全 文 ：固 一
广 西 植 物 Guihaia 20(2)：172—1 76 2000年 5月
文章 编号 ；1000-3142(2000)02一O172—05
离子注入对萝 卜过氧化物酶、淀粉酶
和蛋白酶 同工酶的影响
／
李金 ，叁佥炷 魏明卉，徐润华，王林嵩
(河南 师 范大 学生 命科 学学 院 ．河 南新 多 453002
舶 f io3 6
摘 要：研究了氨离子和氩离于注人萝 卜种 子对萝 卜幼苗蛋白音量 、过氧化物酶活性 及过 氧化物
酶 、淀粉酶和蛋白酶同工酶的影响。结果表明 离于注^后 ，减低萝 卜过氧化 物酶活性和蛋白音量。
萝 卜不同生 长时期同工酶 变化不一样。在 于叶时期 ．过氧化物酶同工酶谱带无明显变化．淀粉酶 同
工酶有酶带 的消失；而在真叶时期 ．过氧化物酶 在负极 区减少一条酶带 ，Rf为 0．22，正极区增加
一 条酶带 ，Rf为 0．6一且随剂量增加 ，酶 带着色增强 ；淀粉酶 同工酶在注^剂量 为 5Xl0 N一／
cm )时 一有同工酶带增加 一Rf为 0．61。低剂量时蛋 白酶活性增强 ．谱带增多 ．太剂量则减弱 。因
此 一N 和 Ar一注人后 ，可影响萝 h过氧化物酶和淀粉酶的表达及蛋 白质的台戚或降解。
关曩词：皂王堡 ；苎上；可溶性蛋白；连墨堡塑箩；淀粉酶；蛋白酶 品种设良 吲l哟 }
中囤分类号 ：Q946．5 文献标识码 ：A
Effects of ion impl antation on peroxidase，
amyl ase and protease isoenzyme in radish
LI Jin—ting，ZHU Ming—wei，W EI Ming—hui，
XU Run hua，W ANG Lin—song
(Colege of哳 Sciem-e—Hen Ⅳ0 Urd~rsity．Xinxiang、453002．China)
Abstract：The effects of ion implantation on contents of soluble protein，activities of peroxida靶 and
peroxidase，amylase and pmtease isoenzyme pattern in radish were studied．The resu[ts show thar．a
ter ion imp[antation，contents of soluble protein and activities of peroxidase in the experimental group
are apparently lower than in the control group，Besides．there are differences of isoenzyme patter
during different growth period．During cotyledon period．peroxidase isoenzyme pa ttern had not obvi
ously changed，but a band of amylase isoenzyme pattern disappeared．During euphylis period ，a band
(Rf 0．22)of peroxidase isoenzyme disappeared in the positive electrode area．and the intencltv 0f pe r-
oxidase isoenzyme band is enhanced a the ion implantation dose increased．A Flew band (Rf：0．61)of
amylaseisoenzyme has been occupied attheionimp[antation dose of 5X10 N ：／cm ：． Low dose ofi。n
收 稿 日期 ；l999—10-O8
作者简介：李金亭 (1962一)一女-实验师-在中心实验室从事生物科研工作 魏明卉现工作单位 ：南 阳师专
基 金璃 目；河 南 省教 委 自然科 学基 金资 助项 目 1999180016)
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2期 李金亭等：离子注入对萝 过氧化物酶 、淀粉酶和蛋白酶同工酶的影响 173
implantation coutd eBhaBce activity and increase bands of protease isoenzyme These suggest that：N
and Ar— ion implantation can affect the expression of peroxidase or amylase and the synthe~s and
degradation of proteins．
Key words：Radish；[on imp[antation；solubte proton：peroxidase；amylase；protease．
