全 文 ：中国生态农业学报 2012年 7月 第 20卷 第 7期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Jul. 2012, 20(7): 932−944


* 中美合作项目“柑橘对木虱抗生种质资源的筛选”(6618-22000-037-01S)、中美合作项目“柑橘木虱及黄龙病田间生态研究”(10-8100-
1452-CA)、福建省财政专项(STIF-Y03)和公益性行业(农业)科研专项(201003067)资助
** 通讯作者: 刘波(1957—), 男, 博士, 研究员, 主要从事微生物生物技术和农业生物药物研究。E-mail: fzliubo@163.com
郑雪芳(1977—), 女, 博士, 助理研究员, 主要从事微生物生物技术和农业生物药物研究。E-mail: zhengxuefang2003@yahoo.com.cn
收稿日期: 2011-08-10 接受日期: 2012-02-08
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.00932
柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究*
郑雪芳1 刘 波1** 孙大光1 朱育菁1 段永平2
夏育陆3 阮传清1 肖荣凤1
(1. 福建省农业科学院农业生物资源研究所 福州 350003; 2. 美国农业部佛罗里达园艺试验室 Fort Pierce FL 34945;
3. 美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心 Raleigh NC 27695-7514)
摘 要 采用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法, 分析柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片内生菌群落结构。
结果表明, 从柑橘黄龙病植株叶片共检测到 42 种 PLFAs, 其中完全分布的生物标记有 9种, 不完全标记有 33
种。对 PLFAs 进行聚类分析表明, 柑橘黄龙病株不同部位叶片内生菌 PLFAs 可以分为 2 大类群, 类群 I 特点
为脂肪酸生物标记均为不完全分布, 类群Ⅱ的特点为脂肪酸生物标记在被检测的柑橘黄龙病植株的大部分叶
片中均有分布。柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片内生菌 PLFAs 组成及含量存在差异。总体来看, 不同
朝向中, 东面叶片内生菌 PLFAs 含量最大; 不同高度中, 下部叶片内生菌 PLFAs 含量最大; 不同健康状态中,
带有黄龙病原叶片内生菌 PLFAs含量比健康植株叶片更大。此外, 不同朝向中, 南面叶片真菌/细菌值最大, 革
兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的比值(G+/G−)较大; 不同高度叶片中, 真菌/细菌值差异不明显, G+/G−值差异明显,
上部最大, 下部次之, 中部最小; 不同健康状态中, 健康叶片的真菌/细菌值高于黄龙病株叶片。对柑橘黄龙病
株不同部位及健康状态叶片内生菌多样性研究表明, 不同朝向和不同健康状态的叶片内生菌种群多样性指数
差异显著, 不同高度的叶片内生菌种群多样性指数差异不显著。主成分分析表明, 主成分 1和主成分 2基本上
能把柑橘黄龙病株不同朝向叶片内生菌种群区分开来。对柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片进行聚类,
结果表明带有黄龙病原的叶片聚为一类, 不带黄龙病原的健康叶片分聚为两类, 其中, 不同朝向的叶片分聚
在不同的亚类群中, 表明柑橘黄龙病株内生菌 PLFAs 分布与叶片健康状态和叶片朝向均有紧密关系, 与叶片
健康状态关系更为密切。
关键词 柑橘 黄龙病 植物内生菌 磷脂脂肪酸 群落结构 叶片朝向 叶片高度 叶片健康状态
中图分类号: S154.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)07-0932-13
Plant endophyte PLFAs polymorphism in Huanglongbing-affected
red pomelo plant
ZHENG Xue-Fang1, LIU Bo1, SUN Da-Guang1, ZHU Yu-Jing1, DUAN Yong-Ping2,
XIA Yu-Lu3, RUAN Chuan-Qing1, XIAO Rong-Feng1
(1. Agricultural Bio-resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 2. Horticultural
Research Laboratory, United States Department of Agriculture, Fort Pierce FL 34945, USA; 3. International Programs Center for
Integrated Pest Management, North Carolina State University, Raleigh NC 27695-7514, USA)
Abstract Huanglongbing (HLB, a yellow shoot disease) is the most destructive citrus disease in the world. Plant endophyte
communities of red pomelo have been associated with HLB. It was therefore important to investigate the endophyte
community of red pomelo plant in relation to HLB. In this paper, endophyte community structures in different spatial positions
and healthy conditions of HLB-affected red pomelo plants were analyzed using phospholipid fatty acids [PLFAs biomarkers
based at Sherlock MIS (MIDI Inc.)]. Based on the results, 42 PLFAs were detected and 9 of them had wild distributions across
all the samples while the other 33 were mainly distributed in different leaf orientations. Cluster analysis showed that PLFAs in
第 7期 郑雪芳等: 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究 933


