全 文 ：中国生态农业学报 2013年 11月 第 21卷 第 11期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2013, 21(11): 1426−1433


* 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )项目 (2012CB126309)、国家自然基金联合基金项目 (U1205021)和国家自然科学基金项目
(31201694)资助
** 通讯作者: 林文雄(1957—), 男, 博士, 教授, 研究方向为植物生理与分子生态学。E-mail: lwx@fjau.edu.cn
† 同等贡献者 : 李振方 (1981—), 男 , 博士 , 讲师 , 研究方向为药用植物生理与分子生态学 , E-mail: sxlizhenfang@163.com; 杨燕秋
(1989—), 女, 硕士生, 研究方向为生物化学与分子生物学, E-mail: fjyangyanqiu@163.com
收稿日期: 2013−04−02 接受日期: 2013−09−05
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2013.30313
地黄强致病型病原菌的分离及其专化型鉴定*
李振方 1,2†　 杨燕秋 2†　 吴林坤 2 舒 阳 2 赵永坡 2
黄伟明 2 张重义 1 林文雄 2**
(1. 福建农林大学作物科学学院 福州 350002; 2. 福建农林大学农业生态研究所 福州 350002)
摘 要 为探索地黄连作栽培中真菌病害的大规模爆发机制, 明确自毒物质所介导的土壤病原菌增多的根际
生物学过程, 本研究利用 PDA 平板法, 经过显微鉴定和真菌 ITS 鉴定分析, 从地黄连作土壤和发病植株中分
离到镰刀菌菌株 31 株, 并进行了致病性检测。结果表明, 串珠镰刀(菌株编号 RPP009)、茄病镰刀(菌株编号
CCS013)、禾谷镰刀(菌株编号 CCS024)、雪霉叶枯病菌(菌株编号 CCS038)和尖孢镰刀(菌株编号 CCS043)在接
种 3 d后就表现出明显的致病能力, 严重影响地黄幼苗的株高(为对照的 23.40%~30.20%)和植株鲜重(为对照的
23.58%~38.94%), 并引起地黄植株变黄畸形, 根毛和须根减少, 在接种 2 周后致使全部植株枯萎死亡, 具有很
强的致病性。专化型鉴定表明, 菌株 Fusarium oxysporum (菌株编号 CCS043)和 Monographella nivale (菌株编
号 CCS038)只侵染地黄, 不侵染其他试验材料, 植株感病初期在中午时分下部叶片缺水萎蔫, 早晚又有所恢复,
如此反复, 至 3~5 d, 叶片则不能恢复正常直立, 枯萎死亡。镜检发现, 感病植株茎部维管束变褐色至暗褐色,
后逐渐导致周围海绵组织破裂, 进而致使地下块根逐渐变黑腐烂, 初步判定两株菌株为地黄专化型病原菌。
关键词 地黄 根际微生态 镰刀菌 连作障碍 病原真菌
中图分类号: S567.21 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2013)11-1426-08
Isolation of highly pathogenic pathogens and identification of formae speciales
of Rehmannia glutinosa L.
LI Zhen-Fang1,2, YANG Yan-Qiu2, WU Lin-Kun2, SHU Yang2, ZHAO Yong-Po2,
HUANG Wei-Ming2, ZHANG Zhong-Yi1, LIN Wen-Xiong2
(1. School of Crop Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Institute of Agroecology, Fujian
Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract Rehmannia glutinosa is an important medicinal plant in China that requires 8−10 years plastochrone for replanting,
making it almost impossible for continuous cropping. Previous studies had shown that soil-borne diseases caused by microbial
imbalance in rhizosphere microecology were the main obstacles to continuous cropping of R. glutinosa. However, little has
been reported on the identification of formae speciales of R. glutinosa. Thus this study used the PDA-plate method after
microscopic identification and analysis of ITS fungi identification to successfully screen 31 strains of Fusarium from soil
under continuous cropping of R. glutinosa. Pathogenic detection results showed that strain Fusarium moniliforme (No.
RPP009), F. solani (No. CCS013), F. graminearum (No. CCS024), Monographella nivalis (No. CCS038) and F. oxysporum
(No. CCS043) were highly pathogenic. These strains severely decreased the height (by 23.40%~30.20% compared with CK)
and fresh weight (by 23.58%~38.94% compared with CK) of R. glutinosa seedlings within 3 days after inoculation,
subsequently causing organ deformation and death after 2 weeks. Further host biotype identification test results showed that F.
oxysporum (No. CCS043) and M. nivalis (No. CCS038) strains only infected R. glutinosa and not other materials used in the
experiment. The leaves of lower part of disease plants repeatedly turned hydropenic at noon and eventually withered followed
第 11期 李振方等: 地黄强致病型病原菌的分离及其专化型鉴定 1427


by plant death after 3−5 days. Microscopic examination showed that stem vascular system in diseased plants turned brown or
duck which led to the disagglomeration of spongy tissues. Underground root tubers then eventually ducked and decayed. The
preliminary analysis suggested that the two identified strains were formae speciales of R. glutinosa.