同工酶分析是现代遗传、生理生化研究的重要手段之一 ，大量研究已证实过氧化物酶作
为一种适应性酶，能反映植物生长发育的特点、体内状况以及对外界环境的适应性“ 。离子束
作为一种新技术应用于生物品种改良的研究是 由中国科学院等离子体物理研究所于 1 986年
开创的，这些年来 ，这方面的研究在理论和实际应用上都取得了一定进展，研究对象包括植
物、动物、微生物。： 将离子注入应用于水稻、蕃茄、小麦 、棉花、玉米、烟草、等品种改良，
取得了不同程度的进展。 ，但离子注入萝 种子引起诱变在国内尚末报道
本实验是用 N 和 Ar 注入萝 种子对其进行研究，以观察离子注入对蔬菜产生的生物
学效应 ，为蔬菜品种改良提供科学依据。
1 材料及 方法
1．1样 品制备
所用材辩为辽宁蔬菜种子公司产的 501水萝 ，经郑州大学离子束生物工程实验室用
TTTAN 离子注入 机对 501水萝 种子进行 N 和 Ar 注入 处理 。处 理剂量详 见表 1
以未经处理的萝 种子作为对照 ，处理后种子分别进行室内培养及大田种植。
1．1．1室内培养 将对照和离子束处理的
种子分别放置以沙石作为培养基 的培养皿
中，保持一定的湿度，温度维持在 20。c左
右，培养 10 d，幼苗长至 6～7 cm，子叶完
全伸展，分别取各培养皿中的子叶 3 g和茎
6 g，按 3 z 1比例 加 入 pH7．0(0．01 mol／
裹 l 不 同 离子 注 ^剂 ■
Table 1 Dose 0f djfferent joft beAm implantat Lon
离子种类 能量 离子注人嗣量 (N (At一) m )
Ion kind Endrgy Ion implantation dose
N 30 KeV S× 10 10X 10 15x 105
Ar— B0 KeV 5× 10 10× 10s 1Sx 10s
I )PBS缓冲液，加石英砂后冰浴研磨成匀浆 ，1 000 r／rain，4。c离心 15 min，取上清液放入
一 18。C冰箱中保存备用
1-1．2大田种植 待种子萌发长至 5片真叶时，取对照及 N 离子注入组的样品各 5个样品．
样品与缓冲液比例为 3．：1，加石英砂后 ，冰浴研磨成匀浆 ，l 000 r／min，4 C离心 l 5 min，
取上清液放入一18。c冰箱中保存备用。
1．2过氯化物酶及淀粉酶同工酶测定
过氧化物酶、淀粉酶同工酶分析采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法，浓缩胶浓度为 3 ，
分离胶浓度为 8 过氧化物酶同工酶分析时，加样量为 120 (鲜重)，淀粉酶同工酶分析
加样量为 140 (鲜重)。电泳开始时电压为 100 V，待指示剂进入分离胶后 ，电压调至 200
V，指示剂距胶板前沿 l cm左右时，停止电泳 过氧化物酶、淀粉酶同工酶染色方法参照胡
能书“ 方法并做改进
1．3蛋白含量、酶活测定
可溶性蛋白含量及过氧化物酶酶活测定方法参照张龙 方法并傲改进。
1．4蛋白酶同工酶测定
按 Neuhaus—Steinmetz“ 等的活性电泳 (G—PAGE)方法进行 将 0．083 的明胶共聚于
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174 广 西 植 物 2u卷
10 聚丙烯酰胺凝胶里，在 4。C进行电泳 ，电泳毕 ，将胶
板 放 入洗涤 液 中 (3．03 g Tris—base，1 2 ml Tr[tonX 100，
500 m1 双蒸水 ，pH7．0)30 rain，每 5 m[n振 荡 1次 ，然
后用双蒸水洗 3次。洗毕将胶板放人孵育液中(0．1 tool／
I glycm，5 mmol／l CaCl2，pH 分别 为 4．0、7．0、8 5)
37 C 24 h，按 Laemml[。：方法 固定 、染色 、脱 色 。
结 果
2．1离子注入对萝 I-幼苗可溶性蛋白含量的影响
离 子注 入后 ．室 内培 养和大 田种植 的各 处理 组可溶
性蛋白含量均比正常对照组蛋 白含量显著降低 。随剂量
增 加 ．各处 理组蛋 白含 量变 化不明显 。详 见图 1。
2．2离 子 注入对 过氧化酶 活性 的影 响
离子注 入随剂量 的增加过 氧化物 酶 比活逐渐
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l刳 1 不 同离 子束 处理 对 箩 蛋 白台 量的 影响
￡ 1 Effect of 1re nt of different iomc
bunch 0n the content~of p~ tei,i in，adl h
降低 ，5x10 N ／cm 剂量注人 引起酶比活下降 ；
了 34．2 ，1O×10 N一／cm 剂量 注人引起 酶 比活
下 降 了 35．1 ．1 5×10 N ／cm 剂量注人 引起酶 ：
比活下降了 35．9 。详见图 2
2．3离子 注入 对过 氧化 物酶 和淀粉 酶 同工 酶谱 的 ．
影响 誊 埘州 。=
2．3．1离子 注入对 淀粉 酶 同工 酶谱和影 响 室内 索刊 。。 “ ⋯。、。
