全 文 ：中国生态农业学报 2012年 2月 第 20卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Feb. 2012, 20(2): 231−235


* 教育部科学技术研究重点项目(02010)资助
** 通讯作者: 彭永康, 教授, 博士生导师, 主要从事植物细胞蛋白质组学研究。E-mail: pykcell@yahoo.com.cn
党晨(1990—), 大学本科, 主要从事植物细胞遗传研究。E-mail: dangchen1990@163.com
收稿日期: 2011-06-17 接受日期: 2011-10-28
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.00231
利用蛋白质组技术分析 Cd2+对萝卜幼苗生长的影响*
党 晨1 高 越2 阎 晗2 彭永康2**
(1. 中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100193; 2. 天津师范大学生命科学学院 天津 300387)
摘 要 以生长 3 d的萝卜幼苗为材料, 分析 10~150 μmol·L−1 Cd2+处理 12 h后幼苗的生长及蛋白质组的变化。
结果表明, 不同浓度 Cd2+处理导致幼苗生长严重受抑, 幼苗高度从对照组的 3.80±0.68 cm 降至 3.41±0.64 cm
(10 μmol·L−1 Cd2+处理, P<0.01)、1.61±0.37 cm (50 μmol·L−1 Cd2+处理, P<0.01)、1.26±0.11 cm (100 μmol·L−1 Cd2+
处理, P<0.01)和 0.80±0.14 cm (150 μmol·L−1 Cd2+处理, P<0.01); 胚根生长也明显受到影响, 分生组织细胞有丝
分裂受抑 , 幼苗鲜重下降 ; 叶绿素 (a+b)含量 [mg·g−1(FW)]从对照组的 6.72±0.05 分别下降至 6.66±0.17、
6.02±0.15、5.38±0.07和 3.94±0.06。蛋白质组技术分析表明, 叶片中有 50多个蛋白质斑点产生差异表达现象,
其中 9个蛋白质斑点的归属得以鉴别, 分别是斑点 1 PWWP domain containing protein、斑点 2 AAA-type ATPase
family protein、斑点 3 NB-ARC domain containing protein、斑点 4 Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC)、斑
点 5 Deoxycytidylate deaminase、斑点 6 Maturase K、斑点 7 GRAS family transcription factor、斑点 8 Resistance
protein和斑点 9 Puroindoline B (pin), 其功能涉及 DNA功能修饰(甲基化)、能量代谢、信号转导、蛋白质合成、
基因转座与剪切和不良环境条件防御等。
关键词 萝卜 Cd2+胁迫 叶绿素(a+b)含量 蛋白质组技术 串联质谱 幼苗生长
中图分类号: Q89 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)02-0231-05
Effects of Cd2+ stress on radish (Raphanus sativus) seedling growth
based on proteome technique
DANG Chen1, GAO Yue2, YAN Han2, PENG Yong-Kang2
(1. College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
2. College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)
Abstract Three-day-old radish seedlings were treated with 10~150 μmol·L−1 Cd2+ for 12 h for determination of the effects of Cd2+
on seedling growth and proteome by using 2-DE technique and MALDI-TOF MS. The results showed an obvious inhibition of seed-
ling growth. Seedling height decreased from 3.80±0.68 cm under the control to 3.41±0.64 cm under 10 μmol·L−1 Cd2+ treatment (P <
0.01), 1.61±0.37 cm under 50 μmol·L−1 Cd2+ treatment (P < 0.01), 1.26±0.11 cm under 100 μmol·L−1 Cd2+ treatment (P < 0.01) and to
0.80±0.14 cm under 150 μmol·L−1 Cd2+ treatment (P < 0.01). Root growth was also obviously inhibited. Cell mitotic inhibition was
noted in root tip meristem. Seedling fresh weight decreased from 10.92±0.86 g under the control to 9.93±0.77 g under 10 μmol·L−1,
4.52±0.13 g under 50 μmol·L−1, 3.65±0.07 g under 100 μmol·L−1 and to 1.03±0.01 g under 150 μmol·L−1 Cd2+ treatments. Similarly,
chlorophyll (a+b) content [mg·g−1(FW)] declined from 6.72±0.05 to 6.66±0.17, 6.02±0.15, 5.38±0.07 and 3.94±0.06, respectively.