Key words Rehmannia glutinosa L., Rhizosphere micro-ecology, Fusarium fungus, Continuous cropping obstacle,
Pathogenic pathogen
(Received Apr. 2, 2013; accepted Sep. 5, 2013)
地黄(Rehmannia glutinosa)是我国重要的药用植
物之一, 产于河南省焦作地区的武陟、沁阳和博爱
一带 (即古怀庆府)的“怀地黄”尤负盛名。但近年来,
地黄连作障碍问题日益突出 , 每茬收获后须间隔
8~10年方可再种。重茬连作植株比较弱小, 地下部
形成较多须根, 且不能正常膨大为有商品价值的块
根[1−2], 连作障碍问题已成为地黄栽培的瓶颈, 已经
成为中药农业亟待解决的问题。
多年的研究及生产实际情况表明, 最终导致连
作减产的主要原因是根际微生态失衡而产生的土传
病害严重发生。早在20世纪80年代, 日本学者成田
保三郎 [3]研究发现作物连作后, 土壤中的有益微生
物减少, 有害微生物增加, 根表真菌特别是镰刀菌
数量大幅增加。解红娥等[4]研究认为随着地黄连年
限的增加, 土壤真菌病害越来越严重, 轻者感病率
20%~30%, 重者感病率达50%以上 , 个别地块甚至
绝收, 成为地黄栽培种植的重要威胁。王明道等 [5]
运用传统平板培养方法及变性梯度凝胶电泳(DGGE)
法研究认为, 地黄连作引起土壤根际、根外细菌数
量减少, 根际放线菌数量增加, 且真菌种类和数量
均发生较大变化, 尤其是木霉和黄曲霉数量增加明
显, 土壤生态系统已开始失调。
随近年来对根际微生态环境中植物−土壤−微生
物互作的深入研究, 越来越多的研究者认为植物根
系分泌物在植物和环境的相互作用中起着传递信息
的作用, 具有很强的生态效应[6]。鞠会艳和韩丽梅[7]
研究表明, 连作和轮作大豆根系分秘物对半裸镰孢
菌(Fusarium semitectum)、粉红粘帚菌(Gliocladium
roseum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等具有
明显的化感促进作用。刘峰等[8]通过水苏糖铵盐培
养液对土壤细菌生长的试验, 认为大多数土壤细菌
不能很好地利用水苏糖作为其能源物质, 因此可能
造成根际细菌的种类和数量大幅下降, 仅少数可较
好利用水苏糖的土壤细菌活动旺盛, 逐步演化为“优
势菌”, 从而造成地黄根部土壤微生物失衡。本研究
小组前期研究认为, 地黄自毒物质所影响下的土壤
微生态劣化, 特别是病原真菌增多是导致地黄连作
障碍的一个重要原因[9−10]。
由此可见, 根际微生态环境中植物−土壤−微生
物是一连续的互作系统, 植物通过释放化感物质、
信号物质, 并通过根际生物间的互作关系, 影响着
根际生物的种群特征和功能多样性; 而这些特异微
生物又反过来对植物根系生长发育产生影响。因此,
通过对根际微生态环境的合理调控, 改善根际环境,
促进植物生长发育, 调控和改变根系分泌物的组分
和生物之间互作作用, 抑制病原生物的快速大量繁
殖, 对缓解和控制农业连作生产体系中的土壤生物
学障碍问题具有重要意义。
但是, 目前对于地黄连作过程中病原性真菌分
离、鉴定的报道还相对较少, 这也未能更加深入地
明确自毒物质所介导的土壤病原菌增多的根际生物
学过程。基于此, 本研究从地黄连作土壤和发病植
株中分离地黄镰刀菌, 经ITS序列分析鉴定, 并通过
回接发病试验筛选出地黄专化型病原菌, 为后续研
究中阐释连作介导的环境灾变过程提供有参考价值
的依据和试验材料。
1 材料与方法
1.1 土样采集及病原菌分离
病原菌采自于“怀地黄”定位研究站——河南省
焦作市温县农业科学研究所的连作地黄根际土壤和
地黄发病植株(为根部膨大期), 同时收集该地区的
玉米、大豆、番茄和小麦等作物种子, 保存备用。
1.1.1 病原菌分离
地黄病株病原菌分离参考文献[11], 将病株用自
来水冲去泥沙附土, 在样本的病健交界处切取0.5 cm×
0.5 cm×0.3 cm的小块组织, 用75%酒精消毒1 min,
然后用0.5% HgCl2消毒2~3 min, 并用无菌水冲洗4
次, 用无菌吸水纸吸取表层水分后削去表层和两端
组织, 转入含有链霉素(100 µg·mL−1)、氨苄青霉素
(100 µg·mL−1)的PDA培养基中, 恒温26 ℃培养3 d,
挑取菌丝培养并经多次纯化转接后保存备用。
地黄连作土壤病原菌分离参考文献[12], 称取
10 g采集的土样, 加入90 mL无菌水和玻璃珠, 置于
摇床中26 ℃、180 r·min−1恒温振荡10 min, 静置45 s
后取10 mL上层液体稀释成浓度为10−5, 取200 µL
均匀涂布于含有链霉素(100 µg·mL−1)、氨苄青霉素
(100 µg·mL−1)的PDA培养基上, 恒温26 ℃培养3 d,
1428 中国生态农业学报 2013 第 21卷


