全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(4)：560— 563 2007年 7月
云锦杜鹃 ISSR扩增条件的优化
顾奇萍1一，金则新2*，李钧敏2
(1．西南大学 三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715；2．台州学院 生态研究所，浙江 临海 317000)
摘 要：以云锦杜鹃基因组 DNA为研究对象，对影响 ISSR-PCR扩增效果的一些因素，包括镁离子浓度、
dNTP浓度、模板 DNA含量、Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物用量以及退火温度等进行筛选和优化，建立
了稳定、可重复的最佳反应体系：10 L PCR反应体积中，1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol／L Tris·HCI
pH9．0，50 mmol／L KCI，0．1 Triton X-100)，1．5 mmol／L MgClz，0．15 mmol／L dNTP，0．45 U Taq DNA聚
合酶，2 mg／mL BSA，12 pmol引物，16 ng模板 DNA。利用所建立的优化反应体系从 100个 ISSR引物中共
筛选出12个稳定性好、重复性高的引物，对 5个居群共 100个云锦杜鹃个体的DNA进行扩增，检测到170个
位点，其中多态位点 150个，多态位点百分率 88．24 ，5个居群的多态位点百分率平均为48．23 。云锦杜鹃
ISSR反应体系的建立为利用 ISSR分子标记技术研究云锦杜鹃的遗传多样性奠定了良好的基础。
关键词：云锦杜鹃；ISSR；优化；遗传多样性
中图分类号 ；Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2007)04—0560—04
Optimization of ISSR amplification conditions
for R D D JP．D fortunei
GU Q Pinga一，JIN Ze-Xinz ，LI Jun-Minz
(1．Keyl~．bor
．atory ofthe ThreeGorgeReservoirRegion’SEco-Environment，Ministry ofEducation，Southwest
University，Chongqing 400715，China；2．Institute of Ecology，Taizhou University，Linhai 317000，China)
Abstract：Factors which afect the ISSR-PCR amplification，such as MgZ+concentration，dNTP concentration，tem-
plate DNA dosage，Taq DNA polymerase units，BSA concentration and primer dosage，and annealing temperature
were optimized and selected by using the genomic DNA of Rhododendron fortunei as materia1．The suitable ISSR-
PCR conditons BSA，12 pmol primer，16 ng template DNA．The suitable annealing temperature was 56．9℃．Based
on these suitable conditions，12 primers were selected and 170 DNA bands were produced in 5 populations with 100
individuals among which 1 50 loci were polymorphic．The total percentage of polymorphic loci was 88．24 ，while the
mean percentage of polymorphic loci of 5 Rh．fortunei population was 48．23 ．The establishment of the PCR reac—
tion conditions could settle favorable basis for the further study on the genetic diversity of Rh．fortunei by using IssR
molecular marker techniques．
Key words：Rhododendron fortunei；ISSR；optimization；genetic diversity
ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)，又称 Inter-
SSR，称为简单重复序列区间，是建立在 PCR反应基
础上的一种新的分子生物学技术，由Zietkiewicz等于
1994年建立的，它结合了 SSR和 RAPD的优点，具
RAPD操作简单，所需 DNA量少，不需预知研究对