Proteomic techniques analyses showed that treating seedlings with 100 μmol·L−1 Cd2+ altered over 50 protein species. 9 protein spots
were identified via the MS/MS approach. The identified protein sports included: spot-1 (PWWP domain containing protein), spot-2
(AAA-type ATPase family protein), spot-3 (NB-ARC domain containing protein), spot-4 [phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC)],
spot-5 (deoxycytidylate deaminase), spot-6 (maturase K), spot-7 (GRAS family transcription factor), spot-8 (resistance protein) and
spot-9 [puroindoline B (pin)]. These identified Cd2+ responsive proteins were possibly involved in DNA function modification (DNA
methylation), energy metabolism, cell signal transduction, protein biosynthesis, gene transposition, intron splicing and defense re-
sponse. This suggested that several protein types were responsive to Cd2+ stress. Proteome technique was applicable in studying phy-
232 中国生态农业学报 2012 第 20卷


siological and biochemical mechanisms of adaptation and tolerance of plant to heavy metals.
Key words Radish, Cd2+ stress, Chlorophyll (a+b) content, Proteome, MS/MS method, Seedling growth
(Received Jun. 17, 2011; accepted Oct. 28, 2011)
Cd2+是一种严重污染土壤的重金属, 由于杀虫
剂、有机磷农药、去污剂的过量使用[1], 使土壤中的
Cd2+污染日益严重。由于Cd2+可以抑制作物正常的光
合作用 [2−3], 使许多参与光合作用的蛋白质失活 [4],
导致作物处于亚致死状态[5], 作物干物质积累减少,
叶面积和光合色素含量降低, 严重影响作物产量。
已有大量文献表明, Cd2+可以通过农产品进入人类
食物链 , 严重影响人类健康 , 因此Cd2+污染对农作
物产量损失和人体健康的影响早已引起研究者的高
度重视。如Cd2+污染对水稻[6−7]、拟南芥[8−9]、油菜[10]、
杨树 [11]等作物蛋白质组的影响相关研究发现, Cd2+
胁迫后水稻和拟南芥中多种酶系统如光合作用、氧
化还原、脱氢及防御相关蛋白产生变化。油菜根系
中多种氧化还原酶、脱氢酶在氧化还原调控、细胞
离子通道连接、高浓度Cd2+体内积累的忍耐与适应
等起了重要作用; 杨属植物中则发现与多种调控胁
迫相关的蛋白质。Cd2+诱导人体肾脏损伤、肿瘤诱
发[12−14]的相关研究也有较多报道。天津是一个重金
属Cd2+污染较为严重的城市[15], 由于城市工业废水
的排放, 使近郊农田Cd2+污染严重。天津的沙窝萝卜
是一种蔬菜和水果兼用型地方优势作物品种, 但近
10多年来, 品质和产量下降, 虽然这与化肥的使用
和种性退化有重要关系, 但农田中的Cd2+污染也是
一个不可忽视的重要原因。
本工作以小沙窝萝卜(Raphanus sativus)为材料,