培 养 ：由淀粉 酶 同工酶 电泳染 色结果来 看 ，在 子叶 图2 N-处理对POD活性髟响
酶谱中．与对照相 比，离子柬处理后消失一条酶 ‘2 { c 。f 呲彻 en ⋯ y of
带 ，Rf为 0．22，茎酶谱 变化则 不明显 。大 田种 植 ：
与对照相 比，低剂量离子束处理后在该区出现
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2期 李垒亭等 ：离子注入对萝 过氧化物酶、淀粉酶和蛋白酶同工酶的黪响 J j
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随剂量增加，该酶带酶活有增加趋势。详见图 6。
2．4离子 注入 对蛋 白酶 同工酶 的影 响
氮离子注入后 ，经大田种植的萝 真叶的蛋白酶同工酶谱与淀粉酶同工酶谱变化类似，即
小剂量注入可以引起酶活性增加 谱带增多；随剂量增加 ．酶活性降低 ，谱带减少；蛋白酶
同工 酶 的最适 pH为 7．0。详见 图 7。
= j C==】 c C==1 o 4
E Cj C] C] o436
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图 4 离子 注 ^后 萝 h真 叶淀 粉酶 同工 酶谱
Fig 4 Amy[a~ isce~yme pattern PAGE Ln euphylls
of radish after ionic t ⋯ t
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竺竺竺竺竺曼竺J。。。。。一。
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图 5 离 子 注^ 后 萝 h子叶 过氧 化 物酶 ¨ L酶
Fig Peroxidase isoe~ yme pattern。 PAGE in r。 ylec,’L
of radish after ionic[rea~DReRt
l 2 3 4 I 2 3 4
子 叶 茎
图 6 离子 注^后 萝 真 叶过 氧化 物酶 同工 酶谱 圈 ? 离 子注 ^后 萝 真叶 蛋白 酶刷 『l酶 瀚
Fig 6 Peroxid~e e pattern of PAGE in euphyli~ Fig ? Prmease i~ nzyme pattern PAGE in euphyhs
0f rad[sh after ionic treat⋯ t 0f radish after~onic l~ tmen[
利用离子注入的生物效应用于诱变育种，已在我 国取得长足进展．低能离子在与靶分子
作用时，可 由于碰撞将电荷传递给靶分子，引起其化学结构变化，从而导致 DNA突变和肪止
DNA双链断裂 ，产生基因表达的变化 这种变异表现在子代可以产生新的品种，在受照射
的当代可以引起蛋白质生物学性质的改变 本实验表明：在离子注入后 实验组蛋白含量明
显低 于对照组 ，有可能是由于离子注入后使蛋白质合成减少或分解增强 ，同样我们也发现过
氧化物酶 活性在处理 组明显 低 于对 照组 ，离子注 入造成 的是 局部损伤 ，因此照 射部位对 引起
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I 76 广 西 植 物 20卷
生化、遗传变化应是举足轻重的。程备久等人“ 报道：经离子注入的花粉管出现畸形，过氧
化物酶活性增强与注入剂量成正 比，而在本实验中 ，过氧化物酶活性在不同个体间存在明显
差异 ，总趋势是在离子注入后不同生长时期表现不一样。不同离子注入也不同，在子叶时期 ，
在 15×10 N ／cm 剂量有增强过氧化物酶活性，而在 10×10 Ar。／cm 有增加过氧化物酶活
性 ，对同工酶谱带数且无影响，而在真叶时期表现为负极区消失一条酶带 ，正极区增加一条
酶带 ，并随剂量的增加而活性增强。淀粉酶同工酶则表现为子叶时期有同工酶带的消失，而
真叶时期在 5×10 N ／cm 剂量时有同工酶带的增加。蛋白酶也有类似变化，表明氮离子注入
后对萝 体内的水解代谢有显著影响，低剂量的氮离子注入可引起淀粉酶和蛋 白酶同工酶谱
带增多和活性增加 ，大剂量可使谱带减少、活性减弱的现象说明低剂量的氮离子注入对萝
体内分解代谢有促进作用，有可能为损伤修复提供能量及清除变性之蛋白质。已有报道“”，只
有在离子注入达种子胚后才能产生诱变 ，本实验也证明离子注入后 由于注入部位不同，不 同
个体之间产生的变化不一，产生酶谱带变化的则有可能是离子注入引起 DNA的变化 ，而仅有
酶活性改变的则有可能是离子注入所导致的蛋白质结构与生物功能的变化 。若要达到诱变育
种的目的，则需用大剂量的离子注入，而小剂量离子注入则有可能为改善植物生长发育提供
新途径 。
由于离子注入是一门新技术 ，其作用机理尚未完全清楚，同时在生物体发育的不同时期
同工酶谱本身存在着差异 ，而且离子注入在不同个体之间存在差异 ，因此在以同工酶作指标
时，其取材时间及部位均需精确确定。
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