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Determination of the seed protein content on buckwheat by means of the dye method

染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量的研究



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 27(6):952— 957 2007年 11月
染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量 的研究
郭玉珍,陈庆富
(贵州师范大学 生物技术与工程学院植物遗传育种研究所,贵阳 550001)
摘 要:以考马斯亮蓝 G250为染料,结合经典的凯氏定氮法测定结果,对影响染料结合法测定蛋白质含量的
振荡时间、温度、考马斯亮蓝溶液浓度等因素进行了研究,并分析了由考马斯亮蓝染料和蛋白质结合后染料结
合量(0D值差)与凯氏法测得的蛋白质百分含量之间的相关性。结果表明:测定的适宜条If牛是:温度15℃,处
理时间50 min,考马斯亮蓝溶液的浓度是0.06 mg/mL。此条件形成的络合物较稳定,重复性较好,并且所测
的染料结合量与凯氏定氮法测得的蛋白质含量间呈极显著的一元线性回归和相关关系。栽培甜养和栽培苦
荞的回归方程分别为:y一15.364x+3.865和y一10.769x+6.287,这两个回归方程差异显著,不能合并,分别
适合于快速估计甜养和苦荞种子的蛋白质含量。
关键词:甜荞;苦养;考马斯亮蓝;回归与相关;种子蛋白质
中图分类号:Q946.1 文献标识码:A 文章编号:1000—3142(2007)06-一0952~06
Determination of the seed protein content on
buckwheat by means of the dye method
GUO Yu-Zhen,CHEN Qing-Fu
(Institute ofPlant Genetics and Breeding,School ofBiological Technology and
Engineering,C-uizhou Normal University,Guiyang 550001,China)
Abstract:Coomassie brilliant blue(ClBB)G25O was used to determine the seed protein content of 25 common buck—
wheat accessions and 20 tartary buckwheat accessions.The results showed that the best conditions to determine the
seed protein content of buckwheat with the dye combination method in this study were:1 5℃ 50 min and the dye con-
centration 0.06 mg/mL.Under these conditions,there are much significant linear regression and correlation between
the dye combination amount and the protein content.The regression equations of the cultivated common buckwheat
and tartary buckwheat are y=15.364x+3.865 and y一10.769x+6.287,respectively,.There are much significant
diference between the two equations,indicating that they fit to be used for calculation of the seed protein content on
the cultivated common buckwheat and tartary buckwheat,respectively.
Key words:Common buckwheat;tartary buckwheat;Coomass~e briliant blue;regression and corrdation;seed protein
荞麦(Buckwheat)属于蓼科(Polygonaceae)荞
麦属(Fagopyrum)(林汝法,1994)。本属约有 16
种,其中栽培种两个:栽培甜荞(F.esculentum)和栽
培苦荞(F.tataricum),两个荞麦种的遗传特性、起
源、生长环境都不同(陈庆富,1999,2001;陈庆富等,
2004),其蛋白质组分及其含量也不尽相同。
