全 文 ：中国生态农业学报 2013年 11月 第 21卷 第 11期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2013, 21(11): 1416−1425


* 国家大宗蔬菜产业技术体系建设项目(CARS-25-B-02)资助
** 通讯作者: 缪作清(1966—), 男, 大学, 副研究员, 主要从事土传病害生物防治研究。E-mail: zqmiao@ippcaas.cn
张婷(1987—), 女, 硕士研究生, 主要从事土传病害生防研究。E-mail: zhangtiui@163.com
收稿日期: 2013−04−24 接受日期: 2013−07−05
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2013.30400
“秸秆降解生防菌强化技术”对黄瓜连作土壤
微生物区系的影响*
张 婷 李世东 缪作清**
(中国农业科学院植物保护研究所 农业部作物有害生物综合治理重点实验室 北京 100081)
摘 要 “秸秆降解生防菌强化技术”(BS)近年在我国北方冬季温室栽培中广泛使用, 具改良土壤、减轻病害、
改善品质、提高产量等多方面的效果。为探讨应用该技术后对黄瓜连作土壤中微生物区系的影响, 本研究采
用平板培养计数与末端标记限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析相结合的方法, 检测了黄瓜连作土壤中真菌、
细菌、放线菌以及生防菌和病原菌的数量动态。结果表明, BS处理土壤后, 在连作第 2茬时, 土壤中真菌群体
总量比第 1茬显著减少; 细菌总量比第 1茬显著增加。细菌与真菌数量比值(B/F值)在连作两茬时明显升高, 土
壤表现为“细菌型”; 连茬土壤中两种生防菌的含量保持相对稳定; 枯萎病原菌数量在连作两茬时与其他处理
和对照相比有所降低, 但不显著; 处理后土壤细菌多样性在第 2茬时显著升高, 并能促进 TRF139等有益菌群
增殖, 抑制 TRF341 和 TRF501 等有害菌群增殖。BS 处理土壤能明显提高连作黄瓜的产量并降低根结线虫的
病情指数, 在第 3茬时产量比对照增加 25.9%, 病情指数比对照减少 71.4%。生防菌与秸秆配合使用对黄瓜连
作土壤微生物的数量和群落结构影响显著, 在一定的连作茬数内能够保证生防菌有效定殖, 抑制病原菌数量
增长, 提高土壤微生物多样性, 使土壤微环境达到相对健康的状态。
关键词 生防菌 秸秆 黄瓜 连作 微生物区系
中图分类号: S154.37 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2013)11-1416-10
Effects of intensified corn stalk degradation by biocontrol agents on soil
microbial community in continuous cucumber cropping
ZHANG Ting, LI Shi-Dong, MIAO Zuo-Qing
(Key Laboratory of Integrated Pest Management in Crops, Ministry of Agriculture; Institute of Plant Protection, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract Stunted crop growth, yield decline and disease susceptibility have been associated with monoculture cropping. Soil borne
diseases have emerged as the main obstacle to continuous cropping, which current biological techniques have failed to overcome. In
recent years, however, intensified corn stalk degradation by biocontrol agents has been a widely used technique in winter green-
houses in North China. This technique combining application of crop stalk and biocontrol agents, which can improve soil quality,
reduce soil diseases, increase crop productivity, etc. Thus this study aimed to investigate what effects this technique has on soil mi-
crobial community in continuous cucumber cropping. The dynamics of fungi, bacteria, actinomycetes, biocontrol agents and patho-
gens in cucumber fields were determined using both the plate culture counting and terminal-restriction fragment length polymor-
phism (T-RFLP) methods. The results showed that intensified corn stalk degradation by biocontrol agents significantly influenced
soil microbial community in cucumber fields. After treatment, the number of fungi in soils of the second crop (6.33×104 CFU·g−1)
was lower than that in the first crop (1.81×105 CFU·g−1) while bacteria and actinomycetes showed the reverse trend. Bacteria to fungi
(B/F) ratio increased from 222.30 at the end of the first crop to 667.16 at the end of the second crop. The contents of biocontrol
agents, Purpureocillium lilacinum and Bacillus subtilis, remained stable in soils under continuously cropped cucumber. Although
insignificantly, the amount of pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum decreased. On the other hand, soil bacteria diversity
第 11期 张 婷等: “秸秆降解生防菌强化技术”对黄瓜连作土壤微生物区系的影响 1417