different leaves in space existed into two community groups. While PLFAs in the group I belonged to an incomplete
distribution, PLFAs in group Ⅱ were distributed almost in all samples. There existed some differences in PLFAs content and
composition in leaves of HLB-affected red pomelo plants in different spatial positions and health conditions. When compared
among each other, it was noted that PLFAs content in east-oriented leaves were maximum among different orientations. The
same was true for lower parts leaf in PLFAs content. Healthy leaves contain more PLFAs than HLB-affected leaves.
Furthermore, south-oriented leaves had the highest fungi/bacteria PLFAs ratio and also higher G+/G− (gram-positive
bacteria/gram-negative bacteria) PLFAs ratio than north/west-oriented leaves. There was no significant difference in
fungi-to-bacteria PLFAs ratio at different leaf levels. However, significant differences existed in PLFAs G+/G−
ratio in different height leaves. While the highest ratio occurred in the leaves at the upper parts of plant, the lowest
ratio was in leaves at the middle parts of plant. Fungi-to-bacteria PLFAs ratio was higher in healthy leaves than
that in HLB-affected leaves. Diversity indexes of Shannon, Simpson and Pielou of endophyte communities among
leaves with different orientations and healthy conditions were significantly different. However, no apparent
differences were noted among different heights leaves. Principal component analysis showed that the first and
second principal components accounted for a total of 82.99% of the variation, which may distinguish endophyte
communities in leaves with different orientations. Cluster analysis divided healthy leaves in two groups, and
HLB-affected leaves in the other group. The results indicated that the distribution of PLFAs was related with
health conditions and orientations of leaves, and was more closely in the former than the latter.
Key words Red pomelo plant, Huanglongbing (HLB), Plant endophyte, Phospholipid fatty acid (PLFA), Microbial
community structure, Leaf orientation, Leaf height, Leaf health condition
(Received Aug. 10, 2011; accepted Feb. 8, 2012)
黄龙病[Candidatus Liberibacter asiaticus Jagoueix
et al. (Las)]是一种世界范围内的柑橘产区最严重和最
具毁灭性病害[1−3]。自 20世纪初在华南地区报道柑橘
黄龙病发生以来, 除地中海盆地、西亚、澳洲和太平
洋岛屿外, 在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲
的 40多个国家已相继发生该病[4]。我国为柑橘黄龙病
的老病区, 其发生的历史长、分布广、危害大。
植物内生菌与寄主植物在长期共同进化过程中
形成了密切的相互关系, 是植物微生态系统的组成
部分[5−6]。植物内生菌分布于植物体内, 并与植物互
作共生, 其代谢活动及产物可促进宿主植物适应外
界各种环境压力, 维持生态系统平衡。由于进化历
程和生存条件的差异, 不同寄主植物或环境条件的
不同, 植物内生菌多样性也有差异[7]。柑橘植株因品
种、气候、地理、土壤、病虫等因素的差异, 其内
生菌包括黄龙病菌的群落结构存在着较大差异, 这
种差异可以形成柑橘内生菌的微生物标记, 即在特
定时空、品种特性条件下, 不同柑橘植株存在着特
定的内生菌微生物群落结构, 指示着柑橘的健康状
态。本研究引入植物内生菌磷脂脂肪酸(PLFAs)生物
标记的分析, 作为柑橘内生菌的指示物, 分析柑橘
内生菌的群落结构变化动态。
PLFAs是生物体内不可缺少的能量和营养物质,
是生物体的基本结构成分之一, 在细胞中绝大部分
脂肪酸以结合形式存在, 构成具有重要生理功能的
脂类, 它是构成生物膜的重要物质; 是有机体代谢
所需燃料的贮存形式; 作为细胞表面物质与细胞识
别、种族特异性和细胞免疫等密切相关; 具有结构
多样性和高的生物学特异性, 是特别有效的生物标
记物[8]。PFLAs 技术在土壤微生物群落组成和种群
变化方面的研究中得到越来越广泛的应用 [9−13], 用
于揭示植被、作物栽培及土地管理方式、有机污染
物、重金属、季节变化、气侯条件及其他方面等诸
多因素对土壤微生物群落结构和生物量的影响。利
用 PLFAs作为生物指示物对柑橘植物内生菌种群动
态的研究尚鲜见报道。本研究利用 PLFAs标记分析
柑橘黄龙病株不同朝向(东、西、南、北)、不同高度
(上、中、下)及不同健康状态叶片内部微生物群落结
构多样性, 旨在寻找柑橘黄龙病原在植株不同部位
的分布特点及与植物内生菌种群结构的相互关系 ,
以柑橘植物内生菌为研究切入点, 探索柑橘黄龙病
的发生特点, 为柑橘黄龙病的研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试柑橘品种为“红心柚”(Citrus grandis Osbeck),
种植于福建省顺昌县北门水库边赵氏园艺技术研究
所果树基地, 面积 3 hm2, 树龄为 3年。选取具有黄
龙病症状的柑橘植株 16株, 将各植株按东、西、南、
北 4 个朝向, 每个朝向再划分上、中、下部位, 共
12个部位, 取样各部位柑橘植株的新梢叶和老梢叶,
将 16 株柑橘相应部位采集的叶片混合, 共 16 份样
品(注: 12 个部位的新梢和老梢合起来应有 24 份样
品, 但由于有些部位只有老梢没有新梢, 故只采到
934 中国生态农业学报 2012 第 20卷


16份样品)。样品采集后迅速带回, 严格进行表面消
毒, 具体步骤如下: 用 75%乙醇表面消毒 30 s, 10%
次氯酸钠浸泡 10 min, 无菌水冲洗 5次, 吸取最后一
次冲洗液(100 μL)涂布于牛肉膏蛋白胨培养基, 来
验证表面消毒是否彻底。将消毒过的样品分装于 50
mL 无菌的离心管中, 于−20 ℃冰箱保存备用, 进行
黄龙病原分子检测和内生菌的脂肪酸生物标记检测,
每个样品进行 3次重复。
1.2 柑橘黄龙病原分子检测
样品 DNA 提取方法参见胡浩等[14], 柑橘黄龙
病菌检测引物如表 1 所示, 由上海英俊生物工程有
限公司合成。柑橘黄龙病原的分子检测, PCR扩增体
系均为 25 µL, 含有 1 U Taq酶, 2.5 μL的 10×PCR
Buffer, 0.5 μL的 10 mmol·L−1的 4种 dNTP, 1 μL的
10 μmol·L−1引物和 25 ng 的 DNA模板。PCR扩增
程序见表 2。PCR产物的检测, 取 10 µL PCR产物,
点样于 1.5%的琼脂糖凝胶中, 以 100 bp Marker作为
标准分子量, 120 V电压、1倍 TAE缓冲液中电泳 2 h,
EB染色, 采用凝胶成像系统观察结果。
1.3 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs分析
磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记测定。柑橘不同部
位叶片内生菌 PLFAs 的提取步骤如下: 称取 3 g 叶
片于研钵中, 用液氮研磨成粉状, 装入 50 mL离心管
中, 加入 20 mL 0.2 mol·L−1的KOH甲醇溶液, 充分混
匀, 斡旋样品 5 min, 100 ℃水浴 10 min; 加入 3 mL
1.0 mol·L−1醋酸溶液中和 pH, 充分摇匀; 加入 10 mL
正已烷, 充分摇匀, 在 2 000 r·min−1条件下离心 15 min,
将上层正己烷相转入干净玻璃试管中, 吹干; 加入
0.6 mL 体积比为 1︰1 的正已烷︰甲基叔丁基醚溶
液, 充分溶解, 转入 GC小瓶, 用于脂肪酸测定。
PLFAs成分采用美国 Agilent6890N型气相色谱
仪测定。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混
合物标样和待检样本: 色谱柱 HP-ULTRA2(25 m×
0.2 mm×0.33 µm), 分流进样, 进样量 1 μL, 分流比
为 100︰1, 载气(H2)流速为 2 mL·min−1, 尾吹气(N2)流
速为 30 mL·min−1。二阶程序升高柱温: 以 5 ℃·min−1
的速率使柱温由 170 ℃升至 260 ℃; 再以 40 ℃·min−1
的速率升温至 310 ℃, 保持 90 s。汽化室温度为 250 ℃,
检测器温度为 300 ℃, 柱前压 10.00 psi(1 psi= 6.895 kPa)。
脂肪酸成分分析采用微生物自动分析仪(Sherlock
MIS 美国 MIDI 公司生产): 系统根据各组分保留时
间计算等链长(ECl)值确定目标组分的存在, 采用峰
面积归一化法计算各组分的相对含量。
1.4 统计分析
1.4.1 柑橘黄龙病株内生菌PLFAs的分布特性分析
柑橘内生菌群 PLFAs检测和聚类分析。根据不
同 PLFAs 在柑橘黄龙病植株不同部位的分布, 分析
生物标记的类型: 如果一种生物标记存在于全部的
叶片中, 则称为完全分布的生物标记; 如果存在于
部分被测叶片中, 则称为不完全分布的生物标记。
对 PLFAs 的聚类分析, 利用柑橘黄龙病株不同部位
叶片 PLFAs 数据构建矩阵, 以柑橘黄龙病株不同部
位叶片为样本, 以 PLFAs 含量为指标, 采用兰氏距
离为尺度, 用类平均法进行 Q 型系统聚类, 分析
PLFAs在不同部位叶片中的分布特性。
1.4.2 柑橘黄龙病株叶片指示微生物类群的 PLFAs
组成及含量比较
不同的 PLFAs 指示不同类群的微生物[15−16]。
Frostegård 等[17]认为支链磷脂脂肪酸在 G+中所占比
例极高, 可指示 G+菌群生物量; 而单烯不饱和脂肪
酸和环化脂肪酸常见于 G−菌群中; 饱和脂肪酸可代
表总细菌生物量, 文中分析的 PLFAs 所指示的微生
物类群参考相关文献见表 2。根据表 2文献, 检测柑
橘黄龙病株不同朝向(东、西、南、北)和不同高度(上、
中、下)的叶片内生菌 PLFAs种类, 统计 PLFAs所指
示的细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性菌、革兰氏
阴性菌含量, 进行显著性检验, 分析比较不同方位
(东、西、南、北及上、中、下, 共 12 个部位)及不
同健康状态(携带黄龙病原和没有携带黄龙病原)的
柑橘叶片内生菌空间分布结构。