挑取菌丝培养并经多次纯化转接后保存备用。
1.1.2 镰刀菌显微鉴定
将分离的病原菌接种于PDA平板上, 26 ℃培养3 d,
肉眼观察菌落形态及其色素颜色, 插片培养3 d后, 经
结晶紫染色1 min、水洗、干燥后, 显微观察菌丝形
态特征及其分枝、分隔、分生孢子、厚垣孢子等性
状 , 并依据王拱辰等 [13]和Booth[14]镰刀菌分离标准
进行鉴定分析。
1.2 镰刀菌致病性检测
在显微鉴定的基础上, 将疑似的镰刀菌菌株接
种于镰刀菌产孢培养基上[13]活化培养2 d后, 用打孔
器在菌落边缘制成直径1 cm的菌饼, 转接于装有100 mL
产孢液体培养基的锥形瓶中, 于26 ℃、120 r·min−1
摇菌培养3 d。
在超净工作台中, 菌液经两层无菌擦镜纸过滤
后收集滤液 , 利用血球计数法显微观察孢子数量 ,
用液体培养基调至孢子终浓度为5×105个·mL−1。同
时将无菌繁殖的地黄组培苗浸入上述孢子悬浮液
中10 min后, 在根部和茎基部划破伤口, 用消过毒
的毛笔蘸上菌液涂抹伤口, 移入装有灭菌基质土的
育苗钵中, 生长3 d后采用摩擦接菌法接种移栽好的
地黄苗, 同时以太子参专化型镰刀菌为对照, 按照
上述方法处理地黄无菌苗。
将对照组与处理组地黄苗置于26 ℃控温培养室
中 , 每日光照时间12 h(8:00—20:00), 光照强度为
(4.17±0.18)×103 lux, 处理 7 d后观察发病情况, 对
发病植株进行症状和组织的病理观察。
根据Wu等[15]的方法并略作修改, 通过目测地黄
幼苗在接种后7~21 d内表现出的感病症状, 特别是根
茎的腐烂程度等, 将植物发病程度(disease severity
scale)分为5个等级, 0: 没有感病症状表现; 1: 接种
的9株地黄幼苗少于2株出现根部腐烂; 2: 接种的9
株地黄幼苗有3~4株出现根部腐烂; 3: 接种的9株地
黄幼苗有5~6株出现根部腐烂; 4: 接种的9株地黄幼
苗有8株以上出现根部腐烂。
同时测量地黄株高和地黄幼苗鲜重, 测试获得
的原始数据均转化为镰刀菌菌株的致病指数[15]: 致
病指数(pathogenicity index)=(植物发病程度×发病植
株数)/接种植株数+(对照植株高度−接种地黄植株株
高)/对照植株高度+(对照植株鲜重−接种地黄植株鲜
重)/对照植株鲜重。
1.3 镰刀菌宿主范围检测及地黄专化型菌株筛选
在致病性检测的基础上 , 筛选出7株具有高致
病性菌株, 进一步对其宿主范围进行检测, 分别以
盆栽地黄无菌苗和地黄原产区采集的玉米、大豆、
小麦、番茄为材料, 将4种材料种子经0.5% HgCl2溶
液表面消毒10 min, 用无菌水冲洗两次, 晾干后进
行无菌萌发后, 选择出芽一致的种子播入灭菌蛭石
中育苗(昼/夜温度为26 /20℃ ), ℃ 两周后选长势一
致的幼苗移栽与无菌基质培养土中, 每盆定植3株,
5次重复。
回接试验参照吴洪生[16]的幼苗伤根接种和拌种
处理方法, 采用产孢培养基[15]接种纯化的菌株, 26 ℃、
120 r·min−1恒温振荡培养4 d, 用4层无菌纱布过滤获
得孢子悬液 , 计数后制成浓度为5×105个 ·mL−1的孢
子悬浮液。定植移栽时将上述试验验材料根部和茎
基部划破伤口, 在菌液中浸渍10 min后将孢子悬液
拌入灭菌土壤, 使每克土含105个孢子, 移入试验材
料。接种7 d后观察发病症状, 并依据柯氏法则采用
镰刀菌选择性培养基从发病部位重新分离病原菌 ,
重新鉴定[17]。
1.4 镰刀菌 PCR检测
镰刀菌的分子鉴定采用PCR扩增真菌ITS区序
列, 通过序列的生物信息学比对的方法进行。
1.4.1 镰刀菌 DNA提取
菌株的 DNA 提取参照刘少华等 [18]SDS-CTAB
法并略作修改, 将在 PDA平板上生长良好菌株的菌
丝刮下约 0.5 g至装有液氮的研钵中, 研磨成粉状后
转移至 50 mL离心管中, 加入 10 mL提取液(50 mol·L−1
Tris-HCl、150 mmol·L−1 NaCl、100 mmol·L−1 EDTA),
涡旋振荡, 再加入 1 mL 20% SDS混匀, 将离心管置
摇床内 37 ℃缓慢摇动 1 h, 每管加入 5 mol·L−1 NaCl
溶液 1.5 mL , 缓慢混匀, 加入 1.3 mL CTAB/NaCl溶
液(10% CTAB、0.7 mol·L−1 NaCl), 混匀, 65 ℃水浴
20 min, 每隔几分钟摇 1次, 冷却至室温, 加入等体
积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提液, 在摇床内剧烈摇动
5 min, 10 000 r·min−1 离心 12 min, 上清 12 000 r·min−1
离心 5 min; 上清液移入新管 , 加入 0.6 倍体积预
冷的异丙醇 , −20 ℃放置过夜 , 10 000 r·min−1离心
