全 文 ：中国生态农业学报 2012年 11月 第 20卷 第 11期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2012, 20(11): 1514−1520


* 国家科技支撑计划项目(2007BAD07B03)、福建省自然科学基金项目(2011J01083)和福建省博士后经费资助
** 通讯作者: 林文雄(1957—), 教授, 博士生导师, 主要研究方向为农业生态学。E-mail: wenxiong181@163.com
张志忠(1976—), 博士, 副教授, 主要研究方向为园艺植物生态学和基因工程。E-mail: zeada2001@yahoo.com.cn
收稿日期: 2012-06-08 接受日期: 2012-08-29
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.01514
甜瓜化感自毒作用响应基因的 cDNA-AFLP分析*
张志忠1 孙志浩1 陈文辉2 林文雄3**
(1. 福建农林大学园艺学院 福州 350002; 2. 福州市蔬菜科学研究所 福州 350012;
3. 福建农林大学作物学院 福州 350002)
摘 要 本研究以甜瓜种质“新银辉”为试验材料, 利用浓度为 0.03 g·mL−1的新鲜甜瓜植株水浸提液处理甜瓜
幼苗, 通过 cDNA-AFLP技术分析甜瓜化感自毒作用相关基因及其表达情况。试验中利用 82对引物进行扩增,
共获得 3 600多条差异表达转录衍生片段(TDFs), 平均每个引物组合可扩增出 30~50条条带, 片段大小集中在
50~800 bp之间, 根据条带强弱和有无的变化, 其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表
达 4种情况。选取其中 103 条 TDFs进行回收、测序, 共获得 75条有效序列, 其中上调表达 39条, 下调表达
21 条, 瞬时表达 15 条。BLAST 结果分析显示其中 55 条与已知功能基因具有较高的同源性, 选取其中 10 条
TDFs, 以甜瓜 Actin基因为内参照, 对其在不同胁迫处理时间的表达情况进行半定量 RT-PCR验证, 分析结果
与 cDNA-AFLP 结果基本吻合, 表明 cDNA-AFLP 技术是研究甜瓜化感自毒作用相关基因差异表达的有效方
法。55条 TDFs的 BLAST结果显示, 甜瓜自毒作用涉及到的基因表达情况较为复杂, 与信号转导、能量代谢、
蛋白合成、离子运输、逆境响应和转录调控等过程均有关系, 这一结果为探讨甜瓜化感自毒作用的分子机理
和相关基因的克隆提供了理论依据。
关键词 甜瓜 化感自毒作用 cDNA-AFLP 差异表达转录衍生片段 半定量 RT-PCR 化感基因
中图分类号: S652.2 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)11-1514-07
Gene expression profiling in response to allelopathic autotoxicity
in melon by cDNA-AFLP
ZHANG Zhi-Zhong1, SUN Zhi-Hao1, CHEN Wen-Hui2, LIN Wen-Xiong3
(1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Fuzhou Institute of Vegetable
Research, Fuzhou 350012, China; 3. College of Crop Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract As an important horticultural crop worldwide, melon cultivation has been significantly affected by increasingly serious
cultivations problems in recent years due to changes in cultivation systems and environment. Critical for continuous melon cultivation
was allelopathy. However, little has been done in terms of the molecular biology of melon allelopathy. In this research, allelopathic
autotoxicity genes of melon germplasm ‘New Silverlit’ were analyzed using the cDNA-AFLP technique. Seedlings were treated with
0.03 g·mL−1 concentrations of aqueous extracts from melon roots and stems for cDNA-AFLP analysis. A total of 3 600
transcript-derived fragments (TDFs) were obtained via cDNA-AFLP with 82 primer pairs. Each primer pair was amplified to 30~50
bands with fragment size of 50~800 bp. The TDF expression patterns were divided into four ― up-regulation, down-regulation,
transient-expression and continuous-expression. From 103 selected TDFs, 75 had reliable sequences. Also 55 (73%) of the reliable
TDF sequences functions were determined through BLAST search in GenBank database. Most of the 55 TDF genes involved in energy
and metabolism (17.31%), signal transduction and regulation (15.38%), protein synthesis and ion transport (34.62%) and disease
defense (32.69%) were predictable. Of the 75 reliable TDFs, 10 homologous genes were critical for disease defense conditions and
signal transductions. Uncharacterized genes were validated in cDNA-AFLP expression patterns using semi-quantitative
reverse-transcription polymerase chain reaction (PCR) analyses. This analysis used melon actin as the internal reference gene. The
cDNA-AFLP technique confirmed altered expression patterns of 9 (90%) genes. The results show that cDNA-AFLP was a reliable
第 11期 张志忠等: 甜瓜化感自毒作用响应基因的 cDNA-AFLP分析 1515


technique for analyzing expression patterns of genes involved in melon allelopathy. Genes involved in melon allelopathy were
identified and their expression patterns determined. This study was helpful in shedding more light on molecular mechanisms of melon
allelopathy. It was also useful in identifying genes that could alleviate allelopathic autotoxicity in melon.