表 1 柑橘黄龙病原检测引物序列及反应程序
Table 1 Primers sequence and PCR program of citrus Huanglongbing pathogens detection
引物类型
Type of primers
引物序列
Sequence of primers
扩增片断大小
Fragment size
(bp)
PCR反应程序
Program of PCR



OI1/OI2C 直接 PCR
Direct-PCR
OI1: 5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’
OI2C: 5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’ 1 160
94 ℃预变性 3 min; 94 ℃变性 35 s, 64 ℃退火 35 s, 72 ℃
延伸 60 s, 40 个循环; 72 ℃后延伸 10 min。3 min of
denaturation at 94 ℃ followed by 40 cycles of 94 ℃ for 35
s, 64 ℃ for 35 s, and 72 ℃ for 60 s; 10 min of elongation
at 72 ℃.

CG03F/CG05R
巢式 PCR
Nest-PCR
CG03F: 5’-RGGGAA AGATTTTATTGGAG-3’
CG05R: 5’-GAAAATAYCATCTCTGATATCGT-3’
780
94 ℃预变性 2 min; 94 ℃变性 35 s, 53 ℃退火 35 s, 72 ℃
延伸 45 s, 35 个循环; 72 ℃后延伸 7 min。2 min of
denaturation at 94 ℃ followed by 35 cycles of 94 ℃ for 35 s,
53 ℃ for 35 s, and 72 ℃ for 45s; 7 min of elongation at 72 ℃.
第 7期 郑雪芳等: 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究 935


1.4.3 柑橘黄龙病株不同部位内生菌 PLFAs 多样
性指数分析
引入群落生态学丰富度指数 Shannon、优势度
指数 Simpson 和均匀度指数 Pielou, 分析柑橘黄龙
病株不同部位叶片内生菌种群的多样性。按照计算
物种指数方法[24]计算各指数值。
Shannon指数: H=−∑PilnPi (1)
Simpson指数: C=1−∑(ni/N)2 (2)
Pielou指数: e=H/lnS (3)
式中, S为群落中的PLFAs总种类数, Pi=ni/N, ni为i类
PLFAs个数, N为该试验中PLFAs个数。
1.4.4 柑橘黄龙病株不同部位内生菌 PLFAs 主成
分分析
采用 SPSS 软件中多元统计分析中的主成分析
(principal component analysis, PCA)方法, 主要包括
数据求协方差矩阵 , 计算特征方程中所有特征值 ,
并根据特征值累积比例确定主成分的数量, 计算主
成分载荷值和主成分得分 , 进行一级主成分评分
等。主成分分析过程采用 SPSS 软件的相关模块进
行处理, 具体步骤参见文献[25−26]。
1.4.5 柑橘黄龙病株不同部位内生菌 PLFAs聚类分析
将柑橘黄龙病株不同部位叶片中的 PLFAs数据
构建矩阵 , 以不同类型的 PLFAs 为样本, 以每种
PLFA在不同叶片分布量为指标, 构建矩阵, 以兰氏
距离为尺度, 用可变类平均法进行系统聚类。
2 结果与分析
2.1 柑橘植株黄龙病原的确认
利用 nest-PCR法将柑橘黄龙病株不同方位叶片
进行了黄龙病原的分子检测, 经 PCR 扩增后, 能扩
增出特异性条带 , 说明这些叶片中含有黄龙病菌 ,
没有扩增出相应条带的说明不含有黄龙病菌 ,
nest-PCR 扩增结果如图 1 所示。植株感病叶片组织
中提取的 DNA和阳性对照能扩增出 780 bp的特异
性靶带, 而健康叶片组织DNA和清水对照未能扩增
同一靶带。经 nest-PCR 检测, 东面叶片和西面叶片
的所有样本及北面中部、下部叶片均含有黄龙病原,
而南面叶片的所有样本及北面上部叶片未带有黄龙
病原(表 3)。
2.2 柑橘植株不同部位叶片内生菌 PLFAs 的分布
特性
从柑橘黄龙病株不同部位叶片中共检测到从
C10~C20共 42种 PLFAs生物标记(表 4), 含有各种
饱和的 PLFAs, 如 14:0、15:0、16:0等; 不饱和 PLFAs,
如 18:3wc (6,9,12)、14:1wc、15:1w6c 等; 分支的
PLFAs, 如 a15:0、a16:0、i16:0等; 说明柑橘黄龙病
植株内生菌群落 PLFAs种类丰富。