利用蛋白质组分析技术, 分析了不同浓度Cd2+对萝
卜幼苗期生长的有害影响, 并从蛋白质组角度对有
害影响的机理进行了探讨, 为生产上早期检测蔬菜
Cd2+毒害及蔬菜的安全生产提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料与培养
小沙窝萝卜种子用0.1% HgCl2消毒5 min, 自来
水冲洗2次, 铺于蒸馏水湿润的滤纸上, 置培养皿中
水培。培养条件: 白天22 , ℃ 晚上18 , 16 h℃ 光照, 8
h黑暗连续培养。3 d后根施10 μmol·L−1、50 μmol·L−1、
100 μmol·L−1、150 μmol·L−1 CdCl2溶液, 试验设3次重
复。根施12 h后测定苗高、根长和鲜重, 幼苗高度和
胚根长度每个重复各取100株, 鲜重取10株。收获叶
片用于蛋白质分析。
1.2 叶片蛋白制备
按照Yan等 [16]的方法制备蛋白质 , 以液氮研磨
叶片组织成粉末 , 将粉末悬浮于含0.07%(w/v)DTT
的10%冷丙酮, –20 ℃下温育1 h, 然后在3 500 ×g下
离心 5 min, 弃上清，将沉淀重悬在含有 0.07%
(w/v)DTT的丙酮中, 在–20 ℃下温育1 h后, 1 500 ×g
离心30 min, 这一步骤重复3 次。弃掉上清，留沉淀
并冻干, 然后溶解于样品缓冲液[含8 mol·L−1尿素,
35 mmol·L−1 Tris, 4%(w/v)CHAPS, 1% pH 5~7两性离
子, 0.4% pH 3~10两性离子, 1%(w/v) DTT], 参考
Bradford[17]的方法测定蛋白质含量 , 并以牛血清白
蛋白(BSA)作为标准。
1.3 2-DE分析
参阅Castro等 [18]的方法进行蛋白质的2-DE分
析。利用pH 3~10 IPG胶条 , 长度为13 cm, 根据
Bio-Rad产品说明书操作。取每个待分析样品各60 μg,
用样品缓冲液稀释至300 μL, 将干胶条在含待测样
品的缓冲液中水化10 h (300 V), 使待测蛋白质样品
吸入胶条中。
第1向等电聚焦程序如下: 分别在300 V 和1 000
V电泳1 h, 然后将电压调至8 000 V电泳2 h; 电泳结
束后胶条在平衡液(60 mmol·L−1 Tris-HCl, pH 6.8,
1% DDT, 1%甘氨酸, 2% SDS)中平衡20 min。电泳的
第2向等电聚焦程序[19]为12.5% SDS-PAGE; 将经聚
焦后的凝胶条放在垂直板状胶的上面, 用1%的琼脂
糖[含0.15 mol·L−1 Bis-Tris-HCl(0.1 mol·L−1)和0.2%
(W/V)SDS]封胶, 并使其聚合; 80 V电泳5 h。其结果
经3 次重复。采用银染法 [20]显色。对MS分析胶用
GS-800考马斯亮蓝染色。用色谱扫描记录图像, 用
PDQuest软件进行凝胶斑点检测、匹配和差异斑点鉴
别 , 确定对照和处理组之间有差异的蛋白质斑点 ,
进行质谱分析。
1.4 凝胶消化和 MALDI-TOF MS分析
从制备胶上切下经鉴别有差别的蛋白质斑点 ,
用超纯水洗 3次 , 50 mmol·L−1NH4HCO3脱色 2次 ,
100%乙腈干燥, 用0.1%TFA在50%乙腈溶液37 ℃消
化过夜, 将制备物混匀、冻干, 溶解在含有1%TFA
和50%的5 mg·mL−1CHCA中。利用ABI 4700型(USA)
正离子生物质谱仪进行MALDI-TOF MS分析。以胰
蛋白酶自动降解片段为内部标准校正。通过
MASCOT软 件 (http://www.matrixscience.com/), 在
NCBInr绿色植物数据库(Viridiplantae)进行查询, 为
了表明新鉴别的蛋白质的可靠性, 除个别功能未确
第 2期 党 晨等: 利用蛋白质组技术分析 Cd2+对萝卜幼苗生长的影响 233


定的推测蛋白质斑点外, 每个被鉴别的蛋白质序列
覆盖率至少达15%, 得分在35以上 , 肽质量数误差
范围为±0.1 Da, 未水解酶切位点数为1。
1.5 统计分析方法
数据以平均数±标准差表示 , 各数据间差异采
用单因子方差分析 (ANOVA)和 t检测进行统计。
P<0.05表示差异显著, P<0.01表示差异极显著[21]。