Key words Melon, Allelopathic autotoxicity, cDNA-AFLP, Transcript-Derived Fragments (TDFs), Semi-quantitative
RT-PCR, Allelopathy gene
(Received Jun. 8, 2012; accepted Aug. 29, 2012)
甜瓜(Cucumis melo L.)为世界重要园艺作物之
一。我国的甜瓜栽培已有 3 000多年的历史, 是世界
上栽培甜瓜最早的国家之一。联合国粮农组织的统
计显示, 自 20世纪 80年代以来, 我国甜瓜的栽培面
积和产量一直居于世界第一位。包括甜瓜在内的园
艺作物生产基地化和设施化比例不断提高, 栽培制
度和栽培环境的改变使得连作障碍已成为制约甜瓜
等园艺作物生产可持续发展的重大问题[1−2]。甜瓜连
作后地力衰退, 生长受抑制, 病害加剧, 产量、品质
下降, 其发生不仅与土壤有害生物的增多和土壤理
化性状变劣有关, 也与连续种植后大量的残茬分解
物遗留在土壤中引起的自毒效应有关[3]。对包括甜
瓜在内的瓜类植物的化感作用尤其是其自毒作用进
行深入研究将有助于这一问题的解决[4]。由于化感
作用涉及的影响因素较为复杂, 相关基因研究难度
较大, 目前仅在水稻、紫茎泽兰等物种中取得了突
破[5−7]。关于甜瓜的化感作用研究较少, 相关研究多
是探讨其他作物对甜瓜的化感效应 [8−10], 且都集中
在对其生长发育的形态指标观测, 甜瓜化感作用的
生理生化基础和分子生物学机制尚少见报道。本研
究采用 cDNA-AFLP 技术分析甜瓜化感自毒胁迫下
的基因表达图谱, 通过基因比对方法鉴定其可能的
生物学功能, 进一步探讨部分甜瓜化感自毒应答基
因的生物学功能, 为揭示甜瓜化感自毒作用的分子
机理和利用分子标记技术克隆相关基因用于改良甜
瓜种质资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
试验于 2011年 4—10月在福建农林大学园艺学
院基础实验室进行 , 供试甜瓜品种为“新银辉”, 种
子购于福建农嘉种业股份有限公司。甜瓜植株生长
至 8~10片真叶、株高 40 cm左右时选取健康新鲜甜
瓜植株(根系和部分茎段), 用蒸馏水重复冲洗干净,
60 ℃烘干至恒重, 研磨成粉末, 混合均匀后称取 15 g,
加 500 mL 无菌双蒸水, 封口, 置于摇床中震荡提取,
转速为 60 r·min−1, 25 ℃振荡浸提 2 d, 双层纱布过滤 1
次后, 用双层滤纸过滤 2次, 再用 0.2 μm孔径、47 mm
直径的微孔滤膜(Supor-200)过滤, 无菌双蒸水定容,
即得浓度为 0.03 g·mL−1的浸提液。采用种子滤纸发
芽法进行的预备试验表明, 该浓度处理条件下甜瓜
化感作用明显, 且大多数同类研究结果表明, 当溶
液浓度大于 0.04 g·mL−1时, 由于渗透的存在, 即使
没有化感物质也会产生抑制作用。浸提液 4 ℃保存
备用。
挑选成熟饱满的甜瓜种子于室温条件下催芽 ,
选取露白迅速且长势一致的甜瓜种子转移至铺有双
层滤纸的无菌培养皿, 保持湿润状态, 继续培养 4 d,
此后将甜瓜苗转入铺有 2层滤纸并加入 4 mL浓度为
0.03 g·mL−1植株浸提液的培养皿中, 进行胁迫处理。
以加无菌蒸馏水培养的植株做对照。分别于胁迫处
理后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和 60 h采集甜瓜
幼苗放入液氮速冻, 用于提取 RNA。
1.2 RNA的获取和 cDNA的合成
RNA 的提取采用离心柱型多糖多酚植物总
RNA 快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公
司), mRNA的分离纯化采用 PolyATract mRNA Iso-
lation System III(Promega), cDNA 第 1 链合成采用
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 试剂盒
(Fermentas), cDNA第 2链的合成采用 LD-PCR进行,