表2 不同类型微生物的PLFAs生物标记
Table 2 PLFAs referred to different groups of microbes
微生物类型
Microbial group
磷脂脂肪酸标记
Phospholipids fatty acids signatures
文献
Reference
细菌 Bacteria in general 14:0, 15:0, 16:0, 17:0, i15:0、a15:0、i17:0, a17:0、i19:0, 16:1w5, a19:0, 16:1wt(等饱和脂肪酸 Saturated fatty acids) [17−18]
真菌 Fungi 18:2w6,9, 18:1w9c, 18:3w(6,9,12)(等多烯脂肪酸 Polyunsaturated fatty acids) [18−20]
放线菌 Actinomycete 10Me16:0, 10Me17:0, 10Me18:0 [21,18]
革兰氏阳性菌
Gram-positive bacteria
a16:0, i16:0, a17:0, i17:0, i18:0(等支链脂肪酸 Branched fatty acids) [17,19]
革兰氏阴性菌
Gram-negative bacteria
i15:0 3OH, 16:1w9c, i17:0 3OH, 17:1wc(等单烯不饱和脂肪酸 Monounsaturated fatty acids) [22−23]



图 1 柑橘黄龙病原的分子检测结果
Fig. 1 Patterns of PCR specifically amplification with citrus Huanglongbing pathogens
M: 分子量标准(3 000 bp、2 000 bp、1 500 bp、1 200 bp、1 031 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、
100 bp) DNA marker (3 000 bp, 2 000 bp, 1 500 bp, 1 200 bp, 1 031 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp); CK+: 阳
性对照 Positive control; CK−: 阴性对照 Negative control. 图中编号与表 3相同 Number in the pattern is the same to table 3.
936 中国生态农业学报 2012 第 20卷


表 3 柑橘不同部位叶片黄龙病病症及其病原检测结果
Table 3 Symptom and pathogens detection of Huanglongbing of leaves in different positions of red pomelo plant
编号
No.
样品编号
Sample number
叶片朝向
Orientation of leaf
叶片部位
Position of leaf
叶片生长状态
Growth state of leaf
病症
Symptom
病原检测结果
Detection of pathogens
1 E-1-O-d 东面 East 上部 Upper part 老梢 Old leaf 黄化 Yellowing +
2 E-2-O-d 东面 East 中部Middle part 老梢 Old leaf 斑驳Variegated chlorosis +
3 W-1-O-d 西面 West 上部 Upper part 老梢 Old leaf 正常 Normal +
4 W-2-N-d 西面West 中部Middle part 新梢 New leaf 正常 Normal +
5 W-2-O-d 西面West 中部Middle part 老梢 Old leaf 正常 Normal +
6 W-3-N-d 西面West 下部 Lower part 新梢 New leaf 黄化 Yellowing +
7 W-3-O-d 西面West 下部 Lower part 老梢 Old leaf 黄化 Yellowing +
8 S-1-N 南面 South 上部 Upper part 新梢 New leaf 正常 Normal −
9 S-1-O 南面 South 上部 Upper part 老梢 Old leaf 正常 Normal −
10 S-3-O 南面 South 下部 Lower part 老梢 Old leaf 正常 Normal −
11 N-1-N 北面 North 上部 Upper part 新梢 New leaf 正常 Normal −
12 N-1-O 北面 North 上部 Upper part 老梢 Old leaf 正常 Normal −
13 N-2-N-d 北面 North 中部Middle part 新梢 New leaf 正常 Normal +
14 N-2-O-d 北面 North 中部Middle part 老梢 Old leaf 正常 Normal +
15 N-3-N-d 北面 North 下部 Lower part 新梢 New leaf 黄化 Yellowing +
16 N-3-O-d 北面 North 下部 Lower part 老梢 Old leaf 黄化 Yellowing +
“+”代表检测出黄龙病病原, “−”代表未检测出黄龙病病原。“+” means this part contains citrus Huanglongbing pathogen, “−” means no.

PLFAs 在柑橘黄龙病植株中的分布存在 2 种类
型: 一类为完全分布, 即 PLFAs在柑橘黄龙病株各空
间叶片均有分布, 如 14:0、a15:0、15:0等, 共有 9种
生物标记。另一类为不完全分布, 即 PLFAs只在柑橘
黄龙病株特定空间中分布, 共有 33 种 PLFAs生物标
记属于此种分布类型, 如 PLFA生物标记 11:0只在柑
橘黄龙病株南面上部的老梢和北面中部老梢中有分
布, 其他空间无分布; 指示硫酸盐还原细菌的 PLFAs
生物标记 10Me16:0只在柑橘黄龙病株西面中部新梢
和北面下部新梢中有分布, 其他空间无分布。
对柑橘黄龙病株内生菌 PLFAs 进行聚类分析,
当兰氏距离为 48.79 时, 柑橘黄龙病株不同部位叶
片内生菌 PLFAs可以分为 2大类群(图 2)。类群 I包
含了 26 个不完全分布的 PLFAs 标记和 1 个完全分
布的 PLFAs标记, 该类群特点为 PLFAs只在柑橘黄
龙病株少部分叶片分布; 类群Ⅱ包含了 10:0 3OH、
12:0、i11:0 3OH等 7个不完全分布的 PLFAs生物标
记和 14:0、a17:0、17:0等 9个完全分布的 PLFAs生
物标记, 该类群的特点为 PLFAs 在柑橘黄龙病株许
多不同部位的叶片均有分布。
2.3 柑橘植株不同部位叶片内生菌 PLFAs 组成及含
量比较
2.3.1 不同朝向叶片的比较
根据 Frostegård 等[17]和 Zelles 等[27−28]的方法计
算出细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性细菌(G+菌)
和革兰氏阴性细菌(G−菌)的 PLFAs含量(表 5)及细菌
和真菌及 G+菌和 G−菌的比例(图 3)。


图2 柑橘黄龙病植株不同方位叶片内生菌PLFAs聚类分析
Fig. 2 Cluster analysis of PLFAs in leaves at different posi-
tions of Huanglongbing-affected red pomelo plant