significantly increased. This somehow promoted beneficial bacteria TRF139 propagation while inhibiting harmful bacteria TRF341
and TRF501. Moreover, the technique improved cucumber yield by 25.9% under continuous cropping and reduced root-knot nema-
tode disease index by 71.4% at the end of the third crop. Thus the combination of corn stalk and biocontrol agents positively influ-
enced soil microbes and their community structures, promoted biocontrol agent colonization within a few crops, inhibited the growth
of pathogens and subsequently improved the health of soil microenvironment.
Key words Biocontrol agent, Straw, Cucumber, Continuous cropping, Microbial community
(Received Apr. 24, 2013; accepted Jul. 5, 2013)
随着蔬菜生产专业化、集约化的发展, 连作已经
成为蔬菜生产的主要方式, 而连作障碍已成为制约
设施蔬菜生产可持续发展的重要因素, 其中土传病
害是造成连作障碍的重要因子之一[1]。利用生防微生
物对土传病害进行控制, 是一种安全有效的方法[2]。
由于土壤抑菌作用等原因, 将生防菌直接施用到土
壤中不能让生防菌发挥应有的防病效果[3]。枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)与淡紫紫孢菌(Purpureocillium
lilacinum, 原名淡紫拟青霉 Paecilomyces lilacinus)具
有防病增产的作用 [4−5], 对黄瓜枯萎病和根结线虫
病等都具有显著防效[5−7]。秸秆还田能补充土壤有机
质 [8], 提高土壤酶活性 , 促进土壤微生物生长及活
性[9]。利用“秸秆反应堆”技术[10], 以秸秆为载体, 将
有益生防菌施入到土壤, 不但具有一般秸秆反应堆
技术可为作物提供生长所必需的 CO2、提高地温、改
良土壤等作用[11], 而且还能够有效发挥防止和抑制
土传病害发生的作用[12−13], 可显著提高作物产量和
质量。该技术在北方地区的设施蔬菜生产中已经大面
积推广使用, 是一项具有显著经济效益和社会效益
的实用技术, 但该技术的土壤微生态机理尚不明确。
土壤微生物群落主要由细菌、放线菌、真菌, 以
及藻类、线虫和原生动物等组成, 在维持土壤质量
中起重要作用。微生物多样性是指微生物生命体在
遗传、种类和生态系统层次上的变化[14], 它不仅代
表微生物群落稳定性, 也反映土壤生态机制对群落
的影响。土壤功能可以由微生物种类多样性与群落或
营养层次均衡性来评估。研究表明土壤有机质含量和
结构与微生物群落结构和功能的变化紧密相关 [15],
土壤生物区系变化和生物化学过程间的相互关系也
可反映生物多样性。许光辉等[16]发现, 土壤微生物在
熟化程度高和肥力较好的土壤中数量较多, 在干旱
及难分解物质较多的土壤中较少; 在高肥力土壤中
细菌所占的比例较高, 而在低肥力土壤中细菌所占
比率相对较低, 但真菌和放线菌的比率相对较高[17]。
对土壤微生物的研究大多是采用传统的土壤平
板分离培养方法, 而土壤中可培养的微生物只占总
微生物极少的部分 [18], 因此, 常规平板分离培养法
并不能获得全面的土壤微生物信息。利用现代分子
生物学技术可将一些不能培养的微生物信息挖掘出
来。20世纪 80年代和 90年代, 以 DNA为目标的现
代分子生物学技术(rRNA 基因测序技术、基因指纹
图谱等)比较精确地揭示了微生物种类和遗传多样
性, 并能给出关于群落结构的直观信息。该技术主
要包括群落水平总 DNA法、核酸杂交技术、克隆文
库分析法、基因指纹图谱分析等方法。其中, 基因
指纹图谱方法可同时分析多个样品, 快速直观, 适
合于分析微生物群落的结构组成与动态变化。基因
指纹图谱是用 PCR 扩增环境微生物样品总 DNA 的
标记序列, 再用合适的电泳技术将其分离而成的具
有特定条带特征的图谱。基因指纹模式的不同反映
了种群结构的不同。按分离依据不同, 基因指纹图
谱可分为 DNA 长度多态性分析图谱和变性梯度凝
胶电泳图谱。变性梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)分析
法中由于扩增序列长度不宜过大, 以及不同序列的
片断可能在电泳时迁移到同一位置, 因而图谱结果
仍不足以精确地揭示微生物群落的结构和多样性。
DNA 长度多态性分析技术包括 RFLP(ARDRA,T-
RFLP)、RAPD和 ERIC-PCR等, 其中 RFLP方法通
常选择 rRNA(rDNA)的基因作为扩增对象, 广泛用
于研究土壤[19]、水体[20]和海洋沉积物[21]等微生物群
落的结构和多样性。ARDRA 图谱的复杂度高, 而
T-RFLP 只检测末端限制片段, 得到的图谱简单, 是
一种较为理想的土壤微生态研究方法[22]; T-RFLP 图
谱经过 Peak scanner软件读取后, 可经过计算得到丰
富度(Richness, S)、均匀度指数(Uniformity index, J′)、
多样性指数 (Diversity index, H′)和优势度指数
(Dominance index, D), 这些是反映土壤微生物多样
性的主要指数[23]。
本研究将传统培养法与 T-RFLP 方法相结合 ,
分析秸秆降解生防菌强化使用后连作黄瓜根际土壤
微生物的种群变化, 探讨该技术对黄瓜根际土壤微
生态的影响, 以期为该技术在控制连作土传病害及
调控土壤生态中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要试验材料
供试玉米秸秆取自中国农业科学院廊坊试验基
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地。供试生防菌为枯草芽孢杆菌 B006(B. subtilis)与
淡紫紫孢霉 Str.NH-PL-03(P. lilacinus)复合菌剂, 由
农业部作物有害生物综合治理重点实验室提供, 细菌
活菌数 1×109 CFU·g−1, 真菌活菌数 1×108 CFU·g−1。供
试黄瓜品种为“津优 35号”。
试验病圃为中国农业科学院廊坊试验基地黄瓜
枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)和根
结线虫病(Meloidogyne incongnita)复合病圃。试验前
为在新地上建立的人工病圃, 病圃建立方法为: 将黄
瓜枯萎病菌用小米稻壳培养基(小米和稻壳以体积比
为 1 1∶ 混合, 4 ℃下水浸泡 24 h, 121 ℃灭菌 30 min)
进行培养, 直到菌浓度为每克培养基 5.43×107个孢子;
黄瓜移栽时穴施带菌培养基 15 g, 同时穴施 50 mL根
结线虫病原土, 线虫浓度为每 100 g土中 830条。
试验土壤为壤土, pH 8.14, 有机质含量 26.72 g·kg−1,
全氮含量 1.47 g·kg−1, 速效氮含量 102.25 mg·kg−1, 速
效磷含量 27.225 mg·kg−1, 速效钾含量 73.75 mg·kg−1。
土壤 DNA提取试剂盒为 Ultra Clean Soil DNA
Isolation kit(Mobio, CA USA)。
1.2 试验设计与方法
1.2.1 试验处理
设置 4 种处理方法: 秸秆降解生防菌强化处理
(BS)、生防菌处理(B)、秸秆处理(S)和对照(CK)。每
个小区面积 14 m2, 共 3垄(6行), 试验设 3次重复。
在病圃中进行第 1茬试验处理。参照刘会清等[12]
的方法进行秸秆降解生防菌强化处理(BS), 包括种
植行内挖沟、埋秸秆、施菌剂、覆土、浇水、盖地
膜、移栽和打孔; 其中菌剂施用按 1 kg·667m−2菌剂
和 5 kg·667m−2营养剂(本实验室配制适合生防混合
菌生长的营养基质)共同溶于一定量的水中, 配制成
营养菌液(菌剂含量约 2 g·L−1), 喷洒于秸秆上, 约含
有芽孢杆菌 2.14×109 CFU·m−2, 淡紫紫孢霉 2.14×108
CFU·m−2。秸秆处理(S)除不施用菌剂外, 其他过程同
秸秆降解生防菌强化处理。生防菌处理(B)为穴施用
硅藻土稀释的生防菌剂, 每穴 1×107 个细菌菌体和
1×106个真菌孢子。对照(CK)为常规起垄种植, 在种
植行内不加秸秆和生防菌剂。
连作第 2、3 茬试验, 在前茬拉秧后, 将各处理
和对照的耕作层分别翻耕均匀, 除 B 处理每茬都施
入生防菌外, S 处理和 BS 处理不再重新处理, 按常
规方法进行起垄种植。
1.2.2 土壤样品采集
每处理随机选取 5点, 每点取 0~20 cm耕作层
的根际土壤 , 混合后 , 装入塑料袋中 , 保存备用。
在种植第 1 茬的移苗前采集一次土样, 作为初始样
品; 以后在每茬连作结束时对各处理和对照分别进
行采样。
1.2.3 微生物数量的测定
采用稀释平板法分别测定土壤中细菌、真菌、
放线菌、生防菌和病原菌的数量。细菌用牛肉膏蛋
白胨培养基; 真菌用加入硫酸链霉素和氨苄青霉素
的马铃薯葡萄糖培养基; 放线菌用改良高氏 1 号培
养基; 淡紫紫孢霉用选择性培养基[24]; 芽孢杆菌是
先将土壤稀释液在 80 ℃的水浴锅中水浴 20 min, 然
后涂在牛肉膏蛋白胨培养基平板上; 黄瓜枯萎病菌
采用 Komada 培养基[25]。土壤中根结线虫采用浅盘
法测定[26]。
1.2.4 微生物多样性的测定
参照王洪媛等[27]的方法进行。
土壤 DNA 提取 : 用土壤 DNA 试剂盒(Ultra
Clean Soil DNA Isolation kit)提取土壤总 DNA, 经
1%琼脂糖凝胶电泳检测后于−20 ℃保存。
16S rDNA基因扩增: 各取 1.5 μL的总 DNA(浓
度约为 25.00 μg·mL−1)作为模板进行 PCR, 引物为
27f(5′-FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和
1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。扩增条件:
94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 1 min, 54 ℃退火 30 s,
72 ℃延伸 2 min, 25个循环, 72 ℃延伸 8 min。产物
用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 然后用 DNA 凝胶回
收试剂盒进行纯化。
带 FAM标记 16S rDNA基因的限制性酶切: 用
限制性内切酶 Msp Ⅰ和 Hha Ⅰ分别对 PCR 产物
进行酶切。酶切反应体系(20 μL): MspⅠ和 HhaⅠ
各 1 μL; 10×T Buffer和 0.1% BSA各 2 μL; 模板 5 μL;
ddH2O 9 μL。37 ℃酶切 2 h, 然后 70 10 min℃ 使酶
失活。
将所得酶切产物送交试剂公司(北京基诺来普
公司)进行 DNA测序。分析获得相应样品的 T-RFLP
图谱, 图谱中包括各波峰相对应的参数, 然后进行
多样性指数计算。
1.2.5 产量和病情指数测定
在每茬盛果期记录各处理产量, 调查根结线虫
发病状况。根结线虫病害调查参考文廷刚等[28]的方
法。病情分级标准为: 0级, 健康无病(根系上无根结);
1级, 1%~20%根系上有根结, 但根结相互不连接; 2
级, 21%~40%的根系上有根结, 仅少量根结相互连
接; 3级, 41%~60%的根系上有根结, 半数以下根结
相互连接; 4级, 61%~80%的根系上有根结, 半数以
上根结相互连接, 部分主、侧根变粗呈畸形; 5 级,
80%以上的根系上有根结, 且相互连接, 多数主、侧
根呈畸形。
第 11期 张 婷等: “秸秆降解生防菌强化技术”对黄瓜连作土壤微生物区系的影响 1419