2 结果与分析
2.1 Cd2+胁迫下小沙窝萝卜生长特性与叶绿素含
量变化
从表1可以看出, 小沙窝萝卜是一种对Cd2+十分
敏感的作物, 10 μmol·L−1、50μmol·L−1、100 μmol·L−1
和150 μmol·L−1浓度Cd2+胁迫下, 萌发3 d的幼苗高
度、根系长度、幼苗鲜重及叶绿素(a+b)含量都有明
显变化。10 μmol·L−1、50 μmol·L−1、100 μmol·L−1和
150 μmol·L−1 Cd2+处理12 h后, 幼苗胚根长度、幼苗
高度及鲜重均极显著下降(P<0.01); 并明显存在随处
理浓度的增加, 幼苗生长抑制严重的现象, 尤其是胚
根呈膨大、弯曲状, 而细胞学检测表明, 凡经Cd2+溶液
处理过的根分生组织内均未发现有丝分裂细胞存在,
而全部处于分裂间期。
叶绿素 (a+b)含量变化也反映出小沙窝萝卜对
Cd2+十分敏感, 50 μmol·L−1Cd2+处理下小沙窝萝卜幼
苗叶绿素含量开始下降, 100 μmol·L−1、150 μmol·L−1
Cd2+溶液处理叶绿素含量下降明显(表1)。

表 1 不同浓度 Cd2+处理对小沙窝萝卜幼苗生长和叶绿素含量的影响
Table 1 Effects of different Cd2+ concentrations on growth and chlorophyll contents of radish seedlings
Cd2+浓度
Cd2+ concentration (μmol·L−1)
胚根长度
Radicle length (cm)
幼苗高度
Seedling height (cm)
幼苗鲜重
Seedling fresh weight (g)
叶绿素(a+b)含量
Chlorophyll (a+b) content [g·g−1(FW)]
0 4.15±0.042 3.80±0.68 10.92±0.86 6.72±0.05
10 3.90±0.095* 3.41±0.64* 9.93±0.77* 6.66±0.17*
50 2.13±0.290* 1.61±0.37* 4.52±0.13* 6.02±0.15*
100 1.96±0.100* 1.26±0.11* 3.65±0.07* 5.38±0.07*
150 0.89±0.010* 0.80±0.14* 1.03±0.01* 3.94±0.06*
胚根长度和幼苗高度为100株测定的平均值, 幼苗鲜重为10株测定的平均值; * 表示P<0.01水平差异显著。Data are the averages of at least
100 plants for radicle length and seedling height, and 10 plants for seedling fresh weight, respectively. “*” means significant difference at P < 0.01.

2.2 Cd2+胁迫下小沙窝萝卜幼苗叶片蛋白质的差
异表达
图 1a 是未经 Cd2+处理的 2-DE 图谱, 有多于
1 000 个蛋白质斑点被检测到 ; 图 1b 则是经 100
μmol·L−1Cd2+处理后的 2-DE 图谱, 经 Cd2+处理后消
失的蛋白质斑点有 5个(箭头 1~4和 9所指), 有明显
含量变化的蛋白质斑点共 4个(箭头 5~8所指)。



图 1 小沙窝萝卜幼苗叶片对照(a)和 100 μmol·L−1Cd2+
处理(b)的蛋白质 2-DE图谱
Fig. 1 Two-dimensional electrophoresis profiles of leave protein
of radish seedlings under treatments of control (a) and 100
μmol·L−1 Cd2+ (b)

应该说明的是, 本研究对不同 Cd2+处理小沙窝
萝卜蛋白质组变化做了比较分析, 但变化最为明显
的是 100 μmol·L−1Cd2+处理。因此, 本研究中所记录
的蛋白质组分析结果是在该浓度下得出的。
2.3 与 Cd2+胁迫相关差异表达蛋白的质谱鉴别
表 2为 100 μmol·L−1Cd2+处理 12 h后小沙窝萝
卜叶片内经质谱(MALDI-TOF-MS)鉴别后的相关蛋