表 4 柑橘黄龙病植株不同部位叶片 PLFAs的分析
Table 4 Analysis of PLFAs biomarkers in leaves at different positions of Huanglongbing-affected red pomelo plant
样品编号 Sample number
PLFAs 微生物类型
Type of microbe E-1-O-d E-2-O-d W-1-O-d W-2-N-d W-2-O-d W-3-N-d W-3-O-d S-1-N S-1-O S-3-O N-1-N N-1-O N-2-N-d N-2-O-d N-3-N-d N-3-O-d
10:0 2OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.46 1.70 0.50 0.97
10:0 3OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 63.82 35.86 9.83 49.92 14.96 16.74 13.25 24.90 0.00 34.39 6.29 33.70 18.51 88.88 17.36 0.00
i12:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 3.32 1.42 0.00 0.48 0.70 0.39 1.81 1.68 0.00 0.96 0.00 1.32 0.00 1.14 0.77 0.00
12:0 细菌 Bacteria in general 17.40 15.84 4.49 6.56 11.46 8.04 17.29 12.73 0.00 15.40 1.91 12.56 25.11 14.94 10.33 0.00
i11:0 3OH
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 7.58 5.55 1.41 0.00 2.52 1.69 2.78 14.25 2.24 2.81 1.28 3.13 2.04 2.60 2.32 3.10
i13:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 0.00 0.70 0.00 0.00 0.79 0.39 1.52 0.88 0.00 0.82 0.00 0.58 1.36 0.00 0.58 0.00
12:0 2OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 0.36 0.43 0.00 0.00 0.00 0.00 0.60 0.60 0.00 0.00 0.00 0.00 0.30 0.00 0.49 0.00
i14:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 0.72 0.39 0.00 0.00 1.98 0.00 0.79 1.55 0.27 0.37 0.00 0.00 0.00 0.00 1.75 0.00
a13:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 0.00 0.00 0.00 0.71 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.71 0.00 0.00
14:1 w5c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 1.77 1.09 0.31 0.00 2.53 0.59 1.73 1.10 1.11 1.28 0.75 0.43 0.92 0.00 1.76 0.89
a14:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 2.19 0.00 0.53 1.31 0.00 0.00 3.48 3.97 0.00 0.00 1.52 0.00 0.00 1.44 3.48 0.00
14:0 细菌 Bacteria in general 29.22 29.28 8.36 2.98 24.90 17.94 30.37 18.36 2.96 26.63 2.31 22.77 27.15 3.88 21.23 1.75
13:0 2OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 0.86 0.00 0.00 0.52 0.00 0.00 1.20 0.75 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.73 0.00
a15:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 2.09 1.58 0.70 1.45 2.53 2.12 3.40 4.92 2.99 4.92 1.86 1.84 2.22 1.57 2.78 2.42
15:1 w6c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 4.15 6.06 1.29 0.00 5.53 4.11 8.02 0.00 0.00 7.97 0.00 4.49 8.00 0.00 6.81 0.00
15:1 w5c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 1.13 0.00 0.53 0.00 0.69 0.63 1.48 2.08 0.00 0.00 0.95 0.00 1.02 0.00 1.60 0.00
15:0 细菌 Bacteria in general 3.37 1.82 0.72 0.66 2.32 1.86 2.15 2.33 1.28 2.22 0.67 1.21 2.17 1.15 3.89 0.56
i16:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 7.60 2.92 0.95 0.46 3.36 3.70 5.33 3.13 0.00 4.21 0.00 3.37 3.57 1.14 5.24 0.00
a16:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 1.99 2.62 0.55 1.32 1.46 1.38 2.47 3.49 3.50 5.25 1.89 1.88 2.21 1.49 4.01 2.56
16:1 w9c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 3.44 2.61 1.01 0.00 1.47 1.59 2.97 1.75 0.00 1.52 0.28 1.40 2.84 0.00 4.35 0.00

续表 4
样品编号 Sample number
PLFAs 微生物类型
Type of microbe E-1-O-d E-2-O-d W-1-O-d W-2-N-d W-2-O-d W-3-N-d W-3-O-d S-1-N S-1-O S-3-O N-1-N N-1-O N-2-N-d N-2-O-d N-3-N-d N-3-O-d

16:0 细菌 Bacteria in general 546.73 318.11 151.72 118.00 261.02 293.65 388.72 210.68 134.89 225.04 75.26 201.81 355.29 159.79 510.38 112.42
i15:0 3OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 1.73 0.00 0.00 2.25 2.07 0.00 1.56 1.52 1.51 3.34 1.03 1.86 1.41 1.93 1.44 1.70
10Me 16:0 放线菌 Actinobacteria 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 6.94 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 18.68 0.00
a17:1 w9c
假单胞杆菌
Pseudomonas sp. 25.67 11.42 3.01 0.00 19.96 10.79 13.24 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 19.25 8.23 14.71 0.00
i17:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 5.34 3.61 0.00 0.00 4.51 1.75 4.63 6.30 0.00 0.00 0.00 0.00 4.14 0.00 4.25 0.00
a17:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 28.50 14.34 4.78 2.32 15.77 14.36 15.47 14.57 2.67 13.60 1.55 6.95 16.08 2.83 26.78 1.81
17:1 w8c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 11.00 4.43 1.41 0.81 4.55 2.69 4.37 4.32 0.75 1.27 0.00 1.30 4.63 0.85 7.72 0.56
17:1 w7c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 9.99 2.39 0.34 0.00 0.00 1.24 0.00 1.82 0.00 0.39 0.00 0.00 2.88 0.00 4.62 0.00
17:0 节杆菌 Arthrobacter 21.16 10.64 4.44 1.64 8.00 7.46 10.50 5.51 2.16 5.60 1.11 5.67 10.43 2.43 19.34 1.36
10 Me 17:0 放线菌 Actinobacteria 9.02 2.33 0.00 0.00 2.24 0.50 3.95 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.31 0.00 2.46 0.00
18:3w6c
(6,9,12) 真菌 Fungi 5.55 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.69 0.00 3.76 0.40 0.00 0.22 0.31 2.81 0.50
i18:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 12.17 5.95 1.24 1.28 9.46 2.23 7.10 5.18 1.87 7.01 0.00 1.83 3.27 1.30 8.09 0.00
18:1 w7c 细菌 Bacteria in general 1 255.92 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1 039.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1007.29 0.00
18:1 w5c
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 458.27 410.71 0.00 0.00 714.03 244.18 582.54 490.32 0.00 777.78 0.00 694.90 621.02 0.00 274.33 0.00
18:0
嗜热解氢杆菌
Hydrogenobacter 93.46 58.27 25.12 19.19 47.42 42.57 73.97 41.67 26.23 45.65 14.83 31.94 50.87 32.58 167.82 18.31
11Me18:1 w7c 纤维菌属 Cellulomonas 0.00 118.35 54.82 0.00 0.00 30.63 0.00 0.00 0.00 0.00 165.57 0.00 0.00 0.00 0.00 225.38
17:0 3OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 41.04 0.00 0.00 0.00 26.60 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 225.55 0.00 0.00 0.00
i17:0 3OH
革兰氏阴性菌 G−
Gram-negative bacteria 0.00 0.00 246.32 0.00 0.00 198.83 0.00 0.00 0.00 0.00 374.69 0.00 0.00 0.00 0.00 377.50
a19:0
革兰氏阳性菌 G+
Gram-positive bacteria 0.00 14.21 2.76 0.00 0.00 2.67 16.81 0.00 0.00 0.00 6.11 5.12 4.51 18.99 0.00 0.00
20:4
w6,9,12,15c 原生生物 Protozoa 0.00 0.00 0.00 0.00 18.57 21.80 0.00 3.55 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
20:1 w9c
嗜热解氢杆菌
Hydrogenothermus marinus 0.00 0.31 0.27 0.00 0.00 0.00 0.00 0.18 0.50 1.41 0.00 0.00 0.56 0.43 1.52 0.00
20:0 细菌 Bacteria in general 7.74 5.36 3.01 2.19 28.08 4.39 6.38 4.59 3.11 3.96 1.63 3.89 5.55 3.85 14.75 2.76
表中样品编号与表 3相同; i、a、cy和 Me分别表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸; ω、c和 t分别表示脂肪酸端、顺式空间构造和反式空间构造。Sample numbers in this table is the same to table
3. i, a, cy and Me stands for iso, anteiso, cyclopropyl and methyl branching fatty acids, respectively; ω, c and t stands for the aliphatic end, cis configuration and trans configuration, respectively.