象的基因组序列等优点，并具 SSR的稳定性。因
此，ISSR技术近年来已迅速应用于品种鉴定、种质
资源和遗传多样性的研究(Gilbert等，1999；Borne
收稿日期 ：2005-09—28 修回日期 ：2006-05-09
基金项目：浙江省自然科学基金(Y504220)；台州市科技局项目(044205)[Supported byNatural ScienceFoundation of ZhejiangProvince(Y504220)
Bureau of Science and Technology of Taizhou City(044205)]。
作者简介：顾奇萍(1982一)，女，浙江诸强人，在读顼士，从事植物生态学研究。
。通讯作者(Author for correspondence，E-mail：jzx@tzc．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 顾奇萍等：云锦杜鹃ISSR扩增条件的优化 561
等，2002)。由于 ISSR技术也是基于 PCR的一种
分子技术，所以同其它标记一样，其最终结果易受多
种因素的干扰，如模板 DNA、Taq酶、dNTP、引物以
及 Mg 等都能影响扩增的结果，甚至其中一个因
子的改变都会导致扩增条带弥散、消失及位置的改
变，从而严重影响整个实验结果，因此，在研究时都
应先建立起合适的反应体系并对其进行优化(何桥
等，2005)。
云锦杜鹃(Rhododendron fortunei)属杜鹃花
科常绿灌木或小乔木，生于海拔 400 1 900 m山间
林中，花大艳丽，极具观赏价值(方云亿，1989)。本
研究以云锦杜鹃基因组 DNA为研究对象，对 ISSR—
PCR扩增条件进行筛选和优化，建立重复性好、结
果清晰而稳定的云锦杜鹃 ISSR-PCR反应体系，为
进一步研究云锦杜鹃种群的遗传多样性奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料来源
实验材料均采 自浙江省境内，5个样地分别位
于括苍山、天台山、凤阳山、百山祖、干坑等地。各居
群均随机选取 2O株成年植株的幼嫩叶片，根据居群
的大小，相邻植株间的距离在 30 m 以上。取植株
的幼嫩叶片置于保鲜袋中，封口，于样品贮藏箱(由
超低温冰袋保持冷藏条件)带回实验室，一7O℃低温
冰箱保存，供 DNA提取。本优化实验材料取自丽
水市凤阳山居群。
1．2基因组 DNA的提取
采用改进的SDS法，按李钧敏等(2002)进行云
锦杜鹃基因组 DNA的提取，DNA经 0．8％琼脂糖
凝胶电泳分析，于上海天能 GIS凝胶成像分析系统
(上海天以科技服务公司)拍照定量。将 DNA稀释
成 20 ng／~L，贮存于-20℃冰箱中备用。
1．3试验处理
ISSR-PCR扩增反应体系的优化按常规采用单因
素试验，共试验了 6个因素，每个因素各设置了四个
梯度。M 浓度设置了 1．5、1．8、2．1、2．4 mmol／L
四个梯度；4×dNTP设置了 0．1、0．15、0．2、0．25
mmol／L四个梯度；Taq DNA聚合酶设置了 0．45、
0．6、0．75、0．9U四个梯度；牛血清白蛋白(Bovine se—
rum albumin，BSA)设置了 1、2、3、4 mg／mL四个梯
度；引物设置了 6、12、18、24 pmol四个梯度，模板
DNA用量设置了4、1O、16、22 ng四个梯度。
退火温度设置 5O、5O．3、5O．9、51．8、52．9、54．2、
55．5、56．9、58．4、59．3、59．8、6O．1℃等 12个梯度。
1．4 ISSR反应程序
ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Universi—
ty of British Columbia，Set No．9，No．801—900)提供
的序列，由上海生工生物工程公司合成。
原初扩增反应条件为 1O L PCR反应体积中，
1×Taq酶 配套 缓 冲液 (10 mmol／L Tris—HC1，
pH9．0，50 mmol／L KCl，0．1 Triton X一100)，1．5
mmol／L MgC12，0．5 U Taq DNA聚合酶(华美生物
工程公司)，6 pmol引物，0．15 mmol／L 4×dNTPs，
1O ng模板 DNA，2 mg／mL BSA。本实验所用的
PCR仪为美国 Thermol公司的 P×2梯度 PCR仪。
PCR反应程序为：94℃ 5 min 1个循环；再 94℃ 3O
S，55℃ 45 S，72℃ 1．5 min，共 35个循环；最后一
个循环 72℃延伸 5 min，使 DNA片段完全延伸。
1．5 PCR产物的鉴定
扩增产物在 1．6 琼脂糖凝胶(O．5×TBE，含
0．5~g／mL溴化乙锭)上进行电泳分析，于上海天
能 GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公
司)拍照保存。
2 结果与分析
2．1 M +浓度对 ISSR扩增的影响
Taq DNA聚合酶是 Mg 依赖性酶，对 Mg
浓度比较敏感。Mg 浓度是影响 PCR结果的重要
变量之一，在一般的 PCR反应中，1．5～2．0 mmol／
L的 Mg +比较合适(卢盛栋，1999)。在云锦杜鹃