双链 cDNA用紫外分光光度法检测。
1.3 cDNA-AFLP分析和差异条带的获取
cDNA-AFLP 分析参照 Bachem 等[11]的方法进
行。取 1 μg双链 cDNA进行 EcoR I和 Mse I双酶切,
37 3 h, 65 3 h, 80 10 min; ℃ ℃ ℃ 此后和已制备好
的 EcoR I(5′-CTCGTAGACTGCGATCC-3′; 5′-ATC-
TGACGCTAGG TTAAP-3′)和 Mse I(5′-GACGATG-
AGTCCTGAG-3′; 5′-TACTCAGGACTCAT-3′)接头
连接。cDNA的酶切连接产物直接进行预扩增, 用于
预扩增反应的引物为 M00(5-GATGAGTCCTG-
AGTA-3′)和 E00(5′-AGAC TGCGTACATGCAG-3′),
分别与 Mse I和 EcoR I的接头序列相匹配。用稀释
至 200倍的预扩增产物作为选扩模板, 分别与 82对
引物组合进行选择性扩增。扩增产物采用常规技术
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色, 选取具有明显差
异且相对独立的目的片段回收。回收后的特异片段
1516 中国生态农业学报 2012 第 20卷


1 μL作为二次 PCR扩增的模板, 选用与之对应的选
择性扩增时用的引物进行 PCR扩增, 产物用于测序,
测序由上海博尚生物技术有限公司完成。
1.4 差异表达基因片段的分析
经测序后的 TDFs(transcript-derived fragments)
核苷酸序列提交 NCBI进行 BLAST比对, 分析同源
序列功能, 筛选与甜瓜化感作用相关的基因。为验
证 cDNA-AFLP 分析结果的可靠程度, 以甜瓜 Actin
基因为内参照, 选取 TDF10A1、TDF23、TDF27 等
10 个 TDFs, 分别对其在不同胁迫处理时间的表达
情况进行半定量 RT-PCR验证。
2 结果与分析
2.1 差异表达基因片段
试验中首先利用随机选取的 6 对引物组合, 对
处理期间不同取样时期的对照植株进行 cDNA-
AFLP分析, 没有发现差异表达基因, 说明获得的基
因差异性表达图谱是由于化感自毒作用引起的, 没
有受到其他外来因素的干扰。
利用82对不同引物组合对化感胁迫处理后各
个取样时期甜瓜植株叶片cDNA进行选择性扩增 ,
经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 , 共获得3 600多条
TDFs, 平均每个引物组合可扩增出30~50条 , 片段
大小集中在50~800 bp之间。根据条带强弱和有无的
变化其表达模式可以分为4种情况(图1): (1)持续表
达(图1中字母C所示), 此类条带在对照和处理中均
持续性出现, 没有明显的强弱变化, 可能是涉及植
物基础代谢和生长发育的组成型表达基因, 其表达
情况不受或较少受化感效应的影响。(2)瞬时表达
(图1中字母T所示), 这类条带出现在胁迫处理的某
个或某几个阶段, 有可能是某些起特殊作用的调控
因子, 在植株受到胁迫时被诱导表达, 其产物可能
是植物化感自毒效应应急机制中的某种成分, 或者
仅是起到诱发其他相关基因表达的作用, 在发挥相
应作用后迅速降解。(3)上调表达(图1中字母U所示),
这类条带随着胁迫程度加深或胁迫处理时间的延
长持续表达, 且不断增强, 相关基因可能在甜瓜化
感自毒作用中起到较为重要的作用。(4)下调表达
(图1中字母D所示), 这类条带随着胁迫程度加深或
胁迫处理时间的延长不断减弱, 可能是被自毒效应
抑制的相关生理生化代谢过程中的相关基因。本试
验共选取103条差异条带进行回收 , 其中上调表达
62条 (60%), 下调表达25条 (24%), 瞬时表达16条
(16%)。
2.2 差异表达基因片段的序列分析和功能推导
将上述103条TDFs测序 , 共获得75个测序成功
的TDFs, 其中上调表达39条, 下调表达21条, 瞬时
表达15条。将这些TDFs序列在NCBI里进行blastx比
对, 结果显示, 55个差异TDFs能在数据库中搜索到
与之相似度较高的功能基因; 12个搜索到的是较低
同源性的序列, 剩余8个没有搜索到同源序列, 属于