白质, 共对 18 个蛋白质斑点进行了质谱鉴别, 其中
鉴别出 9个斑点的归属及部分氨基酸序列, 但其余 9
个斑点因序列匹配力偏低而没有被鉴别。
3 讨论
不同浓度 Cd2+处理小沙窝萝卜幼苗后, 一个明
显的现象是幼苗生长变缓 , 鲜重下降 , 叶片发黄 ,
最后整株枯死。根尖分生组织的检测结果表明, Cd2+
完全抑制了胚根分生组织细胞分裂。在本试验所设
计的不同浓度 Cd2+处理下, 小沙窝萝卜根尖分生组
织中均未检测到有分裂细胞存在。叶绿素(a+b)含量
变化结果也表明 Cd2+明显降低了叶片叶绿素含量。
通过上述结果可以初步认定, Cd2+抑制胚根内细胞
分裂和叶片内叶绿素的正常合成可能是影响小沙窝
萝卜幼苗正常生长并最后导致死亡的原因之一。
为了从生物化学水平探讨作物幼苗的 Cd2+损害
机理, 本试验对经 Cd2+处理 12 h的小沙窝萝卜幼苗
叶片蛋白质组进行了分析, 结果表明有多于 50种的
蛋白质呈现差异表达。仅从经质谱鉴别后得出归属
的 9个蛋白质的生化特性看, 其功能涉及 DNA功能
234 中国生态农业学报 2012 第 20卷


表 2 100 μmol·L−1Cd2+处理下小沙窝萝卜幼苗叶片差异表达蛋白质斑点的质谱鉴别
Table 2 Differentially expressed protein spots identified by MALDI-TOF-MS method of radish seedling leaves under
100 μmol·L−1 Cd2+ stress
斑点
Spot
No.
登录号
Accession
No.
分子量
Molecular
weight
(KD)
等电点
Isoelectric
point
(PI)
序列覆盖率
Sequence
coverage
(%)
得分
Score
蛋白质
名称
Protein name
序列
Sequence
物种
Species
1 gi/15232737 79.2 5.36 24 51 PWWP
domain
containing
protein
EGCGNFASAGDNGMEKEVEPDMVCSHGADLSD
VKVVKISDSDLVWAKSHPWWPGQVFDASAATD
KIEEGLACSCISEEVYQKIKNDRKNNLSAGDKITP
QKARKSFGIGASILKKEAPSTNLVEDPMLESRDL
KDSSKKEAANVADEKSIMDSNLTGEKISGLDLRE
QPSNKNCSGGSDSCK
拟南芥
Arabidopsis thaliana
2 gi/18398708 71.1 8.99 29 43 AAA-type
ATPase family
protein
EINSSPHSKQVFDLMRKLAELAAEKEHNEAIQAS
KEKARIATEEQIQAQQRRMLLDKINGERILGQPS
LIRESSMGRLSTAAGAAASAEGEKPLENVILHRK
SGLDYAMMTGGDVAPLGAQAVTKTGDQSRDIVL
VLATNRPGDLDSAVTDRLYLNKYLMGDDKKGE
KKSQKITIEGDLTDQVIK
拟南芥
A. thaliana

3 gi/110288575 75.1 7.98 19 46 NB-ARC
domain con-
taining protein
MLLDEARGKWCCVSDVFDVVTIANSICMSTERY
LIVLDHVWNRKGGMGSVVLTTTRNAEVARYLN
TESLPIRPRHLLHLRDMKYMTSLRHLYTNGCLRL
KCMPPELGQLTSIRTLTYFVVGASSGCSTLR
水稻
Oryza sativa
4 gi/18073820 41.3 7.82 23 40 Phosphoe-
nolpyruvate
carboxylase
LSAAWQLYKAQEELIKVAKQFGIKQEWRELMDE
MAVVATEEYRELLEGDPYLKDSYITTLNGCQAYT
LKRIRDPNFHGNLRPHLSK
银杏
Ginkgo biloba
5 gi/223507699 30.6 8.49 31 44 Deoxycytidy-
late deaminase