12 min; 弃上清, 倒置使管壁液体流尽, 70%无水乙
醇洗沉淀, 室温放置干燥 5~10 min, 溶于 200 μL无
菌水中, 加入 RNase A(10 μg·μL−1)2 μL , 37 ℃水浴
30 min后, 利用紫外分光光度计测量 A260值后于−20 ℃
保存备用。
1.4.2 ITS引物设计和 PCR扩增反应
根据已经报道的真菌核糖体转录间隔区保守序
列, 设计病原真菌PCR检测引物。ITS1引物为: 5´-
CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA-3´, ITS4引物为:
5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´。
PCR反应的混合体系为25 μL: dNTP(25 μmol·L−1)
0.5 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL(含Mg2+), BSA 0.2 μL,
引物(10 μmol·L−1)各1 μL, rTaq酶0.2 μL, 模板DNA
第 11期 李振方等: 地黄强致病型病原菌的分离及其专化型鉴定 1429


1 μL(10 ng), H2O 18.6 μL。
PCR反应条件为: 95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性
45 s, 51 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1.5 min, 35个循环, 72 ℃
延伸7 min。反应结束后4 ℃保存备用。
以DL Marker 2 000为分子标量, PCR产物经1%
琼脂糖凝胶电泳检测后, 经用UNIQ-10柱式DNA胶
回收试剂盒(上海生物工程技术有限公司)纯化回收
后测序, 测序结果进行MEGABLAST 比对, 按相似
度大小对供试菌株进行鉴定, 并利用MEGA 5.10软
件构建这些菌株的系统进化树。
2 结果与分析
2.1 镰刀菌的分离与鉴定
通过PDA平板培养法, 经过多次分离纯化后从
连作土壤中分离到病原真菌42株, 从地黄病株中分
离到病原真菌24株。通过插片培养并通过结晶紫染
色后, 进行显微观察, 进一步通过PCR扩增真菌ITS
区序列进行分子鉴定发现, 分离纯化的病原真菌类
群分属子囊菌亚门 (Ascomycota)、接合菌亚门
(Zygomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)和半知菌
亚门(Deuteromycotina)4个亚门, 其中大部分属于子
囊菌亚门, 分属于镰刀菌属(Fusarium)、白霉属(Geo-
trichum)、炭角菌属(Bacillus anthraci)、曲霉属(Asper-
gillus)、酵母菌属 (Saccharomyces)、拟层孔菌属
(Fomitopsis)、丛赤壳属(Nectria)、木霉属(Trichod-
erma)等16个菌属。其中镰刀菌菌属(Fusarium)和赤霉
菌属(Gibberella)真菌在连作土壤中为16种, 分离频率
为38.1%, 在地黄病株中为15株, 分离频率为62.5%。
通过DNA Star软件分析, 并在NCBI网站进行ITS
区序列的MEGABLAST同源性比对分析。结果表明,
31株镰刀菌分属于尖孢镰刀菌(分离频率为29.03%)、
禾谷镰刀菌(F. graminearum, 分离频率为35.48%)、串
珠镰刀菌(F. moniliforme, 分离频率为12.90%)、腐皮
镰刀菌(F. solani, 分离频率为16.13%)等。进一步利用
MEGA 5.10软件 , 并基于最大简约算法 (Maximum
Parsimony, MP), 进行1 000次自展(bootstrap)检验后,
构建了分离菌株的系统进化树(图1)。
2.2 镰刀菌的致病性分析
将纯化的31株菌株回接到地黄无菌苗中进行致
病性检测的试验结果发现, 31株菌株在不同程度上
引起地黄植株感病, 甚至造成植株死亡(表1), 对照
组地黄幼苗生长正常 , 未表现出感染镰刀菌的症
状。通过观察地黄苗感病的发病程度及感病指数分
析发现 , 有5株镰刀菌对地黄幼苗表现出较强的致
病性(致病指数≥3.00), 分别为串珠镰刀(菌株编号
RPP009)、茄病镰刀(菌株编号CCS013)、禾谷镰刀(菌

图 1 地黄连作土壤和病株中分离真菌的 ITS序列系统
进化树
Fig. 1 Phylogenetic trees of ITS sequence of fungi strains
isolated from replanted soil and diseased plants of rehmannia
菌株编号见表 1 The strain numbers are shown in Table 1.

