and Technology(2008DFA30900)；the Natural Science Foundation of Guangxi(0991040)；Project of
Innovation in Postgraduate of Guangxi(20081O5930901D21)]
作者简介 ：~ (1966一)，女(壮族)，广西德保人，博士研究生 ，副教授，主要从事果树种质资源与遗传育种研究
，(E-mail)hguixiang@163．com。
通讯作者 ：周瑞阳，博士，教授，博士生导师 ，(E—mail)ry_ zhou@tom．com。
4期 黄桂香等 ：融安金柑雌雄配子发育相关性及 2n配子诱导研究 537
金柑属(Fortunella)植物共有 4个种 和 2个杂
种(陈杰忠等 ，2003)，其 中，金弹(F．crasiyolia)是
主要的鲜食栽培种 ，融安金柑 (又称融安金桔，融安
金弹)为金弹优 良品种之一 。金柑 一年能多次开花
结果，果实形美色艳 ，有吉祥喜庆之寓意 ，且营养价
值极高 ，是鲜食、加工及观赏的多用果树 。然而 目前
生产上栽培的金柑优 良品种极少 ，严重 限制 了产业
的可持续发展(黄桂香等 ，2006)。
倍性育种是果树重要育种方法之一，多倍体果
树具有果大 、无籽 、抗性强等优点 。2n配子(未减数
配子)对倍性育种具有重要意义(李树贤 ，2008)。植
物的 2n配子参与受精 的结果是有性 多倍化 ，是 自
然界多倍体产生 的主要途径 ，利用 2n配子创造园
艺作物多倍体新种质 引起育种家的高度重视 (张新
忠等，2003)。2n配子在 马铃薯 、毛 白杨 、桑 树 、柿
树、大白菜上已有研究，果树中的甜柿(谷晓峰等，
2003)、草莓 (时翠平等 ，2002)、柑 橘属 (向素琼 等，
2005)等也有关于 2n配子研究的报道。过去认为体
细胞加倍是多倍化 的主要方式 ，同源多倍体来 自二
倍体体细胞的直接加倍 ；异源多倍体则来 自远缘杂
交后体细胞加倍。而现在认识到 自然界 中成功的多
倍体一部分是由于细胞学上 2n配 子作用产生而得
到 。金柑属各种问的 自然变异类型少 ，种质资源创
新利用 的研究不多，2n配子诱导、倍性育种等相关
研究均未见报道 ，由于金柑果实小 ，主栽品种种子较
多 ，直接影响鲜食及加工品质 ，通过 2n配子 的应用
等途径培育金柑多倍体无核大果 品种显得极 为重
要 。为了解金柑 2n配子发生规律和找出诱导 2n配
子的最佳时期及适 宜方法，本研究 观察 了融安金柑
雌雄配子发育过程、减数分裂行为、2n花粉 自然发
生率 ，并 以不同秋水仙素浓度及处 理时间对融安金
柑花蕾进行诱变处理 ，为提高金柑 2n配子的诱变率
及倍性育种和种质创新提供理论参考。
1 材料与方法
1．1材料与试验时间
本试验于 2008~2010年进行 ，试验材料来 自广
西大学农学 院实验基地 5年生融安金柑 。
1．2试 验 方法
1．2．1花粉母细胞减数分裂观察 采用压片法 ，取
适当大小的花蕾 ，剥去花瓣 ，用卡诺液 (95 9／6乙醇 ：
冰醋酸一3：1)固定 24 h，然后转入 70 酒精溶 液
中冷藏 ，观察时，取 出花药用镊子除去花药壁 ，滴一
滴卡宝品红染液，盖好盖玻片，用铅笔头轻敲几下，
在酒精灯上微预热后压片 ，镜检并拍照。
1．2．2 2n花粉 自然发 生率的观 察 采集融安金柑
成熟花粉 ，用显微镜观察花粉粒 ，每个品种观察约 1
万粒 。将花粉分为 3大类 ：第一类为正常花粉粒 ，即
n花粉 ；第二类为 2n花粉粒 ，其直径约是 n花粉 的
1．3倍 ；第三类为败育花粉 ，其直径比 n花粉直径小