MYAAASAAGNSACLSRRCWNYGGKLRGLIEFSR
AIHAEMHAILTALRIFVTTYPCHSCARHIVAAGIK
KSLATKLHGDAMTESEQTSDK
蓖麻
Ricinus communis
6 gi/212901996 61.5 9.44 20 44 Maturase K MEKYQVYLELDRRLITRMYQQTHLIISTNDSNK
NKYFFNLRSIHSIFPLFEDKVSFFHLLRFFFYYCN
WNSLITSKKDPFIHYVRYQEKSILVSKIKYILRLSC
ITK
马唐
Digitavia radicosa
7 gi/224131944 31.4 6.01 35 41 GRAS family
transcription
factor
ITCVNGSKAILEKLGQRLVKEAESVGVPFQFNSIN
ASLRSMSPTLLFVVEQEAHHNLNRLVDRFWHSS
GEDAKQIMDAFGKNGYKTVIERTGLMICWR
杨
Popuplus trichocarpa
8 gi/21950716 16.7 8.59 36 36 Resistance
protein
QAIRMAGATCDQLMTKTELLPHLMDSIRGKSVF
LVLDDVWKMNNYDGLELLMKK
狼尾草
Pennisetum glaucum
9 gi/6689387 16.7 8.95 56 39 Puroindoline
B
LSSCKDYVMERCFTMKGGCEHEVREKCCQQLS
QIAPQCRCNSIRGMIQGKLGGFFGIWRGDVFKQI
QRAQSLPSKCNMGADCK
小麦
Triticum monococcum

修饰、能量代谢、信号转导、蛋白质合成、基因转
座与剪切、不良环境条件防御等。如, 斑点 1 PWWP
domain containing protein主要参与微卫星DNA甲基
化[22]; 斑点 2 AAA-type ATPase family protein是一
类位于线粒体内膜上的蛋白质家族, 与能量代谢有
关[23]; 斑点 3 NB-ARC domain containing protein参
与抗性基因相关信号转导 [24]; 斑点 4 Phosphoe-
nolpyruvate carboxylase(PEPC)是植物初生代谢中的
关键酶, 位于细胞质和叶绿体内, 其主要功能是参
与氨基酸的合成[25]; 斑点 5 Deoxycytidylate deami-
nase 参与细胞增殖, 而在植物叶绿体内主要与叶绿
体 tRNA的编辑加工有关[26]; 斑点 6 Maturase K和
斑点 7 GRAS family transcription factor主要涉及基
因内含子的剪切与基因转座 ; 斑点 8 Resistance
protein 是一类参与不良环境条件防御的蛋白质; 斑
点 9 Puroindoline B(pin)为小麦面粉中决定籽粒硬度
的蛋白, 但其同时为一种抗菌多肽, 能抵御真菌对
植物的感染和侵噬, 转 pin 基因的水稻提高了对稻
瘟病和纹枯病 2种疾病的抵抗能力[27]。
蛋白质组技术是近 10 多年来发展起来的一种
高通量研究技术, 可以研究植物某一特定组织或某
一特定环境因子胁迫下体内蛋白质组的变化。由于
Cd2+可以干扰蛋白质的合成[4], 因此, 近几年来很多
研究者利用转录组学(transcriptome)技术研究植物在
Cd2+胁迫下基因表达调控特性[28−32], 观察 mRNA 变
化与合成蛋白质间的相关性 [33], 虽然取得进展, 但
也有很多限制因素[34], 如基因的表达调控不仅在转
录水平上进行, 而且也可以发生在转译和转译后修
饰水平[34]。因此, 利用转录组方法, 不能揭示转译和
转译后发生变化的蛋白质, 比较而言, 蛋白质组分
析技术能弥补这方面缺陷, 并获得更大量更全面的
试验结果。从本试验结果看, 有多于 50种蛋白质经
Cd2+胁迫后呈现差异表达, 虽然仅 9 个蛋白质的归
属得到鉴别, 但其功能涉及面广, 因此利用蛋白质
组分析技术探讨萝卜苗期 Cd2+毒害机理是可行的。
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