未知基因。对55个可以找到较高同源性的序列进行
分析, 剔除部分不符合要求的片段实际得到的有较
高同源性的序列为52条(表1)。结果表明甜瓜化感自
毒响应基因大致可分为4类 , 即能量代谢的相关基
因 , 占17.31%; 物质合成与运输的相关基因 , 占
34.62%; 逆境胁迫诱导的相关基因 , 占32.69%; 参
与基因调控和信号传导的相关基因, 占15.38%。每
类基因中上调表达的类型均超过50%, 其中参与甜
瓜化感自毒作用基因调控和信号传导的相关基因中
75%为上调表达。



图 1 甜瓜化感自毒作用下部分引物组合的 cDNA-AFLP图谱
Fig. 1 cDNA-AFLP map of melon allelopathic autotoxicity with several primer pairs
U: 上调表达 up-regulated; D: 下调表达 down-regulated; T: 瞬时表达 transiently-expressed; C: 持续表达 constitutively-expressed; 0~60 h:
表示处理后取样时间(h) sampling time after treatment. 下同 The same below.

第 11期 张志忠等: 甜瓜化感自毒作用响应基因的 cDNA-AFLP分析 1517


表 1 cDNA-AFLP分析甜瓜化感自毒作用差异表达基因的同源性分析
Table 1 Homologies of allelopathy TDF sequences isolated by cDNA-AFLP analysis for melon with self-allelopathy
功能分类
Function
type
克隆编号
Clone
code
推测蛋白
Putative protein
物种
Organism
相似度
Similarity
(%)
E值
E-value
差异条带类型
TDFs type
TDF4A3 腺苷酸激酶 Adenylate kinase 玉米 Z. mays 48 3E-33 上调表达 Up-regulated
TDF10A5 乌头酸水合酶 Aconitate hydratase 苹果 Malus x domestica 89 2E-36 下调表达 Down-regulated
TDF26 乙醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase 蓖麻 Ricinus communis 80 1E-48 上调表达 Up-regulated
TDF25
镁螯合酶亚基
Magnesium chelatase subunit I
陆地棉
Gossypium hirsutum
96 2E-67 上调表达
Up-regulated
TDF28A1 光合系统蛋白 Photosystem I assembly protein 甜瓜 C. melo 96 6E-76 下调表达 Down-regulated
TDF52A3 叶绿素结合蛋白 Chlorophyll binding protein 番薯 Ipomoea nil 72 4E-10 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF70A4 乙酰辅酶 A Acetyl-coenzyme A carboxylase 蓖麻 R. communis 67 6E-18 上调表达 Up-regulated
TDF58 苹果酸脱氢酶 Malate dehydrogenase 枇杷 Eriobotrya japonica 85 1E-40 下调表达 Down-regulated
能量代谢
相关
Related to
energy
metabo-
lism
TDF78A2 PSI反应中心亚基 II PSI reaction center subunit II 甜橙 C. sinensis 97 5E-69 上调表达 Up-regulated
TDF8 核糖体蛋白 Ribosomal protein 蓖麻 R. communis 74 1E-34 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF10A1 转位蛋白 Translin-like protein 拟南芥 Arabidopsis thaliana 71 1E-87