1／3或更小 。统计各类花粉的比例。
1．2．3融安金 柑 2n花粉 诱 导 分别 用 0．15 、
0．30 、0．45 、0．60 秋水仙素 ，加适量洗衣粉及
甘油 。用滴液法处理减数分裂前期 的金柑花蕾 ，处
理时间分别为 2、4、6 d。以清水为对照 ，每个组合处
理 6O个花蕾 ，处理后套袋保湿。处理结束后拆除脱
脂棉 ，用清水 冲洗 残 留在花蕾 上的秋水仙 素药液。
待花粉成熟时及时采样回室内观察，每个处理组合
观察花粉粒 10 000粒以上 ，用显微镜观察并测量花
粉粒直径 ，统计正常花粉、2n花粉和败育花粉所 占
比例，比较各组合的处理效果。同时将 2n花粉比例
较高的花粉与未处理的花朵杂交 ，授粉后及时套袋 ，
观察记录 。
1．2．4融安金柑 2n雌配子诱 导 分别用 0．05 、
0．10 、0．25 、0．40 、0．60％的秋水仙素，加适量
洗衣粉及甘油 。用滴液法处理减数分裂前期的金柑
花蕾 ，处理时间分别为 1、2、3 d。以清水为对照 ，每
一 组合处理 60个花蕾，滴药后套袋保湿。以清水处
理 为对照 。
1．2．5授粉及杂种染色体观察 分别用诱导后的混
合花粉与未处理的花朵 、未处理花粉与处理后 的花
朵进行授粉，套袋隔离 。采收所结果实，将各处理最
后采得的果实进行取种催芽 ，用酸解法逐粒观察其
染色体数 目。
2 结果与分析
2．1融安金柑雌雄配子发育与花蕾纵径的相关性
对不 同发育时期的融安金柑花药及胚囊进行压
片及石蜡切片 ，观察结果显示 ：当花蕾纵 径分别为
0．168～O．224、0．198～ 0．260、0．274～ 0．318 cm 和
0．368～0．404 cm 时 ，雌配子发育分别处于胚珠原
基基本形成 、孢原细胞核形成、大孢子减数分裂 I前
期和大孢子四分体时期。当花蕾纵径分别为 0．134
～ 0．184、0．228～0．270、0．286～0．350 CITI和 0．552
538 广 西 植 物 31卷
～0．628 cm 时，雄配子发育分别处 于孢原 细胞分
化、花粉母细胞减数分裂 I前期 、四分体和花粉粒成
熟期。融安金柑花蕾纵径与雌雄配子主要发育时期
的相关性详见表 1。
表 1 融安金柑花蕾纵径与雌雄配子发育的关系
Table 1 The relationship between bud length and development of female gametes of kumquat
注 ：观察 花蕾总数为 120。
Note：The total number of buds in observation iS 120
表 2 自然状态下融安金柑 2n花粉比率
Table 2 The percentage of 2n pollen in Rongan kumquat under natural condition
由表 1可看出，当花蕾纵径 0．170～0．234 cm
时，为花粉母 细胞时期，而此 时胚囊母 细胞 尚未形
成 ；花蕾纵径 0．228~0．270 cm时 ，为花粉母细胞减
数分裂 I前期，雌配子仍处于胚囊母细胞时期；花蕾
纵径 0．264~0．312 cln时，为大孢子减数分裂 I前
期，而此时花粉母细胞处于减数分裂中后期至 四分
体形成期；当花蕾纵径 0．368～0．404时，为雄配子
单核靠边期，而大孢子处于四分体时期。可见，花粉
母细胞减数 分裂前期早 于胚囊母 细胞减数分裂前
期 ，花粉粒最早成熟期早于胚囊成熟期 ，雌雄配子发
育不同步。
2．2 2n花粉 自然发生率
由表 2知，融 安金柑正 常花粉 直径平均 为 35
tm，2n花粉发生率平均为 0．31 。有未减数分裂
的花粉存在，但其发生率很低。
