全 文 ：@37 一孑7
广 西 植 物 Guil~ia 19(4)：373—376 1999年 11月
沙田柚花粉发育过程中同 酶的变化研究 Q
薛妙男，颜 承 杨继华
摘 要：分析了沙田抽花粉在发育过程中 3种酶的同工酶的活力及类型的变化。结果表明．过氧化
物酶活力在单核期达到最太，在四分体期与单棱期所具有的一条染色鞍深的快速酶带在双核期消
失． 淀粉酶活力在成熟期达到最太，谱带上也表现 出在成熟期有酶带的增多．分析酯酵酶谱，
可见其在各个发育时期均有明显的特征带，这些特征带可作为花粉发育备时期的生化指标．
鬟撬 鬯 ；垄 l三堕、馒茸．生化幅杯
中圉分赛孽 Q945，6 2 文献标识码：A
Study on varieties of isozymes during development of
pollen of Citrus grandis var．shatinyu Hort
XUE M iao—nan， YAN Cheng， YANG Ji—hua
tBiatogicalDepartment．6 d Noro~lU r Guilin 541004．China1
Abstract： The varieties of activity and type of three isozymes of sba tinyu pollen during the polen
development were analyzed．The results show the activity of peroxidase reach the maximum in its
mononuclear stage．A dark dyeing and fast speed enzyme bar in the tetrad stage and mononuclca r
stage disappeared at binuclear stage．~．-amylas~activity reached maxirgura during the ma~ure stage．
The diagram ind icated the band s increased at matur~ We discovered~sterase had an obvious char-
acter band atthedifferentphaseofdevelopmentofpollen
，
whichca nbe servedas biochemical sym．
bol ofthe different develolmaent phase ofshatinyu po llen．
Key words： Shatinyu；po len；isozymes
沙田柚为广西名优果品， 1990年以来．我们对沙 田抽自交不亲和性的细胞学和生物化学基础进
行了一系列研究，积累了不少实验证据 q’．在此基础上，对沙田柚花粉在不同发育时期的3种酶
的同工酶的变化进行比较研究．以加深对花粉发育过程中生化过程的认识。
lb瞄 日期：1999-06-30
基童理目：国索自热科学基金【项目犏号：3976007) 广西自煞科学基盎费助珥目
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374 广 西 植 物 19卷
1 材料和方法
1．1 材料
沙田柚花粉采 自桂林广西柑桔研究所实验地，为 1O～15 a酸砧结果树。分别于 1997、1998年 4
月盛花期，收集不同发育时期花粉，保存于—80℃冰箱中备用．
1．2 方法
1．2．1花粉各发育时期同I酶电泳分析
’根据花粉发育的 4个时期：四分体期、单核期、双核期和成熟期，分别收集花粉，保存于 0℃
冰箱中，同时进行电泳分析，多次重复。
样品制备：200mg样品加提取涟 ㈨ 1ml。冰浴中研磨，离心(12000 rpm,10rain)，上清波作电
泳样品．
电泳：采用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，不连续系统．凝腔太小为 13 cm x l1 cm x 0．1 cm．分离
胶浓度 T=7．5％，交联度 C=2．6％．pH；8．9．浓缩胶 T=3％，pH=6,7． 电极缓冲液为 Tri 甘氨
酸缓冲浪(pH=8．3)．稳流(15 mA)直至电泳结束。
染色：过氧化物酶染色用醋酸联苯胺法 。酯酶染色参考文献 (6)。淀粉酶染色参考文献 (5)。
1．2．2花粉各发育时期酶活力厦蛋白质含量分析
样品制备：方法同电泳分析
过氧化物酶活力测定参照文献 (7)．淀粉酶活力测定采用 Yoo改 良法 。
蛋白质含量测定用考马斯亮兰法 ⋯ 。
2 结 果
从表 1可以看出．随着花粉的发育．蛋白质的含量呈现上升的趋势．且在双核期达到摄大值
(12．17单位)。在花粉发育的 4个时期中，过氧化物酶和淀粉酶的活力表现 出极为明显的变化 (表
1，图 1)．这两种酶相互之间的活力变化趋势并不表现出正相关，而且它们与蛋白质含量的变化之间