1.3 计算公式
多样性指数(H′)公式:
1
ln
S
i i
i
H p p
=
′ = −∑ (1)
式中, S表示总的物种数, pi表示第 i个种占总数的比
例[29]。
均匀度指数(J′)公式:
max
HJ
H
′′ = ′ (2)
式中, Hmax是 H的最大值。
优势度指数(D)公式:
2
1
1
S
i
iD p
=
= −∑ (3)
单个 TRF(terminal restriction fragment length
polymorphism, T-RFLP)的相对峰面积(Ap)计算公式:
Ap= ni/N×100 (4)
式中 , ni为单个 TRF的峰面积 , N为图谱中所有峰
的面积总和 [30]。Ap 采用片段长度在 20~500 bp 区
间的 TRF 数值计算 , 且将 Ap>1%的 TRF 视为 1
个 OUT (operational taxonomic unit), 以 TRF的相
对峰面积作为对应的 OUT 丰度 , 计算多样性指
数计算。
根结线虫的病情指数按下式计算:
病情指数=∑ (该级病株数×级数值)/(调查总株数×
最高病级数值)×100% (5)
1.4 数据分析
试验数据采用SAS v8.0软件进行分析, 费雪氏
LSD法进行比较。
2 结果与分析
2.1 黄瓜连作土壤中生防菌数量的变化
表 1 表明, BS 处理的土壤淡紫紫孢霉含量第 1
茬结束时为 3.33×104 CFU·g−1(土), 而第 2 茬和第 3
茬结束时分别为 2.22×104 CFU·g−1(土)和 2.67×104
CFU·g−1(土); 第 1 茬与第 2、3 茬间无显著差异。B
处理土壤淡紫紫孢霉含量第 1 茬结束时为 2.11×104
CFU·g−1(土), 而第 2 茬和第 3 茬结束时又分别增加
到 3.89×104 CFU·g−1(土)和 5.33×104 CFU·g−1(土); 第
1茬显著低于第 2茬, 第 2茬显著低于第 3茬。
BS处理的土壤芽孢杆菌含量第 1茬结束时为
8.22×105 CFU·g−1(土), 第 2 茬和第 3 茬结束时分
别为 1.87×106 CFU·g−1(土)和 1.63×106 CFU·g−1(土),
第 2、3 茬间差异不显著 , 但均比第 1 茬显著提
高。B 处理的土壤中各茬的芽孢杆菌的含量无显
著差异。
表 1 黄瓜连作期间不同处理土壤生防菌数量的变化
Table 1 Population changes of biocontrol agents in soil during continuously cropping of cucumber under different treatments
茬口
Crops for rotation
处理
Treatment
淡紫紫孢霉 Purpureocillium lilacinum
[×104 CFU·g−1(soil)]
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
[×105 CFU·g−1(soil)]
B 2.11±0.09d 8.44±0.28b 第 1茬 First crop
BS 3.33±0.07bc 8.22±0.19b
B 3.89±0.28b 9.67±0.36b 第 2茬 Second crop
BS 2.22±0.07cd 18.67±0.18a
B 5.33±0.13a 8.00±0.32b 第 3茬 Third crop
BS 2.67±0.07cd 16.33±0.22a
同列中不同英文字母采用费雪氏 LSD法检验表示差异达显著水平(P<0.05)。B代表生防菌处理, BS代表秸秆降解生防菌强化处理。下同。
Data followed by different letters are significantly different according to Fisher’s Least Significant Difference test at P < 0.05. B is the treatment of
biocontrol agents, BS is the treatment of intensified corn straw degradation by biocontrol agents. The same below.

