全 文 ：书广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ ３２（５）：５９３－５９８ ２０１２年 ９ 月
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０５．００５
华顶杜鹃ＩＳＳＲ反应体系的优化
及亲缘关系的初步分析
颜士辉，郑蔚虹＊，丁炳扬
（温州大学 生命与环境科学学院，浙江 温州３２５０２７）
摘 要：以华顶杜鹃为材料，利用单因素试验确立适合华顶杜鹃ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的优化反应体系：在２５μＬ反应体
系中，Ｍｇ２＋１．５或２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ ０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，引物０．４０μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶ｌＵ，模板ＤＮＡ ４０
ｎｇ；分析ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、模板ＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度及退火温度对ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应的影响。ＰＣＲ扩增程序：预变性９４℃３ｍｉｎ；变性９４℃４５ｓ；退火（Ｔｍ＋２）℃（根据引物不同设定）
７５ｓ；延伸７２℃１．５ｍｉｎ；４０个循环；继续延伸７２℃１０ｍｉｎ；１．５％琼脂糖电泳分离ＰＣＲ产物。并以优化好的
体系初步分析华顶杜鹃及５个近缘种（茶绒杜鹃、Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｍａｙｅｂｒａｅ、Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ、南平杜鹃和映山红）
的亲缘关系，６个种明显地聚为２大类：Ａ类含有映山红、南平杜鹃；Ｂ类含有茶绒杜鹃、Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ、Ｒｈ．ｍａｙ－
ｅｂｒａｅ与华顶杜鹃，为明确华顶杜鹃的系统地位提供可借鉴的依据。
关键词：华顶杜鹃；ＩＳＳＲ；优化；亲缘关系
中图分类号：Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０５－０５９３－０６
＊ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｆｏｒ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ
ＹＡＮ Ｓｈｉ－Ｈｕｉ，ＺＨＥＮＧ Ｗｅｉ－Ｈｏｎｇ＊，ＤＩＮＧ Ｂｉｎｇ－Ｙａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｚｈｏｕ ３２５０３５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅ－
ａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ，ａ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ＩＳＳＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎ－
ｃｉｎｇ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍｅｒ，ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ，Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＰＣＲ ｃｙｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｏｗ ｉｎ ２５μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：
１×ｂｕｆｆｅｒ，Ｍｇ２＋１．５ｏｒ ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ ０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐｒｉｍｅｒ ０．４０μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１Ｕ，ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ４０