下调表达
Down-regulated
TDF10A2 乙酰转移酶 Acetyltransferase 蓖麻 R. communis 54 7E-15 下调表达 Down-regulated
TDF21 亮氨酸氨基肽酶 Leucine aminopeptidase 马铃薯 Solanum tuberosum 67 9E-20
下调表达
Down-regulated
TDF29A1 水苏糖合成酶 Stachyose synthase 黄瓜 Cucumis sativus 96 3E-85 上调表达 Up-regulated
TDF72 蔗糖合成酶 Sucrose synthase 毛果杨 Populus trichocarpa 72 2E-43 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF70A5 液泡跨膜苹果酸转运因子
Vacuolar malate transmembrane transporter
苹果
M. x domestica
73 2E-24 上调表达
Up-regulated
TDF53A2 水通道蛋白 Tonoplast intrinsic protein 龙葵 Solanum nigrum 88 3E-36 上调表达 Up-regulated
TDF66 细胞质基质类蛋白 Cytosolic factor family protein 拟南芥 A. thaliana 66 2E-33 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF56 核糖体蛋白 60s ribosomal protein 粳稻 Oryza sativa Japonica 89 5E-42
下调表达
Down-regulated
TDF73A2 蛋白质磷酸酶 Protein phosphatase 拟南芥 A. thaliana 57 3E-31 上调表达 Up-regulated
TDF73A1 网格蛋白重链 Clathrin heavy chain 拟南芥 A. thaliana 91 1E-117 上调表达 Up-regulated
TDF70A1 糖基转移酶 Glycosyl transferase 甜瓜 C. melo 69 1E-09 上调表达 Up-regulated
TDF27 微管蛋白 a链 Tubulin alpha chain 甜瓜 C. melo 100 5E-94 上调表达 Up-regulated
TDF52A1 水通道蛋白 Aquaporin 拟南芥 A. thaliana 85 6E-43 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF60 种子成熟蛋白 Seed maturation-like protein 拟南芥 A. thaliana 50 8E-25 下调表达 Down-regulated
TDF22 甲基转移酶 Methyltransferase 蓖麻 R. communis 95 8E-44 上调表达 Up-regulated
物质合成
与运输相
关
Related to
material
synthesis
and
transport
TDF52A2 细胞分裂蛋白 Cell division protein 籼稻 O. sativa Indica 88 6E-61 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF4A2 单细胞蛋白磷酸酶 SCP-like small phosphatase 拟南芥 A. thaliana 30 1E-08 上调表达 Up-regulated
TDF23 热激蛋白
Heat shock 70 kd protein
松叶菊
Mesembryanthemum
crystallinum
92 5E-50 上调表达
Up-regulated
TDF74A1 肌醇半乳糖苷合成酶 Galactinol synthase 甜瓜 C. melo 78 4E-23 上调表达 Up-regulated