2.2 黄瓜连作土壤中病原物数量的变化
表 2 表明, 供试土壤黄瓜枯萎病菌初始含量为
3.54×105 CFU·g−1(土), 显著高于各连茬对照。第 1
茬的对照与处理以及 3个处理间差异均不显著; 第 2
茬的BS处理显著低于B处理, 也低于对照和 S处理,
但无显著差异; 第 3茬对照与各处理以及 3个处理间
均无显著差异。同一处理不同茬之间, BS处理的第 1
茬和第 2 茬均显著低于第 3 茬, 第 1、2 茬间差异不
显著; B 处理的第 1 茬显著低于第 2、3 茬, 第 2、3
茬间差异不显著; S处理的则随茬数增加显著增加。
土壤根结线虫初始数量为每 100 g 土壤中含有
301条, 与连作后每茬的对照间无显著差异。第 1茬
的对照与处理及各处理之间差异不显著; 第 2 茬的
BS处理线虫数显著低于对照和 B处理, 但与 S处理
无显著差异; 第 3茬BS处理与 S处理间无显著差异,
但均显著高于对照和 B 处理。在同一处理不同茬之
间, BS处理和 S处理第 3茬根结线虫数量显著高于第
1茬和第 2茬; 而对照和B处理不同茬间无显著差异。
1420 中国生态农业学报 2013 第 21卷