荞麦是具较高营养价值和医疗保健作用的小杂
粮作物。唐字等(1990)发现甜养种子蛋白质含量平
收稿日期 :2006-06—06 修回日期 :2006。42-26
基金项目:国家自然科学基金(30270852,30471116);教育部新世纪人才支持计划(NECT2004·-0913);贵州省留学归国人员项目(启动类)(2004#
02)i贵州师范大学重点学生课题(2005)[Supported by the Natural Science Foundation of China(30270852,30471116);Program for New Century
Excelh ntTalents inUniversity(NCET-2004-0913);GuizhouOverseaTalent Project(2004#02);Key StudentProject ofGuizhouNormalUniVer8ity(2005)]
作者简介:郭玉珍(1982-),女,河南商丘人,硕士研究生,研究方向:资源植物学。
*通讯作者(Author for corre8pondence,E-mail:eq{1966@163.corn)
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6期 郭玉珍等:染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量的研究 953
均为 14.32 9/6,苦荞 平均 为 13.15 9/6;刘冬 生等
(1997)对荞麦蛋白质含量研究发现甜荞和苦养种子
蛋白含量变幅分别为 9.38 ~12.83 9/6和 9.27 9/6~
l2.42 9/6,超过玉米、大米等谷类作物,而且人体所需
的氨基酸组成合理、配比适宜,营养全面(Radovic
等,1999;Rout等,1999)。此外,荞麦还含丰富的黄
酮、氨基酸和维生素(孙毅刚等,2000;贾冬英等,
1998;张宏志,1995),被列为我国八大亟待开发的保
健食品(尤新,1999;米宏伟,2005)。
目前已报道关于荞麦蛋白质含量研究方法的
有:经典的凯氏定氮法(回瑞华等,2004;刘冬生等,
1997)和双缩脲法(刘邻渭等,2004)。但凯氏定氮法
和双缩脲法存在灵敏度低、操作烦琐等缺点,而染料
结合法作为一种测定蛋白质的方法,有许多独特的
优点:灵敏、简便、干扰物质少、不污染环境等,使其
越来越受到青睐。早在 70年代,Parial等(1970)采
用染料结合法对小麦蛋白质和 Lys的含量进行研
究。姜延程等(1994)采用染料橙红 G对小麦蛋白
质含量进行初步研究。但染料结合法所选用染料不
同,所得结果可能有一定差异。因考马斯亮蓝染色
法具灵敏度高,测定快速、简便,染色后颜色在 2 h
内稳定性好,干扰物质少等优点,本研究拟以荞麦为
材料,以考马斯亮蓝为染料,结合凯氏定氮法,研究
两者在测定蛋白质含量上的相关性,以便找出测定
荞麦种子蛋白含量简便快速有效的检测方法,为养
麦育种中测定荞麦种子蛋白质含量提供新的手段。
表 1 甜荞实验材料
Table 1 Common buckwheat accessions
1 材料和方法
1.1实验材料及试剂
随机选取种子蛋白质含量高低不等的栽培甜养
25份、苦荞 20份(表 1、2)。所有材料都由贵州师范
大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所提
供。考马斯亮蓝 G250溶液的配制:用天平准确称
取考马斯亮蓝 0.06 g,加 85 磷酸 100 mL、95 9/6乙
醇 50 mL,混匀直至染料完全溶解,再定容至 1 000
mL,得浓度为0.06 mg/mL的考马斯亮蓝溶液。采
用同样方法配制浓度分别为0.02、0.1 mg/mL的染
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料溶液。
1.2实验方法
1。2.1实验最佳务件的探讨 随机选用六个蛋白质
含量高低不同的甜荞品种和苦荞品种(表 3、5),每
个品种取约 0.5 g荞麦于瘦果,去壳、粉碎、混匀后,
准确称量(O.O2 g),于振荡培养箱中控制转速为 150
r/rain,染料体积为 4O mL,在不同振荡时间(20、50、
8O、110 min)、温度(15、30、45℃)、考马斯亮蓝浓度
(O.02、0.06、0.1 mg/mL)处理 后 ,静 置 4 min,于
755B型紫外可见分光光度计 595 nm处测得考马斯
亮蓝与蛋白质结合后染料结合量(OD值差),以原
液作对照,分析结果,并找出最佳的测定荞麦蛋白质
含量的条件。
1.2.2荞麦样品的测定 取 25份栽培甜荞和2O份
栽培苦荞分别称取约 1.0 g,制备样品后平均分为两
份,一份(O.2 g)按凯氏定氮法测定蛋白质含量,测
定方法参见杨建雄(2002);另一份(O.O2 g)加入 5O
mL考马斯亮蓝溶液,按上述最佳条件处理,测得
OD值差,即染料结合量(x)。