ｎｇ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｗａｓ：３ｍｉｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ（９４℃），ｆｏｌｏｗｅｄ ｂｙ ４０ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ４５ｓ（９４
℃），７５ｓ［（Ｔｍ＋２）℃，ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ］，ａｎｄ １．５ｍｉｎ（７２℃）．Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｂｙ ａ ｆｉｎａｌ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ １０ｍｉｎ（７２℃）．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ １．５％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ．Ａｃ－
ｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ６ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｌａｒｇｅ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｈ．
ｓｉｍｓｉｉ ａｎｄ Ｒｈ．ｎａｎｐｉｎｇｇｅｎｓｅ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｈ．ｒｕｆｕｌｕｍ，Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ，Ｒｈ．ｍａｙ－
ｅｂｒａｅ ａｎｄ Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ａｎｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｏｕｌｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏ－
＊ 收稿日期：２０１２－０４－１０ 修回日期：２０１２－０７－１２
基金项目：国家自然科学基金 （３０３７０１０６）；温州大学课题 （２００５Ｌ０１３）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（３０３７０１０６）；
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（２００５Ｌ０１３）］
作者简介：颜士辉（１９８３－），男，浙江建德人，硕士，遗传学专业。
＊通讯作者：郑蔚虹，女，副教授，研究方向为分子生态学，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｗｈ＠ｗｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
ｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ ａｎｄ ａｌｓｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ；ＩＳＳＲ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
简单序列重复区间扩增（Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等（１９９４）在ＳＳＲ（Ｓｉｍ－
ｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）基础上创建的基于ＰＣＲ扩增
的一种新型分子标记技术。其基本原理是根据真核
生物基因组中广泛存在的ＳＳＲ设计单一引物（通常
为１５～２４个碱基序列），在ＳＳＲ的５′或３′末端加锚１
～４个碱基，然后以此为引物对那些两侧具有反向排
列ＳＳＲ且长度合适的一段基因组 ＤＮＡ序列进行
ＰＣＲ扩增。ＩＳＳＲ分子标记技术具有ＲＡＰＤ的操作简
单和ＳＳＲ的多态性好的优点，然而它的重复性比
ＲＡＰＤ高，在引物设计上比ＳＳＲ技术简单得多，不需
预先知道ＤＮＡ序列即可用引物对其进行扩增（Ｆａｎｇ
＆ Ｒｏｏｓｅ，１９９７）；同时该技术可揭示的多态性比
ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ高，而成本比 ＡＦＬＰ低（Ｋｏｊｉｍａ
等，１９９８；Ｇｕｐｔａ等，１９９４）。目前已广泛用于植物品
种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、生物进化
及分子生态学等研究中（邹喻苹，２００１）。
华 顶 杜 鹃 （Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ）是
１９９０年报道的新种，至今仍仅知局限分布于浙江省
天台县华顶山，其分布范围狭窄，植株稀少，在《浙江