表 2 黄瓜连作期间不同处理土壤中病原物数量的变化
Table 2 Population changes of pathogens in soil during continuously cropping of cucumber under different treatments
茬口
Crops for rotation
处理
Treatment
枯萎病菌 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum
[×104 CFU·g−1(soil)]
根结线虫 Meloidogyne incongnita
(number per 100 g soil)
初始 Initiation — 35.44±0.13* 301±6.82cde
CK 1.89±0.13d 324±20.98cde
B 1.33±0.12d 302±9.69cde
S 1.78±0.13d 208±14.20de
第 1茬 First crop
BS 1.11±0.03d 350±9.30cd
CK 4.89±0.16bc 380±10.22bc
B 8.11±0.12a 367±10.50bc
S 5.22±0.48bc 256±1.83cde
第 2茬 Second crop
BS 2.89±0.15cd 194±2.42e
CK 6.00±0.22ab 405±2.18bc
B 6.44±0.27ab 278±15.06cde
S 8.80±0.67a 504±19.51ab
第 3茬 Third crop
BS 5.67±0.37ab 608±16.56a
*代表连作前土壤中枯萎病菌数量因与同组其他数据具有数量级上的显著差异, 因而未参与数据统计。S代表秸秆处理, CK代表空白对照。
下同。The data with * is bigger enough to be significantly higher than other data, so is not to be statistically analyzed. S is the treatment of straw. CK is
blank control. The same below.

2.3 黄瓜连作土壤细菌、真菌、放线菌数量的变化
表 3表明, 第 1茬的 BS处理土壤可培养细菌含
量为 1.18×107 CFU·g−1(土 ), 显著低于 S 处理的
2.09×107 CFU·g−1(土)和初始含量的 2.58×107 CFU·g−1
(土), 但与对照和 B 处理间差异不显著; 第 2 茬的
BS处理土壤细菌含量显著低于 S处理和 B处理, 但
与对照间差异不显著; 第 3茬 BS处理细菌含量显著
高于对照、S处理和 B处理, 对照、S处理和 B处理
间无显著差异。BS处理细菌含量在不同茬之间存在
显著差异, 第 2茬显著高于第 3茬, 第 3茬显著高于
第 1茬; S处理、B处理和对照的细菌含量不同茬之
间同样存在显著差异, 第 2茬显著高于第 1茬, 而第
1茬显著高于第 3茬。
第 1茬 BS处理的土壤可培养真菌含量为 1.81×
105 CFU·g−1(土), 显著高于对照、B 处理和 S 处理,
但后三者之间无显著差异; 第 2 茬 S 处理的含量为
1.07×105 CFU·g−1(土), 显著高于 B 处理, 但与对照
和 BS处理之间无显著差异; 第 3茬的对照与各处理
及各处理之间不存在显著差异。在不同茬之间, BS
处理的第 2茬显著低于第 1、3茬, 第 1茬显著低于
第 3茬; S处理、B处理和对照的第 3茬均显著高于
第 1、2茬, 且第 1、2茬间差异不显著。
表 3 黄瓜连作期间不同处理土壤中细菌、真菌、放线菌数量的变化
Table 3 Population changes of bacteria, fungi and actinomycetes in soil during continuously cropping of cucumber under different treatmens
茬口
Crops for rotation
处理
Treatment
细菌 Bacterium
[×106 CFU·g−1(soil)]
真菌 Fungi
[×104 CFU·g−1(soil)]
放线菌 Actinomycetes
[×105 CFU·g−1(soil)]
B/F值
B/F ratio
初始 Initiation — 25.83±9.28d 18.78±0.69ab 36.89±0.92bc 145.09±4.22
CK 12.56±4.72e 4.33±0.30d 33.11±1.76c 421.04±28.25
B 13.56±0.92e 5.00±0.42d 34.78±3.48c 411.90±39.82
S 20.89±4.26d 8.22±0.70cd 34.00±1.20c 385.33±22.89
第 1茬 First crop
BS 11.78±3.42ef 18.11±1.56b 20.00±0.59de 222.30±24.33
CK 40.00±2.43bc 5.78±0.23cd 59.44±1.26a 742.13±22.94
B 41.67±1.57ab 5.22±0.27d 55.67±5.57a 1 062.26±78.95
S 47.00±9.17a 10.67±0.63c 42.44±1.08b 551.37±25.37
第 2茬 Second crop
BS 33.78±1.81c 6.33±0.37cd 56.33±0.76a 677.16±36.47
CK 5.67±4.36fg 22.67±1.38ab 17.33±0.73e 27.06±1.87
B 4.78±0.19g 20.33±0.85ab 16.44±1.64e 28.14±1.70
S 5.33±2.18fg 20.89±0.91ab 21.44±0.59d 31.21±1.87
第 3茬 Third crop
BS 21.33±5.40d 23.67±1.37a 21.44±0.59d 93.04±1.49