1.2.3数据 分析及建立回归方程 采用 SPSS11.2
统计分析软件分别对 25份甜荞样品和 2O份苦荞样
品的考马斯亮蓝染料结合法所得的 OD值差(x)及
同一批样品凯氏法测得的种子蛋白质含量(y)进行
一 元回归与相关分析,分析方法见杜荣骞(2003)。
表 2 苦荞实验材料
Table 2 Tartary buckwheat accessions
2 结果与分析
2.1温度和时间对染料结合法的影响
随机选用 E04、Ell、El4、El5、El6和 E25六个甜
养品种(表 3),在染料浓度为0.06 mg/mL,不同温度
(15,30,45℃)和不同振荡时间(20,50,80,110 min)
处理条件下,对由考马斯亮蓝染料结合法测得的染料
结合量(x)与凯氏定氮法测得的蛋白质百分含量(y)
之间的相关性进行研究,测得的数据以及与蛋白质含
量间的相关系数及显著性检验结果见表 3。
从表 3看出,时间和温度对染料结合法均有影
响。在一定的温度下,考马斯亮蓝与蛋白质结合后
在两个小时内保持稳定,在前 20 min内吸光度值一
直处于明显的上升阶段,20 min后就相对较稳定。
温度既可以提高结合速度、缩短实验周期,又可以提
高反应程度,在 45℃时 20 min内就使反应达到平
衡,20 min以后形成的结合物在较高温度下有部分
分解,所以测得的吸光度值不太稳定。
从相关系数 r看,在不同时间及温度条件下,测
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得的 OD值差(x)与蛋白质含量(y)间都呈极显著的
相关性,且各 r值间无显著差异,说明各个实验条件
都能用来测定蛋白质含量,但从最优角度考虑,本实
验选择 r值最大时的实验条件,即振荡时间50 min,
温度 15℃。在此条件下所得结果重复性较好。
2.2染料浓度对染料结合法的影响
为探讨甜荞和苦荞蛋白质含量测定中对染料浓
度是否有不同要求,本实验选择了蛋白质含量高低
不等 的六个 甜 荞 品 种 (E04,El1,El4,El5,El6,
E25)和六个 苦荞 品种 (T08,TI5,TIO,T06,TI2,
Tl1),在不同的考马斯亮蓝溶液浓度(0.02,0.06,
0.10 mg/mL)处理 下,振荡时间 50 min和温度 15
℃时进行实验。其染料结合法测得的染料结合量
(x)见表 4、5。
表 3 甜荞种子蛋白质的染料结合量(x)与蛋白质含量(Y)间的回归关系
Table 3 Regression relation between the dye combination amount(x)by means of
the dye method and protein content(y)by the Kjeldahl method
注:一 表示在0.O1水平上差异极显著,经 t检验各 r 间差异不显著。下同。
Notes: represents significance at 0.01 leve1.There are no significances among rxy value by T test.The same below.
表 4 甜荞种子蛋白质染料结合量(x)与其种子蛋白质含量(Y)间的回归关系
Table 4 Regression relation between the dye combination amount(x)by means of the
dye method and protein content(y)of common buckwheat by the Kjeldahl method
表 5 苦荞种子蛋白质染料结合量(x)与其种子蛋 白质含量(Y)间的回归关系
Table 5 Regression relation between the dye combination amount(x)by means of the
dye method and protein content(y)of tartary buckwheat by the Kjeldahl method
从表 4、5可看出,考马斯亮蓝溶液的浓度可影
响蛋白质与染料的结合,浓度越高,与蛋白质的结合
量越多,OD值差越大。在各浓度条件下,染料结合
量(x)与蛋白质含量(y)间的相关系数 r 都达到了
极显著水平,而且经 t检验,各 r值间差异不显著。
显然,实验所有染料浓度在本实验条件下都可
以用于荞麦种子蛋 白质含量的测定 。为此选择了苦
荞 最大而甜荞 r 较大的染料浓度 0.06 mg/mL
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作为较好的处理浓度,此时所得结果有较好的重复
性。因此本研究选择振荡时间 50 min、温度 15℃、
考马斯亮蓝溶液的浓度为0.06 mg/mL作为本研究
的处理条件。
2.3染料结合法测得的栽培荞麦种子蛋白染料结合
量(x)与凯氏法测得的蛋白质含量(Y)问的相关分析
在振荡时间 50 min,温度 15℃,考马斯亮蓝溶
液的浓度为 0.06 mg/mL条件下,用考马斯亮蓝染
V