植物志》中已被列入珍稀濒危植物名单中加以保护
（章绍尧等，１９９３）。该种果实与种子形态特殊，花艳
丽，具较高观赏价值，在研究杜鹃花科系统分类学方
面有一定的学术意义（曾汉元，２００２）。该种发现时
置于映山红亚属（ｓｕｂｇｅｎ．Ｔｓｕｔｓｕｓｉ）轮叶杜鹃组
（ｓｅｃｔ．Ｂｒａｃｈｙｃａｌｙｘ），主要根据落叶灌木，叶聚生于
枝条顶端，雄蕊１０枚等特征。但是其叶片及叶缘具
毛，嫩叶干时黑绿色，老叶干时黄绿色。花序具花２
～４朵等，又与落叶杜鹃亚属（ｓｕｂｇｅｎ．Ｐｅｎｔａｎｔｈｅｒａ）
相似。其果实卵球形，花梗具腺毛，子房和果实无
毛，种子特大，表皮细胞突起等特征，与两个组的成
员都有很大区别（丁炳扬等，１９８９）。因此它的系统
地位值得进一步研究。本文运用ＩＳＳＲ技术揭示华
顶杜鹃在杜鹃花属中的分类地位及其与近缘种的亲
缘关系，从而为确立华顶杜鹃是一个新种提供分子
生物学上的依据。
表１ ６种杜鹃花属的样品
Ｔａｂｌｅ １ ６ｓｐｉｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ
样品Ｓａｍｐｌｅ 采集地点Ｌｏｃａｌｉｔｙ 采集人Ｃｏｌｅｃｔｏｒ 标本号Ｖｏｕｃｈｅｒ ｃｏｄｅ
映山红Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ 浙江台州华顶 纪律，缪肖玢 ００１（１）
华顶杜鹃Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ 浙江台州华顶 纪律，缪肖玢 ００６（４）
南平杜鹃Ｒｈ．ｎａｎｐｉｎｇｇｅｎｓｅ 福建三明 丁炳扬，张红双 ８１２２
茶绒杜鹃Ｒｈ．ｒｕｆｕｌｕｍ 福建三明 丁炳扬，张红双 ８１２１
日本２号Ｒｈ．ｍａｙｅｂｒａｅ 日本宫崎 金孝锋 １４３４
日本４号Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ 日本宫崎 金孝锋 １４４６
１ 材料和方法
１．１材料
供试的６种杜鹃花属分别来自天台华顶山，福
建三明，日本，详见表１。
１．２方法
１．２．１基因组ＤＮＡ的提取 ＤＮＡ提取参考Ｄｏｙｌｅ
（１９９１）的ＣＴＡＢ法，并加以改进。
１．２．２ＰＣＲ扩增反应 根据紫外分光光度仪测得的
ＤＮＡ浓度，将ＤＮＡ稀释至浓度为２０ｎｇ／μＬ，供ＰＣＲ
反应使用。利用单因素试验确立了适合华顶杜鹃ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ的优化的反应体系：２５μＬ反应体系中进行，
其中含４０ｎｇ左右的基因组 ＤＮＡ 模板，１×ＰＣＲ
Ｂｕｆｅｒ，２．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，０．３ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．４
μｍｏｌ／Ｌ ＩＳＳＲ 引 物，ＴａｑＤＮＡ 聚 合 酶 １．０ Ｕ，加
ｄｄＨ２Ｏ至２５μＬ。ＰＣＲ反应程序：预变性９４℃３
ｍｉｎ，变性９４℃０．４５ｍｉｎ，退火温度依引物而定１．１５
ｍｉｎ，延伸７２℃１．５ｍｉｎ，循环４０次，继续延伸７２℃
１０ｍｉｎ，反应结束后在４℃保存。反应在 Ｗｈａｔｍａｎ
Ｂｉｏｍｅｔｒａ的Ｔｐｅｒｓｏｎａｌ ＰＣＲ仪上进行（Ｄｏｙｌｅ，１９９１）。
１．２．３琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ后的扩增产物用
１．５％琼脂糖凝胶进行电泳分离检测，电泳缓冲液采
用０．５×ＴＢＥ，溴酚蓝∶样品为１∶５混匀后，点样
１０μＬ，电泳总电压８０ｖ，１．５～２ｈ完成。电泳后的
胶板在溴化乙锭（ＥＢ）池中染色２０ｍｉｎ，取出放入凝
４９５ 广 西 植 物 ３２卷
胶成像系统中照相记录结果。
１．２．４数据处理 用凝胶成像系统（ＵＶＰ）对基因组
ＤＮＡ的 ＰＣＲ扩增产物电泳图谱进行记录，通过
ＤＬ４０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，标注各条带（扩增产物）的分
子量，导出Ｅｘｃｅｌ表格。无条带的记为０，有条带的
记为１，形成０／１矩阵图并输入计算机，根据所得０／
１矩阵图，利用ＰＯＰＧＥＮＥ３２软件中ｄｏｍｉｎａｎｔ（显
性）２ｄｉｐｌｏｉｄ（二倍体），计算多态位点百分率
（ＰＰＬ）、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数（Ｈ）、Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ多
态性信息指数（Ｉ）、基因分化系数（Ｇｓｔ）、基因多样性
（Ｈｔ）、种群内基因多样性（Ｈｓ）、Ｎｅｉ’ｓ（１９７８）遗传一
致度和遗传距离（Ｄ），并根据 Ｎｅｉ的遗传一致度和
遗传距离最后形成一个树型的ＵＰＧＭＡ聚类图。
图１ 模板ＤＮＡ浓度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１，２，３，４，５，６．分别代表模板ＤＮＡ浓度１０、２０、３０、４０、