株编号CCS024)、雪霉叶枯病菌(菌株编号CCS038)
和尖孢镰刀(菌株编号CCS043), 在接种3 d后就表现
出明显的致病能力, 严重影响地黄幼苗的株高(为对
照的23.40%~30.20%)和植株鲜重(为对照的23.58%~
38.94%), 并引起地黄植株变黄畸形, 根部根毛和须
根减少 , 在接种2周后致使全部植株枯萎死亡。而
RPP008(串珠镰刀)和RPP016(尖孢镰刀)两株菌株虽
能造成地黄幼苗叶片失绿降低植株高度(地黄株高
分别为对照的20.39%和18.43%), 引起地黄鲜重下
降(地黄鲜重分别为对照的8.78%和2.74%), 在不同
程度上引起地黄发病, 造成植株枯萎死亡, 但其致
病性不明显(地黄的发病程度小于3)。
2.3 地黄专化型镰刀菌的鉴定
将获得的7株具有较高致病性的菌株分别接种
到玉米、大豆、小麦、番茄等试验材料上观察发现,
雪霉叶枯病菌(菌株编号CCS038)和尖孢镰刀(菌株
编号CCS043)两株菌株只侵染地黄, 不侵染其他试
验材料, 初步判定为地黄专化型镰刀菌。地黄幼苗
1430 中国生态农业学报 2013 第 21卷


表 1 从地黄重茬土壤和发病植株中分离的真菌菌株对地黄的致病性
Table 1 Pathogenic analysis of the fungi strains isolated from replanted soil and diseased plants of rehmannia
菌株编号
Number of strain
菌株分类
Strain classification
平均株高
Shoot length
(cm)
平均鲜重
Fresh weight
(g)
发病植株数
Diseased plant
number
发病程度
Disease severity
scale
致病指数
Pathogenicity
index
RPP001 赤霉菌 Gibberella 5.16±0.31 4.35±0.11 1 1 0.64
RPP003 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 7.34±0.19 3.76±0.18 3 2 1.02
CCS004 禾谷镰刀菌 F. graminearum 5.33±0.22 4.32±0.20 1 1 0.62
RPP005 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 6.43±0.13 5.21±0.15 2 1 0.43
RPP006 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 4.36±0.14 4.65±0.26 3 2 1.25
RPP007 禾谷镰刀菌 F. graminearum 5.15±0.15 3.85±0.12 0 0 0.62
RPP008 串珠镰刀菌 F. moniliforme 1.56±0.24 0.48±0.14 2 1 1.93
RPP009 串珠镰刀菌 F. moniliforme 2.16±0.20 1.74±0.21 8 4 4.96
CCS010 雪腐镰刀菌 F. nivale 6.42±0.15 4.24±0.26 1 1 0.50
CCS011 赤霉菌 Gibberella 5.37±0.85 3.78±0.04 4 2 1.50
CCS013 茄病镰刀菌 F. solani 1.83±0.64 1.53±0.08 6 3 3.48
CCS014 茄病镰刀菌 F. solani 4.33±0.54 3.69±0.32 4 2 1.65
RPP016 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 1.41±0.74 0.15±0.02 3 2 2.45
RPP017 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 4.64±0.43 4.23±0.22 3 2 1.29
RPP018 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 6.78±0.38 3.78±0.24 1 1 0.53
RPP019 禾谷镰刀菌 F. graminearum 5.35±0.26 4.23±0.32 2 1 0.75
CCS020 禾谷镰刀菌 F. graminearum 4.88±0.61 3.86±0.14 3 2 1.32
CCS021 禾谷镰刀菌 F. graminearum 5.26±0.43 4.31±0.27 3 2 1.19
CCS022 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 5.53±0.44 3.86±0.14 2 1 0.79
CCS023 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 6.57±0.21 3.97±0.13 1 1 0.53
CCS024 禾谷镰刀菌 F. graminearum 2.10±0.28 2.13±0.12 8 4 4.89
CCS026 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 5.23±0.54 4.33±0.21 1 1 0.64
CCS033 禾谷镰刀菌 F. graminearum 6.95±0.06 4.41±0.26 2 1 0.51
CCS038 雪霉叶枯病菌 M. nivale 2.31±0.54 1.29±0.15 9 4 5.46
CCS043 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 1.79±0.19 1.33±0.08 9 4 5.52
RPP059 茄病镰刀菌 F. solani 5.18±0.30 3.79±0.23 3 2 1.30
RPP060 禾谷镰刀菌 F. graminearum 4.73±0.16 4.51±0.18 1 1 0.67
RPP061 串珠镰刀菌 F. moniliforme 5.86±0.11 3.73±0.05 4 2 1.44
RPP063 禾谷镰刀菌 F. graminearum 4.23±0.26 4.43±0.16 1 1 0.75
CCS065 禾谷镰刀菌 F. graminearum 3.86±0.04 3.74±0.04 0 0 0.81
CCS066 禾谷镰刀菌 F. graminearum 5.67±0.17 4.53±0.26 1 1 0.54
Control 尖孢镰刀菌 F. oxysporum 7.65±0.33 5.47±0.22 — 0 —
字母 RPP 为地黄病株中分离的病原菌菌株, 字母 CCS 为地黄连做土壤中分离的病原菌菌株。RPP represents the fungi strains
isolated from wilt plants. CCS represents the fungi strains isolated from replanted soil.

从接种14 d开始出现感病症状, 20 d后趋于严重, 感
染镰刀菌的地黄植株株型变小, 叶片变黄。感病植
株初时在中午时分下部叶片缺水萎蔫, 早晚又有所
恢复, 如此反复, 至3~5 d, 叶片则不能恢复正常直
立, 枯萎死亡。镜检发现, 感病植株茎部维管束变褐
色至暗褐色, 后逐渐导致周围海绵组织破裂, 进而
致使地下块根逐渐变黑腐烂。从发病的地黄植株中
再次分离并进行鉴定, 证实该菌株与接种的镰刀菌
菌株一致。据此初步推断雪霉叶枯病菌(菌株编号
CCS038)和尖孢镰刀(菌株编号CCS043)为地黄专化
型病原菌。
如图2所示 , 在PDA培养基上 , 尖孢镰刀菌(编
号为CCS043)菌株在菌落初期 , 菌丝较短较粗 , 正
面呈银白色、疏松、绒毛状, 中央突起, 四周稍低,
其背面菌落生长部位呈浅绿色。待菌株生长到7 d或
至稍长时间后, 该菌株的菌丝能盖满整个平板, 其
正面菌丝呈现白色绒毛状, 但菌株基部呈现深黑色,
平板背面菌落生长部位呈现紫色辐射状。光学显微
镜下观察插片培养菌丝呈丝状 , 分隔 , 无色 , 横剖
面似有很多实心丝状体大型分生孢子。大型分生孢
第 11期 李振方等: 地黄强致病型病原菌的分离及其专化型鉴定 1431


子梭形或肾形, 无色、透明, 隔膜2~4个。小型分生
孢子呈椭圆形或卵形, 具隔膜0~1个。上述形态学特
征进一步证明此菌株为镰刀菌属(Fusaiunn)尖孢镰
刀菌种(F. oxysporum)。

图 2 专化型病原菌雪霉叶枯病菌(菌株编号 CCS038)和
尖孢镰刀菌(菌株编号 CCS043)的菌落形态及孢子形态
Fig. 2 Colony and spore morphology of strains Fusarium
oxysporum (No. CCS043) and Monographella nivalis (No.