·皿

色法测得供试的25份栽培甜养和20份栽培苦养种
子粉的染料结合量以及同批样品用凯氏定氮法测得
的蛋白质百分含量,结果见表 1和表 2。分别分析
甜养和苦养的染料结合法测得的 OD值差(x)和同
一 批样品的蛋白质含量(y)间的回归关系,得出回归
方程(图 1)。并进行回归方差分析和回归系数的显
著性检验(表 6、7)。
表 1、2可看出,考马斯亮蓝溶液与蛋白质结合
y(%)
2O
16
12
8
8 0 3 0.5 0,7 0 9 1 .X 4 0
. 2 0,4
蛋白质OD值差 (x)
图 1 甜荞和苦荞种子蛋白质 OD值差(x)和蛋白质含量(y)间的一元回归方程的直线图
Fig.1 Simple linear regression equations and linear figures of common buckwheat and tartary buckwheat
a.甜荞(common buckwheat);b.苦荞(tartary buckwheat)。
表 6 甜荞和苦荞一元回归方程的方差分析
Table 6 Variance analysis on the linear regression on
common buckwheat and tartary buckwheat
类型
Species

S

ou

rce
源 平
Su

m
和of自皇度M均e方an F
va

lue df
squares squares
甜荞 Common 回归
buckwheat 误差
总和
苦荞 Tartary 回归
buckwheat 误差
总和
后溶液的 OD值差和蛋白质含量成极显著的正相
关,样品蛋白质含量越高,溶液的颜色越深,OD值
差越大。从分析结果可知,甜养和苦养的回归方程
(图1)分别为: 一15.364x十3.865和 一10.769x
+6.287,相关系数分别是 r一0.936和r=0.940,对
回归方程的方差分析和回归系数的显著性检验(表
5、6)都达到极显著水平,即是考马斯亮蓝染料结合
法与凯氏定氮法所测得的结果呈极显著的正线性关
系,且相关性很好。
对甜养和苦养的一元回归方程计算得出的养麦
种子蛋白质含量与凯氏定氮法测得的蛋白质含量间
配对数据进行显著性检验,tE=dE/Sa一0.0008/
0.1388—0.0060.016/0.1493 l=0.107归方程所得的养麦蛋白质含量与实际蛋白质含量之
间差异不显著,可以用考马斯亮蓝染料结合法代替
经典的凯氏定氮法测定蛋白质含量。
表 7 甜荞和苦荞一元回归方程的回归系数显著性检验
Table 7 Significant test of regression coefficient on
common buckwheat and tartary buckwheat
2.4栽培甜荞和栽培苦荞的一元回归方程的比较
对栽培甜荞的一元回归方程 =15.364x+
3.865和栽培苦养的一元回归方程 =10.769x+
6.287进行比较前,先测验二者误差方差之间的差
异显著 F= = =1.093.22,所以两者有一共同的误差方差,则合并均方
MS = {专詈 ,对其回归系数
b进行检验,自由度 df=rl 一2+rlz一2 25 2+20
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6期 郭玉珍等:染料结合法测定养麦种子蛋白质含量的研究 957
— 2— 4 ,t 一 cb 一 b。, 三 =
3.O5>t .。.。 =1.96,甜养和苦养的回归系数差异显
著,说明甜荞和苦养的回归方程不能合并。
3 讨论
本文首次采用考马斯亮蓝 G250为染料,结合
经典的凯氏定氮法对栽培养麦蛋白质含量进行研
究,并对影响染料结合法的一些因素进行了初步分
析。结果发现,在本研究条件下染料结合量与蛋白
质含量间都存在极显著的相关性,可以用来测定种
子蛋白质含量,而且发现染料结合法在测定养麦种
子蛋白质含量时适应范围宽,受环境条件影响小。
姜延程等(1994)采用染料橙红 G法对小麦蛋白含
量研究时发现 :温度为 25±5℃ 、处理时间为 1.5 h,
染料浓度 0.04 为最适操作条件,且蛋白质与染料
结合后剩余染料的残留光密度值与凯氏定氮法测得
的蛋白质含量问存在 良好的负相关性,本研究结果
与此相似。
本研究发现栽培甜养和苦养染料结合法测得的
OD值差与同一批样品测得的蛋白质含量间均存在
良好的正相关性,其回归方差分析和回归系数的检
验都达到极显著水平,且栽培甜养和栽培苦养符合
不同的回归方程,暗示其蛋白质组分和比例可能不
同。此法灵敏、方便、快速,分别适合甜荞和苦养的
蛋白质含量测定。这些结果对于快速测定养麦蛋白
质含量,筛选高蛋白质株系(或品系)和高蛋白养麦
遗传育种研究有重要意义。
但是从实验结果可以看出,本研究染料结合法
以CBB G250为染料时,测得的蛋白质含量与凯氏
定氮法之间尚存在一定的误差。从本实验结果和过
程的分析看,可能原因是:(1)染料主要是与蛋白质
中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残
基相结合。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨
基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染料结合法用于
不同蛋白质测定时会有一定的偏差。(2)通过测定
595 nm处吸收度的增加量可知与其结合蛋白质的
量,本研究在操作过程中静置时有一定蛋白质同荞
麦粉一起被沉淀下来,溶液中与染料结合的蛋白质
含量减少,使测定结果偏低。据国外文献报导(Par—
ial等,1970),染料结合法在测定蛋 白质含量高于
12 时的样品时,表现出的误差较大,本研究用考马
斯亮蓝 G250染料所测定样品的蛋la质含量较高
时,也有可能会有一定误差。对于此方法存在的上
述问题,有待于进一步的研究和改进。
致谢 本研究中贵州师范大学生物技术与Z-程学
院张宇斌、宋庆发老师提供了部分器材,贵州师范大学
生物技术与Z-程学院植物遗传育种研究所潘守举、李
建辉 、王甜、张以忠、任翠娟、盛茂银、王爱国给予了不
少帮助和支持。
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9O2 广 西 植 物 27卷
以达到一种生理平衡。而在重金属胁迫下,这种活
性氧的产生与清除之间的平衡会被破坏,植物细胞
清除能力下降,活性氧增加。徐勤松等(2002)认为,
铬胁迫严重破坏了体内抗氧化酶系统,尤其是 SOD
的活性,使植物体内积累 OT,加剧膜脂过氧化作用。
本实验也得到类似的结果,我们推测铬对烟草组培
苗的毒害,是破坏了烟草组培苗体内的保护酶系统,
使 SOD活性下降,POD先上升后下降,O_和Hz02
图 5 铬对烟草组培苗生长的影响
Fig.5 Efects of Cr +o1 the growth of tobacco by tissue culture
等活性氧在体内累积,引起膜脂过氧化,膜透性增
大,产生大量 MDA影响细胞代谢,最终影响烟草组
培苗的生长。
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