也不表现出正相关。过氧化物酶表现为单核期活力最大 (10．598单位)，淀粉酶活力整体上呈上升之
势，在成熟期达到最大值 (1．771单位)．
在对酯酶、过氧化物酶及 ∞一淀粉酶的同工酶酶谱的比较中，可以看出，随着花粉的发育，这 3
种酶在不同发育时期表现出酶带上的差异。
其中酯酶同工酶 (图 2)，在发育的 4个时期
均 出 现 了 特 征 酶 带 ， 四 分 体 期 E
(RF=0．32)．单核期 Eb= (RF= 38)和 E
(RF=0．44)， 双核 期 Ed(RF=0、50)． 成 熟
期 E (RF=0．46)。 过 氧 化物 酶 同工 酶 (图
3)，在四分体期和单核期所特有的一条快速酶
带 (RF=0．96)，随着花粉发育进人双核期
而消失，在过氧化物酶活力最强的单核期有一
条特征酶带 Ph(RF=0．69) 淀粉酶 同工酶
(图 4)．酶带 A (RF=0．52)在单核期开始
衰1 蛋白tE-~ll丑 a 蝴 ．过氧化鞠酶活力
Table1 Thecontent ofprotein,the activityof
~-amylase and pem xjdase
出现直至成熟期，而且在成熟期又新出现了另一特征酶带Ab(RF=0．92)．
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4期 薛妙男等： 沙田柚花粉发育过程 中同工酶的变化研究 375
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圉 1 过氧化物酶．淀粉酶括力
F 1 T activity ofperoxidas~and amylase Ya-1k ：
activity ofpemxidase(AOD／6O＆mgprotein)Yb．The
activity ofw-amylase(AOD／5 rain．ragprotei n1
1．Tetradstage四分体期． Mo∞ n l∞r stage单拔期．
3．Binu~le．at stage双棱 期 ．4．Mature staBe成 熟期-
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圉 3 过氧化物酶同工酶谱
Fig．3 The diagram ofperoxidase isoz3,mes
I．Teirad sttge日丹体期．0Mo∞m l咀T 9 单*胡，
3 bim ritt$~ 杠期， M ^n ~ttg~虚热期．
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图2 酯酶间工酶谱
F 2 The d~．gram 0res rase isozymes
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圈4 淀粉酶同工酶谱
Fig．4 The diagram of：t-amylase isozyme~
1．T~tr*d gtB萨 仆悼期，z Mol ⅡIcI∞rna 单 搠，
3-Binud~rm 双擅期 M㈣ t 释 熟 ．
(1)过氧化物酶参与了细胞壁中许多结构成分的聚合作用，在形成复杂的细胞壁结构中起着十分关键
的作用 ‘。本实验结果表明，在花粉发育的单核期，过氧化物酶的括力达到最大值，随后则出现下
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降趋势，并且在这一时期，同工酶酶带数虽多．出现了一条特征酶带 Pb。在四分体期和单核期所具
有的一条快速酶带 P|在双棱期及成熟期时消失。四分体期和单核期正是花粉壁形成的主要时期．说
明花粉中的过氧化物酶至少参与了花粉壁的形成，双棱期之后，过氧化物酶活力明显减弱，酶带减
少，应与花粉壁在这一时期已基本形成有关。遗传信息在花粉发育过程中顺序表达的现象极为明显
(2)∞一淀粉酶在植物体内主要催化淀粉的永解。沙田柚花粉发育过程中．淀粉酶的活力在前期处于
相对较低的永平，直到成熟时才表现出较强的活性。同工酶酶谱也反映出各酶带含量的增加，A 带
的量明显高于单 双核期。而且出现了 Ab新酶带。一般认为花粉在发育过程中主要是营养物质的积
累。为花粉萌发打基础。实验表明，在花粉的发育前期淀粉酶一直没有高效表达．直到成熟时，淀粉
酶活力增强，各同工酶含量增加而且还出现了一条新酶带 A 说明口一淀粉酶的活力增强．同工酶数
量的增加，已经为花粉的萌发，花粉管的生长作好准备。
(3)酯酶同工酶存在于植物各部位和不同发育时期的细胞中，一般作为研究发育时期基因表达调控的
一 种标志酶。实验表明，在沙田柚花粉发育过程中酯酶同工酶酶谱变化较大，各个时期均有其特征性
的酶带，如四分体期的E ，单棱期的Eb和E ，双核期的 等都可以作为区分花粉发育时期的生化
指标。
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