第 11期 张 婷等: “秸秆降解生防菌强化技术”对黄瓜连作土壤微生物区系的影响 1421


第 1 茬 BS 处理土壤中可培养放线菌的含量为
2.00×106 CFU·g−1(土), 显著低于 B处理、S处理和对
照, 但后三者之间不存在显著差异; 第 2茬 S处理为
4.24×106 CFU·g−1(土), 显著低于 B处理、BS处理和
对照, 后三者间不存在显著差异; 第 3 茬对照的含
量为 1.73×106 CFU·g−1(土), 显著低于 BS 处理和 S
处理, 与 B 处理无显著差异。在不同茬之间, BS 处
理的第 2 茬显著高于第 1、3 茬, 但第 1、3 茬之间
不存在显著差异; S处理、B处理和对照第 2茬显著
高于第 1、3茬, 但第 3茬均显著低于第 1茬。
对黄瓜连作过程中细菌与真菌数量的比值(B/F)
进行计算可知, 第 1茬 BS处理 B/F为 222.30, 均低
于 S处理、B处理和对照; 第 2茬时 BS处理 B/F为
667.16, 低于对照, 高于 S处理, 但三者都低于 B处
理; 第 3茬时 BS处理 B/F为 93.04, 均高于 S处理、
B 处理和对照。在不同茬之间, BS 处理的 B/F 值先
升高后降低, 第 2茬时最高为 667.16, 高于第 1茬和
第 3茬; 其他 2个处理和对照也有这种趋势, 但第 1
茬到第 2茬的增加幅度除B处理外, 均小于BS处理;
而从第 2茬到第 3茬的降低幅度, BS处理均小于其
他两个处理和对照(因 B/F 值之间数值差异较大, 未
作显著性比较)。
2.4 黄瓜连作土壤中细菌多样性的变化
2.4.1 细菌末端标记限制性片段长度多态性
由图 1 可以看出, 黄瓜复合病圃中主要出现的
片段有: TRF21、TRF35、TRF50、TRF64、TRF75、
TRF100、TRF139、TRF150、TRF160、TRF200、TRF250、
TRF300、TRF341、TRF350、TRF400、TRF450、TRF490
和 TRF501。黄瓜复合病圃连作之前(初始)TRF片段相
对百分含量在 1%以上的峰有 18个。连作第 1茬 TRF
片段相对百分含量在 1%以上的峰, 对照有 17个, BS
处理有 9个, S处理有 11个, B处理有 9个。与出现
的总片段相比 , 对照缺少 TRF64, BS 处理缺少
TRF21、TRF35、TRF64、TRF75、TRF200、TRF350、
TRF400、TRF450和 TRF501, B处理缺少 TRF21、
TRF35、TRF64、TRF300、TRF350、TRF400、TRF450、
TRF490 和 TRF501, S 处理缺少 TRF21、TRF35、
TRF64 、TRF350、TRF400、TRF450和 TRF501。

图 1 黄瓜连茬前和第 1茬土壤中细菌末端标记限制性片
段长度多态性
Fig. 1 Terminal-restriction fragment (TRF) length
polymorphism of the bacteria in the soil before continuous
cropping and the first crop of cucumber
图中仅显示相对含量为 30%以下的 TRF 片段 , 含量超过
30%的 TRF片段柱图末端未显示。下同。Only the TRF fragments
with the relative content less than 30% were shown in the figure.
The same below.

由图 2 可以看出, 黄瓜复合病圃中连作第 2 茬
TRF 片段相对百分含量在 1%以上的峰, 对照有 15
个, BS 处理有 17 个, S 处理有 17 个, B 处理有 15
个。与出现的总片段相比, 对照缺少 TRF21、TRF35
和 TRF64, BS处理和 S处理缺少的 TRF片段相同,
都缺少 TRF64, B 处理缺少 TRF64、TRF200 和
TRF501。

图 2 黄瓜连作第 2、3茬土壤中细菌末端标记限制性片段长度多态性
Fig. 2 Terminal-restriction fragment (TRF) length polymorphism of the bacteria in the soil of the second and third crops of cucumber