TDF76A1 抗病蛋白 Disease resistance response protein 甜瓜 C. melo 99 5E-62 上调表达 Up-regulated
逆境相关
Related to
stress
TDF76A2 多药耐药相关蛋白
Multidrug resistance-associated protein
蓖麻
R. communis 77 7E-47
上调表达
Up-regulated
TDF28A2 糖基转移酶 Glycosyltransferase 苹果 M. x domestica 58 8E-30 下调表达 Down-regulated
TDF29A2 多羟基化合物转运蛋白
Polyol transported protein 2
橡胶树
Hevea brasiliensis
69 9E-50 上调表达
Up-regulated
TDF54 葡萄糖磷酸变位酶 Phosphoglucomutase 拟南芥 A. thaliana 88 4E-83 上调表达 Up-regulated
TDF55 热激蛋白 70 Heat shock protein 70 黄瓜 C. sativus 82 4E-56 下调表达 Down-regulated

TDF43A1 DNA光裂合酶 DNA photolyase 蓖麻 R. communis 82 2E-12 上调表达 Up-regulated

1518 中国生态农业学报 2012 第 20卷


(续表 1)
功能分类
Function
type
克隆编号
Clone
code
推测蛋白
Putative protein
物种
Organism
相似度
Similarity
(%)
E值
E-value
差异条带类型
TDFs type
TDF71 铁蛋白 Ferritin 小蓬草 Conyza canadensis 95 5E-18
下调表达
Down-regulated
TDF59 R2R3-MYB类转录因子
R2R3-MYB transcription factor
甜橙 C. sinensis 55 3E-11 下调表达
Down-regulated
TDF53A1
AP2/ERF类转录因子
AP2/ERF transcription factor 甜瓜 C. melo 97 5E-92
上调表达
Up-regulated
TDF75 Clp 蛋白酶 Clp protease 甜瓜 C. melo 75 3E-23 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF79A1 加氧酶 Oxygenase 烟草 Nicotiana tabacum 67 1E-68 瞬时表达 Transiently-expressed
TDF79A2 氧化酶 Oxidase 小麦 Triticum aestivum 92 1E-05 瞬时表达 Transiently-expressed

TDF78A1 亚麻酶 Subtilase family protein 拟南芥 A. lyrata 64 6E-48 上调表达 Up-regulated
TDF4A1 RNA结合蛋白 RNA-binding protein 玉米 Z. mays 61 6E-48 上调表达 Up-regulated
TDF37A1 锌指蛋白 Zinc finger protein 拟南芥 A. lyrata 65 4E-88 上调表达 Up-regulated
TDF68A2 钙调蛋白 Calmodulin binding protein 蓖麻 R. communis 73 3E-25 上调表达 Up-regulated
TDF10A3 鸟酸激酶 Guanylate kinase 拟南芥 A. thaliana 80 4E-48 下调表达 Down-regulated
TDF70A2 组氨酸激酶 Histidine protein kinases 白桦 Betula platyphylla 75 7E-37 上调表达 Up-regulated
TDF70A3
邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶
Anthranilate phosphoribosyl transferase-like protein
拟南芥 A. thaliana 90 7E-48 上调表达 Up-regulated
TDF43A2 锚蛋白 Ankyrin 拟南芥 A. thaliana 85 4E-63 上调表达 Up-regulated
基因调控
与信号传
导相关
Related to
gene
regulation
and signal
transduc-
tion
TDF74A2 转导蛋白 Transducin family protein 拟南芥 A. lyrata 39 7E-05 下调表达 Down-regulated

2.3 差异表达基因的 RT-PCR分析
半定量RT-PCR分析结果与 cDNA-AFLP结果基
本吻合(图 2), 其中 TDF54的 RT-PCR结果与 cDNA-
AFLP 的表达模式稍有差异, 但整体表达趋势是一
致的。在正常生长情况下 TDF25(镁螯合亚族 I)、
TDF27(微管蛋白)、TDF37A1(锌脂蛋白)、TDF54(葡
萄糖磷酸变位酶)低水平表达, TDF76A1(抗病性响
应蛋白)甚至不表达, 在胁迫处理后均上调表达, 所
不同的是 TDF25 在胁迫后就出现上调表达, 且在后
期的胁迫处理中一直稳定表达, 而 TDF27和 TDF54
随胁迫时间的延长持续上调表达, 在胁迫处理后期
才出现转录高峰且较稳定的表达, TDF37A1 是在胁
迫持续到 48 h后才到达转录高峰, 随后表达量又降
低, TDF76A1 是在胁迫处理一段时间后才表达, 随
时间延长持续上调表达, 且最终的转录高峰出现在
60 h。TDF26(乙醇脱氢酶)、TDF73A1(网格蛋白重链)
在总体上都是在胁迫处理中期才出现表达高峰的 ,
表现为在胁迫处理初期低水平表达, 在适应逆境后
上调表达达到峰值, 随后在逆境的持续影响下又下
调表达; TDF28A2(糖基转移酶)表现为胁迫后先下
调后上调, 在未胁迫和胁迫初期表达较稳定, 在胁
迫达到 24 h后持续低水平表达, 适应胁迫环境后才
在 60 h 时恢复高水平表达; TDF10A1(转移蛋白)在
胁迫处理到达 36 h时有一个较高水平的表达, 但整
体表达模式为下调表达; TDF23(热激蛋白 70 kd)的


图 2 部分差异片段的 cDNA-AFLP图谱和半定量
RT-PCR分析比对
Fig. 2 Comparison of cDNA-AFLP map and semi-quantitative
RT-PCR analysis
R: 半定量 RT-PCR分析 semi-quantitative RT-PCR analysis; C:
cDNA-AFLP图谱 cDNA-AFLP map.
第 11期 张志忠等: 甜瓜化感自毒作用响应基因的 cDNA-AFLP分析 1519


RT-PCR结果与cDNA-AFLP的结果稍有差异 , 但均
表现为在胁迫后48 h达到转录高峰, 随后的表达量
又下降, 两个结果在胁迫时期的表达模式相一致。
半定量RT-PCR分析结果表明利用cDNA-AFLP分析
甜瓜化感自毒相关基因的差异表达是可行的, 所得
的差异表达片段基本真实可靠。
3 讨论和结论
化感作用可以被界定为一个由释放到土壤中的
各种植物次生物质所引发的植物个体间的相生相克
现象, 这些物质包括植株残留物、淋溶物质和根系
分泌物等 [12]。近年来植物化感作用研究成为热点 ,
化感作用在农业生产中的应用广泛, 无论是作物的
单一种植, 还是作物轮作、间作、覆盖、翻埋、重
茬种植, 都要考虑化感作用的影响[13]。瓜类作物的栽
培连作障碍明显, 早已引起研究者的注意, 目前已有
关于黄瓜、西瓜等作物化感作用的研究报道[14−15], 但
关于其他瓜类作物的研究尚较少见, 并且相关研究
都集中在对表观形态变化的观测、生理生化机制和
化感物质的分离鉴定等方面, 尚无有关其分子机理
的研究报道。本研究利用cDNA-AFLP技术分析甜瓜
化感作用, 获得的52个和甜瓜化感自毒作用相关的
差异表达基因片段广泛地涉及能量代谢、物质合成
与运输、逆境诱导和基因调控及信号传导等过程 ,
说明甜瓜化感自毒作用的分子调控机制相当复杂。