CCS038)
雪霉叶枯病菌(编号为CCS038)菌株在PDA培养
基上菌落初期正面呈白色、疏松、毛发状, 中央突
起 , 四周稍低 , 在PDA培养基生长条件下 , 其背面
菌落生长部位呈紫色。待菌株生长到7 d甚至稍长时
间后, 该菌株的菌丝能盖满整个平板, 其正面菌丝
呈现白色绒毛状, 但菌株基部呈现深紫色, 菌丝为
细丝状, 平板背面为紫色, 其色块由中央向四周呈
辐射状分布, 10 d后菌丝局部自溶消失, 但分泌到培
养基内的紫色不变。光学显微镜下观察插片培养菌
丝呈分枝、分隔管状, 无色, 分生孢子呈两头尖的镰
刀状弯曲, 有3~7节, 小型分生孢子呈小的梭状, 1~2
节。根据上述形态学特征株, 此菌株为雪霉叶枯病
菌 , 有性态为Monographella nivalis, 无性态为
Monographella nivale。
3 结论与讨论
一般来说, 土壤中细菌在三大微生物类群中占
主要部分, 它在植物根系的微生态环境中对物质和
能量的转化起重要作用, 而真菌在不同环境中的数
量变化较大[19−20]。本研究小组对地黄多年研究认为,
地黄连作后根际细菌数量减少, 放线菌增多, 病原
真菌数量增加, 根际微生物数量和种类的大幅度变
化会影响地黄的正常生长[2,21]。不少学者也研究认为,
连作会使土壤从细菌型向真菌型转化, 导致地力衰
竭, 真菌数量越多土壤肥力越差[19,22−23]。本研究通
过PDA平板培养法, 从连作地黄土壤和病株经过多
次分离纯化后共分离到镰刀菌31株, 分属于尖孢镰
刀菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌、茄
病镰刀菌等。
镰刀菌作为导致作物根腐病和枯萎病等多种病
害的主要病原菌, 病菌主要以菌丝体、厚垣孢子和
菌核在土壤、病残体及未经腐熟的带菌肥料中越冬,
成为次年危害的主要初侵染源。病菌在土壤中存活
很长时间, 达6年以上, 厚垣孢子和菌核通过牲畜的
消化道后仍能存活, 厩肥可以带菌, 同时种子表面
和内部均可带菌[24−25]。目前镰刀菌种类已发现44种
和7个左右变种, 常见的产毒霉菌有: 禾谷镰刀菌、
串珠镰刀菌、三线镰刀菌(F. tricinctum)、梨孢镰刀
菌(F. poae)、拟枝孢镰刀菌(F. sporotricoides)、木贼
镰刀菌(F. equiseti)、茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌等。
形态学结合分子生物学鉴定是真菌分类的主流
方法 , 目前采用ITS序列是镰刀菌种属鉴定的重要
依据之一[26−27]。但有研究资料表明, 许多镰刀菌含
有非直系同源的ITS2, 可能会导致产生不正确的系
统发育树[28]。而本文采用ITS1/ITS4引物扩增即包含
这一区域, 使得本研究大部分镰刀菌分类主要归类
为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此, 本研究的一些
复合种 (species complex)还需在 ITS鉴定的基础上 ,
结合字系谱分析(GCPSR)和镰刀菌毒素特异基因的
定性分析手段对研究结果进行细化分析。
本研究小组查阅文献并通过GFPs标记技术, 发
现镰刀菌所造成的根腐病和枯萎病不仅影响地黄生
长, 造成地黄连作障碍, 还在地黄采收后引起地黄
的腐烂, 造成地黄产量和品质下降, 镰刀菌还会分
泌毒素进而影响地黄药用成分。镰刀菌通过植株细
根和主根上的伤口或直接从侧根分枝处裂缝和根毛
的顶部细胞, 分泌果胶酶和纤维素酶, 破坏寄主细
胞壁, 侵入寄主, 进一步在寄主薄壁细胞间或细胞
内进行菌丝生长, 逐步侵入维管束组织, 堵塞寄主
疏导组织, 使寄主萎蔫甚至死亡[25,29]。
研究资料表明, 化感作用作为自然界生物间的
一种重要化学联系方式, 在植物和环境的相互作用
中起着传递信息的作用, 对调控土壤生态平衡和系
统的稳定性具有重要作用。其中, 这些化感物质对
土传病害, 特别是病原真菌的选择性促进作用被认
为是连作障碍的主要原因[7,23,30]。阐释特异微生物与
特定化感物质之间的互作关系是揭开连作障碍复杂
的根际生物互作网络的一个关键切入点[6,9−10]。通过
对根际微生态环境的合理调控, 改善根际环境、促
进植物生长发育, 调控和改变根系分泌物的组分和
生物之间互作作用, 植物通过释放化感物质、信号
1432 中国生态农业学报 2013 第 21卷


物质, 抑制病原生物的快速大量繁殖, 对缓解和控
制农业连作生产体系中的土壤生物学障碍问题具有
重要意义[1,3,31]。
参考文献
[1] 张重义, 林文雄. 药用植物的化感自毒作用与连作障碍[J].