第 7期 郑雪芳等: 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究 939


表 5 不同微生物 PLFAs在柑橘黄龙病植株不同朝向叶片的分布量
Table 5 PLFAs contents of different microbes in different orientated leaves of Huanglongbing-affected
red pomelo plant nmol·g−1
叶片朝向 Orientation of citrus leaves 微生物类型
Type of microbe 东面 East 西面 West 南面 South 北面 North
细菌 Bacteria in general 18 788.00a 737.20b 755.66b 958.83ab
真菌 Fungi 2.78ab 0.00a 1.82a 0.45a
放线菌 Actinobacteria 5.68a 1.51a 0.00a 2.49a
革兰氏阳性菌 Gram-positive bacteria 62.40a 22.90b 37.80ab 25.29b
革兰氏阴性菌 Gram-negative bacteria 530.57a 311.65a 453.49a 514.38a
同行不同字母表示在0.05水平上差异显著, 下同。Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below.



图 3 柑橘黄龙病植株不同朝向叶片真菌与细菌 PLFAs的比值及革兰氏阳性菌(G+)与革兰氏阴性菌(G−)PLFAs的比值
Fig. 3 PLFAs ratios of fungi to bacteria and gram positive bacteria (G+) to gram negative bacteria (G−) in different orientation leaves
of Huanglongbing-affected red pomelo plant

结果表明, 柑橘黄龙病株东、西、南、北 4 个
不同朝向叶片中, 微生物 PLFAs分布量不同。东面
叶片细菌 PLFAs含量最高, 为 18 788 nmol·g−1, 其
次是北面叶片, 西面和南面叶片细菌 PLFAs含量相
当且与东面叶片的细菌 PLFAs含量差异达显著水平
(P<0.05); 指示真菌的 PLFAs 在柑橘黄龙病株东面
叶片分布量最大, 为 2.78 nmol·g−1, 其次是南面叶
片, 为 1.82 nmol·g−1, 北面叶片分布量为 0.45 nmol·g−1,
在西面叶片中没有分布 ; 与真菌的分布规律不同 ,
放线菌 PLFAs在东面分布量最大, 北面次之, 在南
面没有分布。G+菌 PLFAs 在柑橘黄龙病株不同朝
向叶片分布量差异显著, 东面叶片分布量最大, 为
62.40 nmol·g−1, 南面分布量次之, 西面和北面分布
量相当, 分别为 22.90 nmol·g−1和 25.29 nmol·g−1, G−
菌 PLFAs 在柑橘黄龙病株不同朝向分布量差异不
显著。
真菌 /细菌的比值可反映真菌和细菌相对含量
的变化范围[17]和2个种群的相对丰富程度[29]。Kieft
等[30]认为, G+菌对恶劣环境条件适应能力极强, 而
G−菌适应力较差, 受底物供应水平影响显著; Mar-
schner等 [31]也认为G+菌的竞争力显著强于G−菌, 使
G+菌在适当水热、养分条件下能比G−菌更为迅速地
攫取有限养分并快速繁殖。
对柑橘黄龙病株东、西、南、北 4 个朝向叶片
真菌/细菌和 G+/G−之 PLFAs比值作图(图 3)。由图 3
可看出, 柑橘黄龙病株不同朝向叶片真菌/细菌值存
在一定差异, 南面叶片真菌/细菌值最大, 东面叶片
和北面叶片真菌/细菌值居中, 西面叶片最低。柑橘
黄龙病株不同朝向叶片 G+/G−值大小为东面>南面>
西面>北面。
2.3.2 不同高度叶片的比较
柑橘黄龙病株上、中、下不同高度叶片中细菌、
真菌、放线菌、G+菌、G−菌的 PLFAs含量及真菌与
细菌、G+菌与 G−菌的 PLFAs比值见表 6和图 4。结果
表明, 柑橘黄龙病株不同高度叶片 PLFAs 的组成及含
量存在一定差异, 但均不显著; 其中, 真菌 PLFAs 含
量大小为: 上部(1.49 nmol·g−1)≈下部(1.41 nmol·g−1)>
中部(0.11 nmol·g−1), 细菌、放线菌的 PLFAs含量为
下部叶片最大, 上部叶片次之, 中部叶片最低。G+
菌和 G−菌的 PLFAs 含量在下部叶片分布量最大(分
别为 41.23 nmol·g−1和 524.02 nmol·g−1), 其次是中部
叶片(分别为 35.66 nmol·g−1和 454.08 nmol·g−1), 在
上部叶片分布量最低 (分别为 35.60 nmol·g−1 和
390.43 nmol·g−1)(表 6)。
940 中国生态农业学报 2012 第 20卷


G+菌和 G−菌的 PLFAs 比值在柑橘黄龙病株不
同高度叶片的分布表现为上部最大(0.091), 中部和
下部相同(0.079)。真菌和细菌的 PLFAs 比值为: 上
部(0.001 45)>下部(0.000 97)>中部(0.000 13)。
2.3.3 不同健康状态叶片比较
柑橘黄龙病株不同健康状态叶片的磷脂脂肪酸
组成及含量不同(表 7), 但它们之间的差异均未达到显
著水平。含有黄龙病原叶片的细菌(1 159.63 nmol·g−1)、
真菌 (1.22 nmol·g−1)、放线菌(3.30 nmol·g−1)、G+菌
(37.46 nmol·g−1)PLFAs含量均大于健康叶片(分别为
794.48 nmol·g−1、1.17 nmol·g−1、0和 30.73 nmol·g−1)。
而健康叶片的 G−菌 PLFAs 含量(496.51 nmol·g−1)及
真菌 /细菌值 (0.001 5)均高于黄龙病叶片 (分别为
376.44 nmol·g−1和 0.001 1)。
2.4 柑橘植株不同部位叶片内生菌 PLFAs 多样性指
数分析
分别以不同朝向、不同高度及健康状态叶片内生
菌 PLFAs 作为处理因子, 以 Simpson 指数、Shannon
指数、均匀度(Pielou)指数分析柑橘黄龙病株不同部位
叶片内生菌种群的多样性, 结果如表 8 所示。柑橘黄
龙病株不同朝向和不同健康状态的叶片内生菌种群多
样性指数差异显著, 不同高度的叶片内生菌种群多样
性指数差异不显著。其中, 东面和西面叶片内生菌种
群的多样性指数相当, 南面和北面叶片内生菌种群的
多样性指数相当, 带有黄龙病原叶片内生菌种群的
Simpson指数(0.71)、Shannon指数(2.46)和均匀度指数
(0.50)均大于健康叶片的内生菌种群(分别为 0.56、1.94
和 0.41), 且差异达极显著水平(P<0.01)。