2．3秋水仙素诱导融安金柑 2n花粉效果
不同浓度秋水仙 素浓度处理金柑花蕾，结果显
示 ：除 0．60 处理 6 d的组合没有产生 2n花粉外，
其它的处理组合都产生一定量 的 2n花粉。但所有
处理组合的花 粉败育 率都 比 自然状 态 的高，其 中
0．3 秋水仙素处理 4 d和 0．45％秋水仙素处理 4 d
时，2n花粉发生率分别达 0．67 和 0．61％，比自然
状态下金柑 2n花粉 比率有所提高，是获得 2n花粉
较好 的处理组合(表 3)。
表 3 不同浓度、不同天数的秋水仙素处理
诱导融安金柑发生 2n花粉的效果
Table 3 The 2n pollen rates of Rongan kumquat treated
with different concentrations and days of eolchicine
c
Day N 藿 Rate of
0
0．15
5．28
5．3O
5．43
6．O5
6．12
7．O8
8．11
6．79
7．27
8．32
6．35
8．56
13．96
2．4融安金柑不同倍性花粉萌发动态比较
将含有 2n花粉的混合花粉进行发芽试验 ，结果
如图 1所示 ：在相同培养条件下培养 3 h，n花粉管
萌发率 已经达 6．20 ，而 2n花粉未见萌发，说 明 n
花粉比 2n花粉萌发早。培养 6 h时，n花粉萌发率
为 64．32 ，2n花粉萌发率为 31．57 。培养 9 h
时，n花 粉 萌发 率 为 81．78 ，2n花 粉 萌 发 率 为
弘 铊 髂 ， 吼
3 3 6 O 8 7 2 7 4 1 6 9 3 踮 ∞ s昌鼹 卯
u n u 三三
4期 黄桂香等：融安金柑雌雄配子发育相关性及 2n配子诱导研究 539
72．45 。培养时 间 12 h时 ，n花 粉萌 发率 为 90．
13 ，2n花粉萌发率为 76．21％。随着培养时间的
延长 ，n花粉和 2n花粉萌发率不再增加 。
0 3 6 9 12
培养时间 culture time(h)
图 1 融安金柑不同倍性花粉的萌发率
Fig．1 Germination rate of 3ifferent ploidy
pollens of Rongan kumquat
2．5秋水仙素诱导融安金柑 2n雌配子效果
不 同浓度秋水仙素处理减数分裂前花蕾 ，出现
花蕾脱落现象 ，坐果数也 随着处理浓度的增加而减
少 ，当浓 度 为 0．60 处 理 1 d时 ，枝 条死 亡率 为
15 ，处理时间为 2 d时，死 亡率上升到 25％，处理
时间为 3 d时，枝条死亡率高达 100 。
分别用诱导后 的混合花粉与未处理的花朵、未
处理花粉与处理后 的花朵进行授粉 ，套袋隔离。采
收所结果实，将各处理最后采得的果实进行取种催
芽，用酸解法逐粒观察其染色体数 目。其中以未处
理的融安金柑二倍体 为母本 ，用 2n花粉比例较高组
合的混合花粉授粉，共授粉 6O朵花，坐果率为
46．7 ，共收获果实 28个，种子 84粒，将种子催芽
进行根尖染色体观察，未发现多倍体植株 。
用 n花粉与各浓度秋水仙素诱导 2n雌配子的
表 4 秋水仙素不同浓度处理对杂种后代染色体的影响
Table 4 The influence of different concentrations of colchicines on the chromosome of hybrid
杂交组合
Cross
combination
T
处
r eat day Conc en姜tration N Oof ruit 。 ． 、T r ’ ，() () harvested⋯⋯⋯ 染色体加 种 数 诱变率N o．ofsed M u： 一