中国生态农业学报, 2009, 17(1): 189–196
Zhang Z Y, Lin W X. Continuous cropping obstacle and
allelopathic autotoxicity of medicinal plants[J]. Chinese
Journal of Eco-Agriculture, 2009, 17(1): 189–196
[2] 李振方, 杨燕秋, 谢冬凤, 等. 连作条件下地黄药用品质及
土壤微生态特性分析[J]. 中国生态农业学报, 2012, 20(2):
217–224
Li Z F, Yang Y Q, Xie D F, et al. Effects of continuous
cropping on the quality of Rehmannia glutinosa L. and soil
micro-ecology[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2012,
20(2): 217–224
[3] 成田保三郎 . 连轮作田土壤的徽生物区系[J]. 日本土壤肥
料学杂志, 1982, 53(1): 11–14
Narita S B. Effects of soil microbial characteristics in rotation
field soil[J]. Japanese Soil Fertilizer Science, 1982, 53(1):
11–14
[4] 解红娥, 王娇娟, 解晓红, 等. 地黄土壤中主要病原真菌的
鉴定及致病性研究[J]. 山西农业科学, 2007, 35(2): 59–63
Xie H E, Wang J J, Xie X H, et al. Identification and
morbidityu test of pathogenic fungi in the soil sample planted
rehmnnia gintinosa[J]. Journal of Shan-Xi Agricultural
Sciences, 2007, 35(2): 59–63
[5] 王明道, 吴宗伟, 原增艳, 等. 怀地黄连作对土壤微生物区
系的影响[J]. 河南农业大学学报, 2008, 42(5): 532–538
Wang M D, Wu Z W, Yuan Z Y, et al. Effects of Rehmannia
glutinosa Libosch. continuous cropping on microbial
communities[J]. Journal of Henan Agricultural University,
2008, 42(5): 532–538
[6] 史刚荣. 植物根系分泌物的生态效应[J]. 生态学杂志, 2004,
23(1): 97–101
Shi R G. Ecological effects of plant root exudates[J]. Chinese
Journal of Ecology, 2004, 23(1): 97–101
[7] 鞠会艳 , 韩丽梅 . 连作大豆根分泌物对根腐病病原菌及种
子萌发的影响[J]. 吉林农业大学学报, 2002, 24(4): 45–49
Ju H Y, Han L M. Influence of root exudations on pathogenic
fungi produced by root rot and seed Germination in
continuous cropping soybean[J]. Journal of Jilin Agricultural
University, 2002, 24(4): 45–49
[8] 刘峰, 温学森, 刘彦飞, 等. 水苏糖对地黄根际土壤微生物
失衡的影响[J]. 中草药, 2007, 38(12): 1871–1874
Liu F, Wen X S, Liu Y F, et al. Effect of stachyose on
microbiotic disequilibrium in rhizospheric soil of Rehmannia
glutinosa[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2007,
38(12): 1871–1874
[9] Wu L K, Wang H B, Zhang Z X, et al. Comparative
metaproteomic analysis on consecutively Rehmannia
glutinosa-monocultured rhizosphere soil[J]. PLoS ONE, 2011,
6(5): e20611
[10] Li Z F, Yang Y Q, Xie D F, et al. Identification of autotoxic
compounds in fibrous roots of Rehmannia (Rehmannia
glutinosa Libosch.)[J]. PLoS ONE, 2012, 7(1): e28806
[11] Shishido M, Miwa C, Usami T, et al. Biological control
efficiency of fusarium wilt of tomato by nonpathogenic
fusarium oxysporum Fo-B2 in different environments[J].
Phytopathology, 2005, 95(9): 1072–1080
[12] 袁佐清. 土壤中木霉的分离纯化以及对植物病原真菌的拮
抗研究[J]. 西北农业学报, 2006, 15(5): 132–135
Yuan Z Q. Study on Antagonism of Trichoderma spp.