表 6 不同微生物 PLFAs在柑橘黄龙病植株不同高度叶片分布量
Table 6 PLFAs contents of different microbes in different heights leaves of Huanglongbing-affected red pomelo plant nmol·g−1
叶片部位 Position of citrus leaves 微生物类型
Type of microbe 上部 Upper part 中部 Middle part 下部 Lower part
细菌 Bacteria in general 1 025.11a 859.23a 1 457.02a
真菌 Fungi 1.49a 0.11a 1.41a
放线菌 Actinobacteria 1.80a 1.18a 6.51a
革兰氏阳性菌 Gram-positive bacteria 35.60a 35.66a 41.23a
革兰氏阴性菌 Gram-negative bacteria 390.43a 454.08a 524.02a



图 4 柑橘黄龙病植株不同高度叶片真菌与细菌及革兰氏阳性菌(G+)与革兰氏阴性菌(G−)的 PLFAs比值
Fig. 4 PLFAs ratios of fungi to bacteria and gram positive bacteria (G+) to gram negative bacteria (G−) in different height leaves of
Huanglongbing-affected red pomelo plant

表 7 不同微生物 PLFAs在柑橘黄龙病植株不同健康状态叶片分布量
Table 7 PLFAs contents of different microbes in different healthy states leaves of Huanglongbing-affected red pomelo plant
微生物类型
Type of microbe
健康叶片
Healthy leaves
携带有黄龙病原叶片
Leaves with Huanglongbing pathogen
细菌 Bacteria in general (nmol·g−1) 794.48a 1 159.63a
真菌 Fungi (nmol·g−1) 1.17a 1.22a
放线菌 Actinobacteria (nmol·g−1) 0.00a 3.30a
革兰氏阳性菌(G+) Gram-positive bacteria (nmol·g−1) 30.73a 37.46a
革兰氏阴性菌(G−) Gram-negative bacteria (nmol·g−1) 496.51a 376.44a
真菌/细菌 Fungi/bacteria 0.001 5a 0.001 1a
G+/G− 0.061 9 a 0.0996a
第 7期 郑雪芳等: 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究 941


2.5 柑橘植株不同部位叶片内生菌 PLFAs 主成分
分析
经主成分分析(PCA)得出(图 5), 主成分 1(PC1)
的贡献率为 63.98%, 主成分 2(PC2)的贡献率为
19.01%, 二者的累计贡献率达 82.99%。主成分 1和
主成分 2 基本上能把柑橘黄龙病株不同朝向叶片内
生菌种群区分开来。东面叶片内生菌种群结构与主
成分 1 表现出高度正相关, 南面叶片内生菌种群结
构与主成分 2 表现高度正相关, 西面叶片内生菌种
群结构在主成分 1 和主成分 2 的坐标零点附近, 说
明西面叶片内生菌种群结构与两个主成分的相关性
不大。而北面叶片内生菌种群结构与主成分 1 和主
成分 2均表现出负相关。
通过每种 PLFA在主成分上的因子载荷分析结果
表明(图 6), 大部分 PLFAs如 i12:0、a13:0、i11:0 3OH
等都集中在主成分 1 和主成分 2 上的载荷值较小区

表 8 柑橘黄龙病植株不同部位叶片植物内生菌种群多样性指数
Table 8 Diversity indexes of endophytic microbial community in different positions and healthy status leaves of
Huanglongbing-affected red pomelo plant
朝向 Orientation 高度 Height 健康状态 Healthy status
多样性指数
Diversity index 东面
East
西面
West
南面
South
北面
North
上部
Upper part
中部
Middle part
下部
Lower part
健康
Health
病
Sick
Simpson 0.75a 0.68ab 0.56b 0.61b 1.63c 0.70c 0.69c 0.56d 0.71e
Shannon 2.71a 2.32ab 2.03b 2.00b 2.17c 2.49c 2.30c 1.94d 2.46e
Pielou 0.53a 0.49a 0.42b 0.42b 0.45c 0.51c 0.46c 0.41d 0.50e



图 5 柑橘黄龙病植株不同部位叶片内生菌种群 PLFAs图谱主成分分析
Fig. 5 PCA of PLFAs pattern in different positions leaves of Huanglongbing-affected red pomelo plant



图 6 柑橘黄龙病植株不同部位叶片单个 PLFA载荷值
Fig. 6 PCA of loading values for individual PLFA in different positions leaves of Huanglongbing-affected red pomelo plant

942 中国生态农业学报 2012 第 20卷


域, 表明这些 PLFAs 生物标记在柑橘黄龙病植株不
同部位叶片分布量均较小。指示细菌的 PLFA 16:00
在主成分 1 和主成分 2 载荷值均较高, 说明该标记
在柑橘黄龙病株不同部位叶片均有较大量分布。指示
G−菌的 PLFA生物标记 18:1 w5c在主成分 1上的载荷
值较高, 主成分 1 是它的代表因子。指示 G−菌的
PLFA生物标记 i17:0 3OH在主成分 2上有较高的载
荷值, 而在主成分 1 上的载荷值较低, 说明主成分 2
是 i17:0 3OH的代表因子。指示细菌 PLFA 18:1 w7c
在主成分 1上载荷值为正值, 在主成分 2上的载荷值
为负值, 说明 PLFA 18:1 w7c在柑橘黄龙病不同部位
叶片分布量差异较大, 在某些空间叶片分布量较大,
而另一些空间分布量较小或没有分布。
2.6 基于磷脂脂肪酸生物标记的柑橘黄龙病植株
不同部位叶片聚类分析
柑橘黄龙病株不同部位叶片聚类如图 7所示, 当
兰氏距离为 151.75 时, 可将柑橘黄龙病株不同部位
叶片聚为 3类, 类群Ⅰ基本特征是均为带有黄龙病原
的不同部位的叶片, 类群Ⅱ均为植株南面的叶片, 包
含南面上部和下部新梢的叶片和南面中部老梢的叶
片, 类群Ⅲ包含柑橘西面上部和下部的老梢叶片及
南面下部老梢叶片; 当兰氏距离为 102.13时, 可将类
群 I携带黄龙病原的叶片细分为 2个亚类群。亚类群
I 均为植株东面携带黄龙病原叶片, 包含东面上部和
中部老梢叶片, 亚类群Ⅱ均为植株西面携带黄龙病
原的叶片, 包含西面上部老梢叶片、西面中部老梢和
新梢叶片及西面下部新梢叶片。由此可见, 柑橘黄龙
病株内生菌 PLFAs 分布与叶片健康状态和叶片朝向