５０、６０ｎｇ；７．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
２ 结果与分析
２．１ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的优化
２．１．１ＤＮＡ模板 本试验设定了６个ＤＮＡ模板梯
度（１０、２０、３０、４０、５０、６０ｎｇ），实验结果表明，ＤＮＡ
模板量对ＰＣＲ扩增无明显的影响，在１０、２０ｎｇ的
情况下条带比较模糊，是因为ＤＮＡ的含量不够，使
其不能完成整个ＰＣＲ循环，而在３０～６０ｎｇ范围都
得到较好的扩增结果（图１）。
２．１．２Ｍｇ２＋浓度 Ｍｇ２＋浓度的改变对ＰＣＲ扩增产
生明显的影响。Ｍｇ２＋浓度为０．５，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ时
主带少，且弱，稳定性较差。随着浓度的的增加，特
异性结合增强，扩增条带越来越清晰，在１．５～２．０
ｍｍｏｌ／Ｌ之间均能获得清晰稳定的条带，但在２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ的时候，扩增条带亮度减弱（图２）。
２．１．３ｄＮＴＰｓ浓度 ｄＮＴＰｓ浓度的改变对ＰＣＲ扩
增的亮度影响较小，０．０５～０．１０时，扩增条带不清
晰；以０．１５～０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ为宜；但在０．２５～０．３
ｍｍｏｌ／Ｌ之间，随着浓度的增加，某些特异性扩增带
亮度变弱，但条带还是比较清晰的（图３）。
图２ Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１，２，３，４，５．分别代表 Ｍｇ２＋浓度０．５、１．０、１．５、２．０、
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ；６．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
图３ ｄＮＴＰｓ浓度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１，２，３，４，５，６．分别代表ｄＮＴＰｓ浓度０．０５、０．１、０．１５、０．２、
０．２５、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ；７．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
２．１．４Ｔａｑ聚合酶浓度 在２５μＬ反应体系中，选用
５个Ｔａｑ聚合酶浓度，分别为０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０
Ｕ，均有扩增产物。在０．２５Ｕ时，扩增条带不够清
晰，且条带很少；在１．０～１．５Ｕ时，扩增条带清晰，信
息量大；当酶溶度在２．０Ｕ时，非特异性扩增条带增
多。从经济的角度考虑，以１．０Ｕ为好（图４）。
２．１．５引物浓度 引物浓度对华顶杜鹃ＩＳＳＲ扩增结
果影响较大，在引物浓度为０．２０～０．３０μｍｏｌ／Ｌ时扩增
条带不清晰；在０．４０μｍｏｌ／Ｌ时扩增条带较好；但在
０．５０～０．６０μｍｏｌ／Ｌ时，出现了非特异性的扩增（图５）。
５９５５期 颜士辉等：华顶杜鹃ＩＳＳＲ反应体系的优化及亲缘关系的初步分析
图４ Ｔａｑ聚合酶浓度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
１，２，３，４，５．分别代表Ｔａｑ聚合酶浓度０．２５、０．５、１．０、１．５、
２．０Ｕ；６．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
图５ 引物浓度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１，２，３，４，５分别代表引物浓度０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、
０．６０μｍｏｌ／Ｌ；６．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
２．１．６退火温度 不同退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
结果的影响见图６所示。从图中可以看出，退火温
度在４７～５０℃之间，扩增条带清晰度不高；而在５１
～５４℃得到了较好的扩增。在温度５５～５７℃，扩
增条带特异性增强且条带多为短片段，多态性条带
减少，因而信息量减少。通过ＩＳＳＲ－ＰＣＲ条件的优
化建立 适 合 华 顶 杜 鹃 的 ＰＣＲ 反 应 体 系：１×
ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰｓ ０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ，引物０．４０μｍｏｌ／