ISSR扩增 中，当 Mg 十分别在 1．5 mmol／L，1．8
mmol／L时，扩增条带清晰，但在 1．8 mmol／L时，
条带变少，稳定性下降，而当 Mg 浓度达到 2．1
mmol／L以上时条带明显变得不清晰(图 1)。所以
我们选择 1．5 mmol／L为该实验 Mg 的最适浓度。
2．2 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP浓度的变化对 ISSR带的数量和强弱影
响较大(图1)。当浓度为0．1 mmol／L时，条带虽清
晰，但缺少分子量最小的一条带，而 dNTP浓度为
0．15 mmol／L时，条带最清晰、稳定；随着dNTP浓
度逐渐增加，条带减少且变得模糊不清，可能由于
dNTP过多，与游离的 Mg +结合，导致 Mg 浓度
的降低，从而使 ISSR条带变模糊。因此，本实验的
最佳 dNTP浓度为 0．15 mmol／L。
维普资讯 http://www.cqvip.com
562 广 西 植 物 27卷
2．3 Taq酶单位对 ISSR扩增的影响
Taq酶单位的变化对扩增结果影响较大，量多
不仅增加实验成本，而且容易产生非特异性扩增产
物，量少则会导致产物的合成效率下降。由图 l可
知，在 Taq DNA聚合酶的量为 0．45U时，条带最清
晰。随着酶浓度的增加，条带亮度也随之增加，但同
时背景也略有增加，当酶提高到 0．9 U时，背景亮
度非常高，可能是酶量的提高导致非特异性扩增的
增加。因此本研究认为在 lO L反应体积中最适的
Taq酶量为 0．45 U。
2．4 BSA浓度对 ISSR带的影响
BSA浓度的变化对 ISSR带的数量和强弱有一
定的影响(图 1)。当 BSA浓度为 l mg／mL时，条
带较弱，当浓度增至 2 mg／mL时，条带变亮，清晰度
增强，而随着浓度进一步增加，条带亮度又开始减
弱，到达4 mg／mL时，不仅亮度减弱，而且有些条带
开始丢失。所以我们最终选择 2 mg／mL为本实验
BSA的最佳浓度。
2．5引物浓度对 ISSR扩增的影响
在本研究中，引物浓度的变化对 ISSR带的数
量和强弱影响较小，引物浓度从 6～24 pmol均有明
显并清晰的扩增产物，带型变化较小(图 I)。当引
物浓度为 12 pmol时，带型最清晰，条带的亮度最
大；当引物增加至 18 pmol以上时，带型无变化但条
带的亮度却明显下降。所以我们选择 12 pmol为该
实验的最佳引物浓度。
24 23 22 21 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
图 1 不同因素对云锦杜鹃ISSR扩增的影响(引物 UBC 856)
Fig．1 Effect of different conditions on Rhododendron fortunei ISSR amplification(primer UBC 856)
M．200 bp标准分子量参照物．I-4．Mg。 浓度分别为 1．5、1．8、2．1、2．4 mmol／L；5-8：dNTP浓度分别为0．1、0．15、
0．2、0．25 mmol／L,9-12：Taq酶浓度分别为 0．45、0．6、0．75、0．9 U；13—16：BSA浓度分别为 1、2、3、4 mg／mL；
17—20：引物浓度分别为 6、12、18、24 pmol；21·24：模板 DNA浓度分别为 4、10、16、22 ng．
24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 M 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
图 2 退火温度对 ISSR—PCR扩增结果的影响
Fig．2 Effect of annealing temperatures on the ISSR—PCR amplification results
M．200 bp标准分子量参照物．1-12(引物UBC855)和 13—24(引物 UBC856)：温度依次为 50、50．3、50．9、51．8、
52．9、54．2、55．5、56．9、58．4、59．3、59．8、60．1℃ ．
2．6模板 DNA浓度对 ISSR扩增的影响
适宜的模板 DNA浓度是保证特异性扩增的前
提，不同的扩增材料对模板 DNA浓度的需要也各
不相同。而本实验，在 10~LPCR反应体积中，当模
板 DNA浓度为 4 ng和 1O ng时，扩增条带颜色较
浅；而在 16 ng和 22 ng时，模板 DNA量对扩增结
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 顾奇萍等：云锦杜鹃 ISSR扩增条件的优化 563
果影响不大，均能获得清晰的条带。因此，我们选择
l6 ng为该实验最适 DNA模板量。
2．7退火温度对 ISSR带的影响
退火温度对不同物种 ISSR—PCR的影响非常明
显。根据原初的 PCR反应条件进行引物的初筛，选
择能看到清晰条带的两个引物 UBC 855和 UBC
856进行退火温度的测定，结果如图 2所示。从中
可看出，当退火温度为 56．9℃，两个引物扩增出的
条带稳定、清晰，而它们的理论退火温度却均为 54
℃，席嘉宾等(2004)在地毯草的PCR扩增反应中使
用的引物 UBC 890和引物 UBC 887的理论温度分