w
．
ith double0
r
iv
a
l
t
U
e
t~
(
1t lO i
)
l
ehrom osom e
n× n 0
诱变 旱×n
诱变 早×n
n×诱变 舍
n×诱变 舍
O
O．05
O．1
0．25
0．4
0．6
0．O5
O．1
2 O．25 l1
0．4 7
O．6 O
4 O．3 l5
4 O．45 l3
花朵杂交 ，将收获 的果 实取种催芽 ，观察染 色体数
目。结果显示 ：在浓度为 0．25 ，处理时间为 2 d的
处理组合 中，收获 l7个果 ，其 中有 1个果实 的 1粒
种子催芽后 ，根尖染色体有加倍 ，染色体数 目为 27，
诱变率为 9．09 。其余各处理果实种子催芽后 ，均
未发现有加倍现象。各杂交组合后代染色体观察结
果 见表 4。
3 讨论
本研究结果表明，融安金柑 2n花粉 自然发生率
低 ，平均仅为 0．31％。其 它果树 的 2n花粉 自然 发
生率因不同的树种有较大差异，其中近缘的柑橘属
部分品种的 2n花粉发生率为 0．05 ～2．95 (向
素琼等 ，2O05)。这也许是 目前金柑属资源多数停留
在种的层面上 ，栽培品种 自然变异类型少 ，遗传多样
性少的原因之一 。
2n配子的产生被认 为主要通过减数分裂前 的
加倍 、核重组 (第一次分裂重组和第二次分裂重组)、
缺减数分裂的第一次或第二次分裂 、细胞质早分裂 、
缺第二次细胞质分裂和减数分裂后的融合等途径实
现(Veilleux，1985)，因此要有效地诱 导和提高融安
金柑 2n配子的比例 ，必须 了解其雌雄配子发育及减
数分 裂 过程 ，本 研 究 观察 结 果表 明：花蕾 纵径 为
O 0 O 0 O 0 0 O 0 O 0 9 8 7 6 5 4 3 2
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O O O O O O O O l O O O O
弱 0 骺 n 0 ∞
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540 广 西 植 物 31卷
0．228~0．270 cm 时 ，为花粉母细胞减数分裂 I前
期，是诱导 2n花粉 的最佳时期 ；花蕾纵径为 0．274
～ O．318 cm时 ，大孢子处 于减数分裂 工前期 ，此时
是诱导 2n雌配子的最佳时期 ，而此时花粉母细胞处
于减数分裂中后期至四分体期 。融安金柑雌雄配子
发育不同步，花粉母细胞减数分裂期早于胚囊母 细
胞减数分裂期 ，花粉最早成熟期早于胚囊成熟期。
热激、低温、戊炔草胺、安磺灵、氯仿和秋水仙素
等均可诱导 2n配子发生。果树上常用秋水仙素诱
导且效果较好 (Veileux，1985；从 佩华等，1998；张
新忠等，2003；时翠平等，2002；向素琼等 ，2005；李树
贤 ，2008)。本研究以 0．25 秋水仙素处理 2 d时，
杂种染色体有加倍现象，染色体数为 27，2n雌配子
的诱导率为 9．09 ；0．3 秋水仙素处理 4 d，2n花
粉发生率为 0．67 ，但 2n花粉杂交后代没有多倍
体出现，其原因可能是 2n花粉萌发较n花粉迟3 h
2n花粉管生长速度较慢，自然条件下，2n花粉竞争
不过 n花粉 ，因此阻碍了多倍体后代获得。
秋水仙素诱导融安金柑 2n雌配子获得三倍体后
代 ，但 2n花粉发生率仍很低 ，且杂交 后代难获多倍
体，其原因可能与品种的特性及诱导方法等内外因素
有关，具体原因及改进方法正在进一步探索研究中。
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