Ｌ，ＭｇＣｌ２２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ ４０ｎｇ，Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶１Ｕ，超纯水加至２５μＬ。
２．２ＩＳＳＲ反应程序及ＩＳＳＲ引物筛选
扩增程序：预变性９４℃３ｍｉｎ→３９个循环：（变
性９４℃４５ｓ→退火（根据各个引物来定）１ｍｉｎ １５ｓ→
延伸７２℃１ｍｉｎ ３０ｓ）→继续延伸７２℃１０ｍｉｎ→保
存４℃０ｓ。在优化的体系中，以茶绒杜鹃、Ｒｈｏｄｏ－
图６ 退火温度对ＩＳＳＲ扩增反应的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１．分别代表退火温度４７、４８、
４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７℃；１２．代表对照；
１３．代表 Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。
ｄｅｎｄｒｏｎ ｍａｙｅｂｒａｅ、Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ、南平杜鹃、华顶杜鹃、
映山红的基因组ＤＮＡ为模板，筛选出多态性较理想
的引物。然后对扩增清晰、多态明显的条带进行了统
计分析。所用引物的编号及序列见表３
表３ 引物序列编号及引物序列
Ｔａｂｌｅ ３ Ｌｉｓｔ ｏｆ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物序号
Ｎｏ．ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
特征数
Ｎｏ．ｏｆ ｔｒａｉｔｓ
ＩＳＳＲ－１ （ＡＣ）８ＹＴ ６
ＩＳＳＲ－２ （ＣＡ）６ＲＹ ６
ＩＳＳＲ－３ （ＣＡ）６ＲＧ １０
ＩＳＳＲ－４ （ＣＴＣ）４ＲＣ ８
ＩＳＳＲ－５ ＢＤＢ（ＡＣＡ）６ ５
ＩＳＳＲ－６ ＢＢＢ（ＧＡＡＡ）３ＧＡＡ ８
ＩＳＳＲ－７ （ＣＡＣ）４ＲＣ ６
２．３华顶杜鹃分类地位初步分析
ＩＳＳＲ位点是指ＩＳＳＲ引物在基因组中一定条
件下扩增出随机的ＤＮＡ片段，本身不具任何功能
意义。ＩＳＳＲ所揭示的遗传变异是核苷酸碱基变化
的结果，引物结合位点的改变或扩增范围内的突变
（插入或缺少）都会使扩增产物改变，表现为ＩＳＳＲ
片段的有或无。对于显性标记而言，这是等位基因
典型的分布方式，不能区分纯合（ＡＡ）与杂合（Ａａ）
基因型，是ＩＳＳＲ标记的主要缺陷，在种群遗传研究
中无法评估等位基因频率（Ｒａｔｎａｐａｒｋｈｅ等，１９９８）。
同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被
认为具有同源性，在电泳带谱中同一位点上出现条
带的个体按扩增阳性（１）记录，该位点上没出现条带
的则按扩增阴性（０）记录，形成（０，１）排列的ＩＳＳＲ表
６９５ 广 西 植 物 ３２卷
型数据矩阵，用于进一步分析（张如莲等，２００６）。如
图７所示，本文数据分析依据所筛选的ＩＳＳＲ引物产
生的ＩＳＳＲ标记进行。将这些标记利用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１
软件进行分析，建立遗传距离矩阵（张文静等，２００５）。
在此基础上，按非加权算术平均数聚类法（ＵＰＧＭＡ）
建立遗传关系聚类图（Ｋａｎｔｅｔｙ等，１９９５）。
从图７可以看出，６个种明显地聚为２大类：Ａ、
Ｂ类。Ａ类含有映山红、南平杜鹃；Ｂ类含有茶绒杜
鹃、日本４号、日本２号与华顶杜鹃，而茶绒杜鹃、日
本４号、日本２号之间有较多遗传相似性，说明这几
个种之间的亲缘关系较接近。从遗传相似性和遗传
距离也可以得出同样的结论（张春平等，２００９），华顶
杜鹃相对亲缘关系较远。
３ 结论与讨论
３．１退火温度的确定
退火温度不仅与引物序列有关，还与物种ＤＮＡ
的序列有密切关系，因此在进行ＩＳＳＲ扩增优化之前
确定引物的退火温度非常重要（Ｈｏｇｂｉｎ ＆Ｐｅａｋａｌ，
１９９９）。先根据原初的ＰＣＲ反应条件进行引物的初
筛，选择能看到清晰条带的引物进行退火温度的确
定。从图６看出，退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响非常
图７ ６种杜鹃花的ＩＳＳＲ标记聚类图（ＵＰＧＭＡ）
Ｆｉｇ．７ Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ
６ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ
表４ ６个种的遗传相似性
Ｔａｂｌｅ ４ Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ６ｓｐｉｃｅｓ
茶绒杜鹃
Ｒｈ．ｒｕｆｕｌｕｍ
日本４号
Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ
日本２号
Ｒｈ．ｍａｙｅｂｒａｅ
南平杜鹃
Ｒｈ．ｎａｎｐｉｎｇｇｅｎｓｅ
华顶杜鹃
Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ
映山红
Ｒｈ．ｓｉｍｓｉｉ
茶绒杜鹃Ｒｈ．ｒｕｆｕｌｕｍ １．０００００００
日本４号Ｒｈ．ｓａｔａｅｎｓｅ ０．８１２５０００ １．０００００００
日本２号Ｒｈ．ｍａｙｅｂｒａｅ ０．８１２５０００ ０．７５０００００ １．０００００００
南平杜鹃Ｒｈ．ｎａｎｐｉｎｇｇｅｎｓｅ ０．４３７５０００ ０．６２５００００ ０．５００００００ １．０００００００
华顶杜鹃Ｒｈ．ｈｕａｄｉｎｇｅｎｓｅ ０．５００００００ ０．５６２５０００ ０．５６２５０００ ０．３１２００００ １．０００００００
映山红Ｒｈ．ｓｉｍｓｉｉ ０．２５０００００ ０．４３７５０００ ０．３１２５０００ ０．５６２５０００ ０．５００００００ １．００００００
明显，其结果的影响可分为３组：从４７～５０℃较低
的退火温度为第一组，非特异条带数较多，和较高的
退火温度相比有较大片段，从５１～５４℃为第二组，
扩增条带清晰，亮度较大，在此温度范围内，随着温
度的增加，条带亮度略有减弱；从５５～５７℃较高的
退火温度为第３组，扩增大片段的条带数目明显减
少；所以，在ＩＳＳＲ －ＰＣＲ扩增中，退火温度非常重
要，我们可根据公式计算引物的退火温度，对于具相
似退火温度的引物采用５２℃进行筛选，选择清晰、
不弥散的引物进行下一步研究，对于退火温度差距
较大的，则进一步采用梯度 ＰＣＲ 进行退火温度
筛选。
３．２Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｍｇ２＋浓度对Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的活性、退火温
度和产物的特异性都有影响。在华顶杜鹃ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ扩增中，Ｍｇ２＋浓度的变化对ＩＳＳＲ条带的数量
和强弱影响较大（图２）。在一定的浓度范围内，随
着 Ｍｇ２＋浓度的增高，扩增的特异性加强，扩增条带
增加，Ｍｇ２＋浓度为０．５、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ时主带少，且
弱，稳定性较差，随着浓度的增加，特异性结合增强，
扩增条带越来越清晰，在１．５～２．０ｍｍｏｌ／Ｌ之间均
能获得清晰稳定的条带，但在２．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，非特
异性扩增条带增多。因此，确定 Ｍｇ２＋ 浓度以２．０
ｍｍｏｌ／Ｌ较为适宜。
３．３Ｔａｑ酶用量对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｔａｑ酶的用量也对实验结果影响较大，酶用量
过高不仅增加成本，还会造成非特异性的扩增产物，
过低则会使酶过早地消耗完，产物合成效率低。在
２５μＬ反应体系中设定的５个 Ｔａｑ聚合酶浓度
（０．２５，０．５，１．０，１．５，２．０Ｕ）均有清晰的扩增产物。
７９５５期 颜士辉等：华顶杜鹃ＩＳＳＲ反应体系的优化及亲缘关系的初步分析
在０．２５Ｕ时，扩增条带不够清晰，且条带很少；在
０．５～１．５Ｕ时，这些扩增条带都比较清晰，酶用量
在１．０，１．５Ｕ扩增结果较好，扩增条带最清晰，信
息量大；当酶用量在２．０Ｕ时，非特异性扩增条带
增多。从经济的角度考虑，以１．０Ｕ为好。
值得注意的是，不同厂家甚至同一厂家不同批
次的试剂，其活力都存在着差异。为减少实验误差，
应尽量使用同一厂家生产的同一批次的试剂，另仪
器使用，不同样品的试验也要注意同样的问题（胡延
萍等，２０１０）。
３．４亲缘关系的初步分析
按杜鹃系统发育与进化理论，常绿杜鹃亚属为
最原始的杜鹃类群，在适应古地史和古气候的变迁
过程中，演化出两个分支：一支分化成全体密被（腺
体状）鳞片的高山类群或热带附生类群—适应于旱、
寒生环境的有鳞杜鹃；另一支演变为（无鳞）多少被
毛的半常绿或落叶的温带和亚热带林下类群—适应
于温暖湿润气候的马银花、落叶杜鹃、映山红等亚属
的杜鹃。
从形态学上看，映山红、南平杜鹃、茶绒杜鹃都
是属于映山红亚属中的映山红组，日本４号是映山
红组的现已合并于轮叶杜鹃，日本２号是轮叶杜鹃
组的现已合并于丁香杜鹃和满山红，而华顶杜鹃是
属于轮叶杜鹃组（ｓｅｃｔ．Ｂｒａｃｈｙｃａｌｙｘ），现认为应归
入落叶杜鹃（羊踯躅）亚属ｓｕｂｇｅｎ Ｐｅｎｔａｎｔｈｅｒａ的
Ｓｃｉａｄｏｒｈｏｄｉｏｎ组（丁炳扬等，２００９）。
从ＩＳＳＲ分析所获得的遗传相似性和 ＵＰＧＭＡ
聚类树状图看，映山红与南平杜鹃相似聚成一分枝，
而茶绒杜鹃、日本４号、日本２号与华顶杜鹃聚成另
一分枝。从形态学和分子生物学两个角度上区别这
６个种，除茶绒杜鹃外，其它５个种基本是一致的。
结果表明，华顶杜鹃不同于其它５个种，从而为确立
华顶杜鹃是一个新种提供可借鉴的依据，由于仅用
７个引物对６个种的杜鹃花属植物进行分析，所以
对华顶杜鹃的亲缘关系仅做初步分析。
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