别为52℃和42℃，而实际退火温度分别为6O℃和
48℃，均比理论温度要高。本研究中使用的其它引
物的理论温度和实际温度见表 1，可见实际退火温
度与理论退火温度之间存在一定的差异，实际退火
温度可能高于、低于或等于理论退火温度。
表 1 退火温度对 PCR结果的影响
Table 1 Annealing temperature of different primers
2．8云锦杜鹃的引物筛选和扩增
利用该反应体系对 100个 ISSR引物进行了筛
选，筛选出 UBC817、UBC826、UBC827、UBC835、
UBC836，UBC840，UBC841，UBC855， UBC856，．
UBC888、UBC895、UBC900共 l2个扩增条带清晰，
重复性好，稳定性高的引物作为正式扩增的 ISSR
引物。上述 l2个引物对 5个居群共 100个云锦杜
鹃个体的 DNA进行 ISSR扩增，共扩增出 170条
带，平均每个引物 l4．2个条带，其中有 150个条带
为多态条带，占88．24 。5个居群的多态位点百分
率(P9，6)的变化范围在 42．94 ～55．88 之间，平
均为 48．23 。
3 结论
扩增条件的变化会对 ISSR图谱产生较大的影
响，从而影响 ISSR分析的准确性和稳定性，因此，
为了获得重复性和可靠性较高的 ISSR带谱，对云
锦杜鹃进行引物的筛选、ISSR-PCR扩增条件的优
化及不同引物的退火温度的确定显得十分必要。通
过对影响 ISSR反应体系中各个主要影响因子的筛
选和优化，建立了重复性好、清晰度高的ISSR-PCR
反应体系。本研究结果显示，适合云锦杜鹃 ISSR
分析的扩增条件如下：10 tLPCR反应体积中，l×
Taq酶配套缓冲液(10 mmol／L Tris·HC1 pH9．0，
50 mmol／L KCI，0．1 9，6 Triton X-100)，1．5 mmol／
L MgC12，0．15 mmol／L dNTP，0．45U Taq DNA聚
合酶，2 mg／mL BSA，12 pmol引物，16 ng模板
DNA。最适退火温度 56．9℃。以此条件对同一云
锦杜鹃植株 DNA进行了 3次 ISSR分析，结果可
靠，带型稳定。采用 l2个引物检测云锦杜鹃的遗传
多样性研究中，所产生的 ISSR标记位点清晰，反应
稳定，检测多态性能力较强。有关云锦杜鹃居群的
遗传多样性和遗传分化将另文发表。
参考文献：
卢盛栋．1999．现代分子生物学实验技术[M]．第2版．北京：
中国协和医科大学出版；458-463
方云亿．1989．浙江植物志(第 5卷)[M3．杭州：浙江科学技术
出版社 ：9—1O
Bornet B，Goraguer F，Joly G，et a1．2002．Genetic diversity in Eu-
ropean and Argentinian cultivated potatoes(Solanum tuberosum
subsp．r“6P，’D5“，n)detected by inter-simple sequence repeats(IS—
SRs)[J]． ”o ，45：481-484
Gilbert JE，Lewis RV，Wilkinson MJ，et a1．1998．Devloping an
appropriate strategy tO assess genetic variability in plant germ—
plasm colections[J-]．TheoreticalAppl Gen，98：1 125—1 131
He Q(何桥)，Liang GL(梁国鲁)，Xin JH(谢江辉)．2005．Opti—
mization of the inter-simple sequence repeat reaction system and
its preliminary application in wax apple(Syzygium samaran—
gens)(莲雾ISSR反应体系的优化与应用)[J]．．，Fruit Sci(果
树学报)，22(2)：186—189
Li JM(李钧敏)，Ke SS(柯世省)，Jin ZX(金则新)．2002．Extrac-
tion and determination of DNA from Heptacodium miconioides
(濒危植物七子 DNA的提取及分析)[J]．Guihaia(广西植
物)，22(6)：499—502
Xi JB(席嘉宾)，Zheng YZ(郑玉忠)，Yang ZY(杨中艺)．2004．
Establisliment and optimization of 1SSR reaction system for Car—
pet grass(地毯草 ISSR反应体系的建立与优化)[J]．Acta Sci
Nat UnivSunyatseni(中山大学学报(自然科学版))，43(3)：79
— 84
Zietkiewiez E，Rafalski A，Labuda n 1994．Genome fingerprinting
by simple sequence repeat(ISSR)·-anchored polymerase chain re·-
action amplifcation[-J-]．Genomics，20：176—183
维普资讯 http://www.cqvip.com