试验中发现的4类响应基因均以上调表达为主,
其中参与基因调控和信号传导的相关基因中75%为
上调表达, 表明甜瓜更多地是通过主动调控来抵抗
化感自毒的伤害, 而非被动耐受。如镁离子螯合酶
(TDF25)是叶绿素合成途径中的一个关键酶, TDF25
在试验中表现为上调表达, 表明在甜瓜化感处理过程
中光合作用被抑制, 这种抑制作用可能是叶绿素降解
加剧所致, 甜瓜通过增强叶绿素合成过程中相关酶的
活性增强叶绿素的合成。微管作为信号转导和物质运
输的通道, 对细胞的生命活动起重要作用[16−17], 本研
究中微管蛋白基因(TDF27)表现为某种程度的上调
表达, 可能在甜瓜化感作用中更多地参与了信号传
导过程, 其表达在胁迫初期明显增强, 而后趋于稳
定。乙醇脱氢酶(TDF26)是普遍存在于植物细胞中的
一种可受多种逆境因素诱导的应激酶, 与植物的抗
逆性和逆境适应有重要关系 [18], 本研究中TDF26受
化感诱导初期表达增强, 为植物抵抗逆境提供更多
的能量, 随着植物受到伤害的进一步加剧, 其体内
的能量代谢已趋于紊乱, 已无法维持高水平的能量
供应。
试验中获得的18个逆境相关TDFs中有许多与
已鉴定的逆境胁迫相关功能基因具有较高的同源性,
表明高等植物对于胁迫的响应在部分途径上具有相
似的分子基础。糖基转移酶(TDF28A2)参与了植物
激素平衡、防御反应和信号转导等多种过程[19]。本
研究中TDF28A2在化感胁迫中后期表达不断增强 ,
可能参与了甜瓜化感胁迫相关的各种代谢过程。锌
脂蛋白(TDF37A1)在基因的表达调控、细胞分化等
过程中发挥重要作用, 导入外源锌脂蛋白基因可提
高植物的抗逆性[20−22], 但目前还没有关于锌指蛋白
在植物化感效应中所起作用的报道, 本研究得到的
TDF37A1可能编码甜瓜的1个锌脂蛋白家族成员 ,
其表达受化感诱导, 表明锌脂蛋白参与了甜瓜的化
感作用。TDF76A1编码的抗病性响应蛋白属于甜瓜
属特有的功能蛋白, 在本研究中TDF76A1受化感胁
迫后上调表达, 并在胁迫处理后期表达量达到峰值,
可能在甜瓜化感作用中发挥较为重要的作用, 值得
进一步深入研究。
本研究结果显示甜瓜化感自毒作用涉及的基因
表达情况较为复杂, 与信号转导、能量代谢、蛋白
合成、离子运输、逆境响应、转录调控等均有关系。
鉴于植物浸提液所含成分较为复杂, 单独采用纯根
系浸提液或是直接采用根系分泌物作为胁迫来源 ,
进而分析其化感自毒作用涉及的基因表达情况应是
进一步深入研究的方向。
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“沪台农业环境与食品安全合作论坛”会议通知

由上海交通大学农业与生物学院、上海向阳公益基金会和台湾向阳公益基金会联合发起主办, 经上海市人民政府台
湾事务办公室批准, 陆伯勋食品安全研究中心和东浩集团上海工业商务展览有限公司承办的“沪台农业环境与食品安全
合作论坛”, 将于 11月 23日在上海美兰湖国际会议中心召开。
随着我国国民经济的迅速发展及人民生活水平的提高, 人们渴望更加安全健康舒适的生活环境, 饮食健康备受关
注, 对农业环境和食品安全提出了更高要求。而近年来屡见不鲜的农业用地土壤污染、侵占等现象, 食品行业中食品原
料供给、生产环境、生产加工过程、包装及销售等各环节存在的不当之处, 严重危害了民众健康, 影响了社会的和谐稳
定。国家各级政府相关部门非常重视并采取了相应措施, 解决农业环境和食品安全问题已刻不容缓。
近五十年来, 台湾的农业高新技术飞速发展, 微电子技术、信息技术、生物工程技术已广泛应用于农业, 有力推动
了台湾现代农业的发展。
为了充分发挥海峡两岸农业优势, 交流农业新技术, 促进实现合作共赢, 将邀请沪台农业环境和食品安全领域的
著名专家和相关政府官员, 共同深入探讨我国农业环境和食品安全问题, 交流最新信息和技术, 同时收集和汇总专家
学者的意见和建议, 提供给政府有关部门作决策参考。
为此, 特邀请您及贵单位有关专业人士前来参加。
联系人: 上海工业商务展览有限公司 毛小姐
电话: 021-62672347; 传真: 021-62711224
电邮: jjmao@sh-industryexpo.com
网址: www.foodsaftyforum.com