obtained from soil to pathogenic fungi[J]. Acta Agriculturae
Boreali-occidentalis Sinica, 2006, 15(5): 132–135
[13] 王拱辰 , 郑重 , 叶琪明 , 等 . 常见镰刀菌鉴定指南[M]. 北
京: 中国农业科技出版社, 1996
Wang G C, Zheng Z, Ye Q M, et al. Guide of common
fusarium identification[M]. Beijing: China Agricultural
Science and Technology Press, 1996
[14] Booth C. The genus fusarium[M]. London: The Eastern Press
Limited, 1971
[15] Wu H S, Yin X, Liu D Y, et al. Effect of fungal fusaric acid on
the leaf and root physiology of watermelon (Citrullus Lanatus)
seedlings[J]. Plant and Soil, 2008, 308: 255–266
[16] 吴洪生. 西瓜连作土传枯萎病微生物生态学机理及其生物
防治[D]. 南京: 南京农业大学, 2008
Wu H S. Microbial ecology mechanisms on Fusarium Wilt of
watermelon and its biological control in Fusarium-infested
soil under long-term monoculture system[D]. Nanjing:
Nanjing Agricultural University, 2008
[17] 方中达. 植病研究方法[M]. 第 3 版. 北京: 中国农业出版
社, 1998
Fang Z D. Research method of plant pathology[M]. Beijing:
China Agricultural Science Press, 1998
[18] 刘少华, 陆金萍, 朱瑞良, 等. 一种快速简便的植物病原真
菌基因组 DNA 提取方法[J]. 植物病理学报, 2005, 35(4):
362–365
Liu S H, Lu J P, Zhu R L. A rapid and simple extraction
method for plant pathogenic fungi[J]. Acta Phytopathologica
Sinica, 2005, 35(4): 362–365
[19] Dissana M L M C, Kashima R, Tanaka S, et al. Pathogenic
variation and molecular characterization of Fusarium species
isolated from wilted Welsh onion in Japan[J]. Journal of
General Plant Pathology, 2009, 75(1): 37–45
[20] Inderjit. Soil microorganisms: An important determinant of
allelopathic activity[J]. Plant and Soil, 2005, 274(1/2):
227–236
[21] Wu L K, Li Z F, Li J. Assessment of shifts in microbial
community structure and catabolic diversity in response to
Rehmannia glutinosa monoculture[J]. Applied Soil Ecology,
2013, 67: 1–9
[22] 林茂兹, 黄少华, 陈巧巧, 等. 太子参连作障碍及其根际土
壤尖孢镰刀菌数量变化[J]. 云南农业大学学报: 自然科学
版, 2012, 27(5): 716–721
Lin M Z, Huang S H, Chen Q Q, et al. Studies on continuous
cropping obstacle of Pseudostelariae heterophylla and the
change of Fusarium oxysporum numbers in its rhizosphere [J].
Journal of Yunnan Agricultural University, 2012, 27(5):
716–721
[23] 金扬秀, 谢关林, 孙祥良, 等. 大蒜轮作与瓜类枯萎病发病
第 11期 李振方等: 地黄强致病型病原菌的分离及其专化型鉴定 1433


的关系[J]. 上海交通大学学报: 农业科学版 , 2003, 21(1):
9–12
Jin Y X, Xie G L, Sun X L, et al. Relationship of garlic
rotation and severity of fusarium wilt of melon[J]. Journal of
Shan-Hai Jiaotong University: Agrlcultural Science, 2003,
21(1): 9–12
[24] 裴冬丽 , 刘春元 , 吴建宇 . 河南省玉米穗粒腐病病原串珠
镰刀菌鉴定[J]. 玉米科学, 2011, 19(1): 136–138, 142
Pei D L, Liu C Y, Wu J Y, et al. The Identification of pathogen
Fusarium verticillioides causing maize ear rot in Henan[J].
Journal of Maize Sciences, 2011, 19(1): 136–138, 142
[25] 吴学宏, 韩鲁明, 陈倩, 等. 西瓜种传镰刀菌形态和分子鉴
定及其对种子发芽的影响[J]. 植物病理学报, 2009, 39(2):
118–124
Wu X H, Han L M, Chen Q, et al. Morphological and
molecular identification of seedborne Fusarium of
watermelon and its effect on seed germination[J]. Acta
Phytopathologca Sinica, 2009, 39(2): 118–124
[26] 王国芬 , 彭军 , 代鹏 , 等 . 香蕉枯萎病镰刀菌 ITS 序列的
PCR 扩增及其分子检测[J]. 华南热带农业大学学报, 2007,
13(3): 1–5
Wang G F, Peng J, Dai P, et al. ITS sequence and PCR
protocol for detection of banana wilt disease resulted from
fusarium oxysporum f.sp. cubense[J]. Journal of South China
University of Tropical Agriculture, 2007, 13(3): 1–5
[27] Van Hove F, Waalwijk C, Logrieco A, et al. Gibberella musae
(Fusarium musae) sp. nov., a recently discovered species
from banana is sister to F. verticillioides[J]. Mycologia, 2007,
103(3): 570–585
[28] Geiser D M, Jimenez-Gasco M M, Kang S, et al. Fusarium-ID
v.1.0: a DNA sequence database for identifying Fusarium[J].
European Journal of Plant Pathology, 2004, 110(5): 473–479
[29] 潘凯, 吴凤芝. 枯萎病不同抗性黄瓜(Cucumis sativus L.)根
系分泌物氨基酸组分与抗病的相关性[J]. 生态学报, 2007,
27(5): 1945–1950
Pan K, Wu F Z. Correlation analysis of amino acids
components in cucumber root exudates and fusarium wilt
resistance[J]. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(5): 1945–1950
[30] Joffe A Z. Fusarium speicies: Their biology and
toxicology[M]. New York: John Wiley & Sons, 1986
[31] Blum U. Effects of microbial utilization of phenolic acids and
their phenolic acid breakdown products on allelopathic
Interactions[J]. Journal of Chemical Ecology, 1998, 24(2):
685–708