1422 中国生态农业学报 2013 第 21卷


由图 2还可知, 黄瓜复合病圃中连作第 3茬TRF
片段相对百分含量在 1%以上的峰, 对照有 17个, BS
处理有 14个, S处理有 14个, B处理有 18个。与出
现的总片段相比, 对照缺少 TRF64, B处理没有缺失
片段, BS处理和 S处理缺少的 TRF片段相同, 都缺
少 TRF35、TRF50、TRF64和 TRF250。
2.4.2 黄瓜连作土壤细菌多样性的变化
表 4表明, 黄瓜连作土壤细菌初始丰富度为 18。
在各茬内, 第 1茬时BS处理为 9, 显著低于对照, 但
与 S处理和 B处理无显著差异; 第 2茬时 BS处理和
S 处理同为 17, 显著高于对照和 B 处理; 而第 3 茬
时 BS 处理和 S 处理同降为 14, 显著低于对照和 B
处理。不同茬之间, BS处理在第 1茬时最低为 9, 在
第 2 茬时显著升高到 17, 但第 3 茬时又显著降低到
14; 而对照则在第 2 茬时丰富度最小为 15, 明显低
于初始和第 1、3茬。
黄瓜连作土壤细菌优势度指数初始时最高, 为
0.73, 均高于各茬的所有处理。在各茬内, 第 1茬时
BS处理与 B处理和 S处理之间差异不显著, 但均显
著低于对照; 第 2茬时 BS处理与 B处理和 S处理之
间差异不显著, 但均显著高于对照; 而第 3 茬时各
处理之间差异不显著。在不同茬之间, BS处理在第 2
茬时最高为 0.59, 高于第 1和第 3茬。
土壤细菌多样性指数初始时最高为 2.10, 均显著高
于各茬的所有处理。在各茬内, 第 1 茬时 BS 处理与 B
处理、S处理之间差异不显著, 但均显著低于对照; 第 2
茬时 BS 处理和 S 处理间差异不显著, 但均显著高于对
照和 B处理; 而第 3茬时 BS处理和 S处理同时降低并
且差异不显著, 但均显著低于对照和 B 处理。在不同茬
之间, BS处理 3茬之间存在显著差异, 第 2茬时为最高。
土壤细菌均匀度指数初始时最高, 为 0.71, 高
于各茬的所有处理。在各茬内, 第 1 茬各处理间差
异不显著, BS 处理略低于对照; 第 2 茬时各处理之
间差异不显著, BS 处理略高于对照; 而第 3 茬时各
处理之间无显著差异。在不同茬之间, BS处理在第 2
茬时最高, 为 0.59, 均略高于第 1、3茬。
表 4 黄瓜连作土壤细菌多样性
Table 4 Bacterial diversity in soil during continuously cropping of cucumber under different treatments
茬口
Crops for rotation
处理
Treatment
丰富度(S)
Richness
优势度指数(D)
Dominance index
多样性指数(H′)
Diversity index
均匀度指数(J′)
Uniformity index
初始 Initiation — 18a 0.73a 2.10a 0.71a
CK 17a 0.59abc 1.68b 0.58ab
B 9d 0.39e 0.99h 0.45b
S 11d 0.41de 1.08gh 0.45b
第 1茬 First crop
BS 9d 0.41de 1.05gh 0.48b
CK 15b 0.42cde 1.17fg 0.43b
B 15b 0.50bcde 1.40de 0.52b
S 17a 0.59ab 1.69b 0.58ab
第 2茬 Second crop
BS 17a 0.59ab 1.70b 0.59ab
CK 17a 0.52bcde 1.48cd 0.51b
B 18a 0.57abcd 1.63bc 0.56ab
S 14b 0.48bcde 1.31ef 0.50b
第 3茬 Third crop
BS 14b 0.48bcde 1.33def 0.50b

2.5 黄瓜连作土壤细菌代表性种群分析
利用Mica网络数据库进行数据分析, 得出优势
片段 TRF64、TRF139、TRF151、TRF160、TRF341、
TRF501 所代表的细菌菌属。其中 TRF64 菌群主要
包含适应盐和酸性土壤的微生物 , 如嗜热菌
(Acidosphaera rubrifaciens)以及梭状芽孢杆菌属
(Clostridium)和奈瑟菌属(Neisseria)等; TRF139菌群
主要含有无害梭菌(Clostridium innocuum)、类芽孢杆
菌属 (Paenibacillus)和红球菌 (Rhodococcus sp.)。
TRF151 主要含有芽孢杆菌属、大豆根瘤菌
(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus
laterosporus)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、显核菌
属(Caryophanon)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)
和卵状奎因氏菌(Quinella ovalis)。TRF160主要含有
变形菌门中的 δ-Proteobacteria、厚壁菌门(Firmicutes)
和放线菌门(Actinobacteria)。TRF341 菌群主要含有
一些功能菌, 如印度拜耶林克氏菌(Beijerinckia in-
dica)、甲烷氧化细菌(Methylosinus trichosporium)和
光合细菌球形红细菌 (Rhodococcus sphaeroides)。
TRF501是一些变形菌门中的 γ-Proteobacteria、亚硝
化单胞菌属(Nitrosomonas)、红环菌属(Rhodocyclus)
和红长命菌属(Rubrivivax)。
第 11期 张 婷等: “秸秆降解生防菌强化技术”对黄瓜连作土壤微生物区系的影响 1423


2.6 黄瓜连作的产量及发病情况
盛果期各处理的日均黄瓜产量如表 5 所示。在
同一茬内, 第 1茬 BS处理的产量显著高于 B处理和
对照, 与 S处理无显著差异; 第 2茬和第 3茬 BS处
理的产量都显著高于其他处理, 其中第 3茬 BS处理
的产量最高, 为 2.09 kg·d−1。在不同茬之间, 各处理
产量均表现逐茬增加, 但 BS 处理产量均显著高于
其他处理和对照。
表 5 不同处理下黄瓜连作的产量及根结线虫病情指数
Table 5 Yield and root-knot nematode disease index during
continuously cropping of cucumber under different treatments
茬口
Crops for rotation
处理
Treatment
产量
Yield (kg·d−1)
病情指数
Disease index
CK 0.77h 6.67g
B 1.04g 8.89f
S 1.11fg 11.11e
第 1茬 First crop
BS 1.25ef 6.67g
CK 1.25ef 17.78c
B 1.35e 15.56d
S 1.37e 20.00b
第 2茬 Second crop
BS 1.62d 17.78c
CK 1.66cd 31.11a
B 1.8bc 11.11e
S 1.92b 20.00b
第 3茬 Third crop
BS 2.09a 8.89f

每茬黄瓜种植结束时根结病情指数调查结果表
明, 第 1茬 BS处理与对照无显著差异, 但显著低于
S处理和 B处理; 第 2茬 BS处理与对照无显著差异,
但显著低于 S处理, 高于 B处理; 第 3茬 BS处理的
病情指数为 8.89%, 显著低于其他处理和对照。在不
同茬之间, 对照和 S 处理的病情指数逐茬显著增加,
BS处理和 B处理在第 2茬时显著升高, 但在第 3茬
时又显著降低。
3 讨论
BS处理的淡紫紫孢霉在施入后连作 3茬过程中
数量变化不显著; 芽孢杆菌的数量在第 2 茬时显著
高于第 1茬, 而第 2、3茬之间无显著差异。说明生
防菌与秸秆同时施用到土壤后, 在连作到第 2、3茬
时仍然能够在土壤中稳定生存, 这与曹书苗等[31]关
于土壤中施入有机养分可促进接入土壤中生防菌生
长繁殖的研究结果相似。
对黄瓜复合病圃中枯萎病菌含量的研究结果表
明, 在第 1、2 茬结束时 BS 处理与 S 处理及对照相
比均有所降低; 根结线虫的数量表现为, BS处理在
第 2 茬时显著低于对照, 说明 BS 处理在连作两茬时,
能有效控制病原物数量。但在第 3茬时, BS处理的
枯萎病菌含量与对照没有显著差异, 根结线虫数量
显著高于对照和初始含量, 可能与土壤中加入秸秆
后有机质含量增加有关, 这一结果与曹奎荣等[32]研
究报道一致。对黄瓜产量和病害进行调查, BS 处理
能显著提高连作黄瓜的产量和降低根结线虫的病情
指数, 说明生防菌、病原菌与土壤中其他微生物已
经形成一个较为稳定的生态环境, 并能有效控制病
害发生。
细菌与真菌数量的比值(B/F)是表征土壤肥力的
一个潜在指标[33]。连作 3 茬 BS 处理的 B/F 值先升
高后降低, 这种变化说明连作第 1、2茬土壤由“真菌
型”向“细菌型”转变, 但到第 3 茬时又从“细菌型”土
壤开始转变成“真菌型”土壤, 这一现象表明, BS 处
理后能够使病土在连作两茬时, 保证由“真菌型”病
土向“细菌型”健康土转变。因此, 可以通过在第 3
茬时继续进行 BS 处理来保证土壤的“细菌型”健康
状态。放线菌数量对黄瓜连作的反应不如细菌明显,
这一结果与吕卫光等和李刚等[34−35]的报道相似。
虽然可培养微生物占土壤微生物总量的比例不
足 1%[36], 但土壤中可培养细菌可能是对土壤生态
系统贡献最大的类群, 它们与整个微生物群体相比
更容易遭受土壤生态系统变化的影响。对土壤细菌
进行 T-RFLP 多样性分析表明, 经过 BS 处理后, 其
丰富度、优势度指数、多样性指数和均匀度指数均
表现为第 1 茬较低, 第 2 茬除均匀度指数略增加外,
其他指数均显著升高, 但第 3 茬又开始降低, 表明
BS处理在第 2茬时能有效提高土壤的细菌多样性。
该结果与本研究中可培养微生物的分析结果相同。
结果还表明, BS 处理对 TRF139 片段所含菌群的含
量有明显促进作用, 对 TRF341和 TRF501片段所含
菌群的含量有显著抑制作用。TRF139菌群主要含有
的类芽孢杆菌属是一种生长快、营养简单、能够形
成具有较强抗逆能力芽孢的菌属, 其中多粘类芽孢
杆菌的某些种不仅是常见的植病生防细菌, 也是植
物根际促生细菌[37−38]。TRF341含有甲烷氧化菌, 其
生长受到抑制必然阻碍甲烷的氧化, 这一结果与Ma
等[39]的研究相吻合。TRF501包括一些变形菌门中的
γ-Proteobacteria, 这一类群菌中含有导致土壤抑菌
作用的菌属[40], 故而 BS 处理能有效缓解土壤的抑
菌作用; 其中还包括很多好氧或兼性细菌, 通常其
降解能力可变, 但也有一些无机化能种类如可以氧
化氨的亚硝化单胞菌属 [41]和具有光合作用的种属
(红环菌属和红长命菌属), 这类菌对于维持土壤微
生物的多样性和功能有着重要作用。
BS 处理在一定的连作茬数内能显著调节土壤
微生物群落结构, 使连作导致的微生物种群失衡趋
1424 中国生态农业学报 2013 第 21卷


于平衡, 使土壤微环境达到相对稳定的状态, 抑制
或减少病害发生, 提高作物产量。
另外, 土壤微生物的研究很大程度上受研究方
法的限制。但由于土壤微生物种类繁多, 生存状况
复杂, 缺少可以区分的明显特征, 因此任何一种独
立的分析方法都不可能完善地完成人们对复杂土壤
微生物的认识。本研究结果表明, 将传统培养法和
T-RFLP分析技术相结合, 基本上能够对土壤微生物
的群落结构及其变化进行很好地研究, 是分析土壤
微生物种群变化较为理想的方法。

致谢 郭荣君老师在本研究过程中给予了大力帮助,
马锐、刘颖等在本文写作过程中给予了悉心指点 ,
在此谨致谢忱。
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