图 7 基于 PLFAs生物标记的柑橘黄龙病植株
不同部位叶片聚类分析
Fig. 7 Cluster analysis of leaves in different positions of
Huanglongbing-affected red pomelo plant based on PLFAs
均有紧密关系, 与叶片健康状态关系更为密切。
3 讨论
柑橘黄龙病是由韧皮部杆菌(Candidatus Liberi-
bacter asiaticus)引起, 本研究采用巢式 PCR 对柑橘
黄龙病株不同部位叶片进行黄龙病原检测, 结果表
明, 柑橘植株中南面叶片受黄龙病原侵染程度最轻,
从东、西、南、北 4 个方向叶片的黄龙病原检测得
知, 只有南面叶片不同高度的叶片和北面叶片上部
叶片没有检测到黄龙病原外, 其余样品均检测到带
有黄龙病原。其原因有待进一步研究。
前人研究表明[32−33], 植物体中存在的内生菌的
数量、种类与植物的种类、生存环境、生长阶段、
营养供给有密切关系。本研究发现, 柑橘黄龙病株
不同部位及健康状态叶片内生菌种群结构不同。朝
向对柑橘黄龙病株的内生菌种群结构影响最大, 不
同朝向柑橘黄龙病株叶片内生菌 PLFAs含量差异显
著, 而不同高度和不同健康状态的柑橘黄龙病株叶
片内生菌 PLFAs 含量存在一定的差异, 但差异不显
著。总体来看, 不同朝向中, 东面叶片内生菌 PLFAs
含量最大; 不同高度中, 下部叶片内生菌 PLFAs 含
量最大; 不同健康状态中, 带有黄龙病原叶片内生
菌 PLFAs含量比健康植株叶片更大。柑橘黄龙病植
株不同部位及健康状态叶片内生菌种群结构的差异
可能与不同部位及健康状态叶片的微生境不同有
关。东、西、南、北不同朝向叶片及上、中、下不同
高度叶片在受日照强度、日照时间及通气状况方面有
明显差异(南面日照时间最长, 西面日照强度最大),
从而导致其叶片内生菌生长环境不同, 故而其种类
和数量存在一定差异。Fan等[34]也认为植物不同部位
的微环境如通气状况、酶和其他化学成分不同会导致
其内生菌分布的差异。本研究发现带有黄龙病原叶片
内生菌 PLFAs 含量比健康植株叶片大, 表明带有黄
龙病原叶片内生菌种类和数目较健康植株多, 该结
果与王爱华等[35]的研究结论相吻合, 他们在研究柑
橘黄龙病植株韧皮部内生菌多样性时发现, 病叶中
内生细菌的丰富度大于健康叶, 认为可能与木虱取
食时将其自身携带的病原菌或内生细菌传给柑橘有
关。Araújo等[36]的研究也表明, 在被黄龙病原菌侵染
但不表现症状的柑橘植株中, 内生细菌数量比健康
植株高。而 Spiering 等[37]对黑麦草植株内生菌的研
究却表明, 健康植株的内生菌种类和数目比受到胁
迫条件下的植株中内生菌的种类、数目都多, 原因
可能是木本植物和草本植物内生环境不同, 其内生
菌种群在应对外界压力所表现的应答能力也不同。
生物体中真菌和细菌的比值、G+/G−比值通常被
第 7期 郑雪芳等: 柑橘黄龙病植株内生菌 PLFAs多态性研究 943


作为评价生态系统自我调控能力大小的重要指示[38]。
本研究中柑橘黄龙病株不同部位及健康状态叶片真
菌和细菌 PLFAs含量的比值在 0~0.002 1之间变动,
G+/G−比值在 0.049~0.118 之间变动。其中不同朝向
叶片中, 南面叶片真菌/细菌值最大, 其 G+/G−比值
也较大, 仅次东面; 不同高度的叶片中, 真菌/细菌
值差异不明显 , G+/G−比值为上部最大 , 下部次之 ,
中部最小; 不同健康状态中, 健康叶片的真菌/细菌
值高于黄龙病叶片, 但其 G+/G−比值小于黄龙病叶
片。由于本试验采集柑橘黄龙病株南面叶片经检测
均为健康叶片, 综上得出的结论是, 从不同朝向和
不同健康状态两个方面来分析柑橘黄龙病株不同部
位叶片的真菌/细菌值的结论相吻合, 即健康叶片的
真菌/细菌值高于黄龙病叶片, 表明健康叶片比带有
黄龙病原叶片的内生生态系统的自我调控能力更强,
也印证了 Bardgett和 McAlister[38]的结论。
参考文献
[1] Tian Y N, Ke S, Ke C. Detection and quantitation of citrus
Huanglongbing pathogen by polymerase chain reaction[J].
Acta Phytopathologica Sinica, 1996, 26: 243–250
[2] 范国成, 刘波, 吴如健, 等. 中国柑橘黄龙病研究 30 年[J].
福建农业学报, 2009, 24(2): 183–190
[3] 邹敏 , 周常勇 . 柑桔黄龙病病原和检测方法研究进展 [J].
植物保护, 2005, 31(3): 10–14
[4] 郭文武 , 邓秀新 . 柑桔黄龙病及其抗性育种研究[J]. 农业
生物技术学报, 1998, 6(1): 37–41
[5] 孙庆科 , 丁爱云 . 内生细菌作为生防因子的研究进展 [J].
山东农业大学学报: 自然科学版, 2001, 32(2): 256–260
[6] 杨海莲 , 孙晓璐 , 宋未 . 植物根际促生细菌和内生细菌的
诱导抗病性的研究进展 [J]. 植物病理学报 , 2000, 30(2):
106–109
[7] Easton H S, Latch G C M, Tapper B A, et al. Ryegrass host
genetic control of concentrations of endophyte-derived alka-
loids[J]. Crop Science, 2002, 42(1): 51–57
[8] 张国赏, 吴文鹃, 潘仁瑞. 气相色谱−质谱法检测细胞脂肪
酸及其在细菌鉴定上的应用[J]. 合肥联合大学学报, 2000,
10(4): 92–96
[9] Saetre P, Bååth E. Spatial variation and patterns of soil mi-
crobial community structure in a mixed spruce-birch stand[J].
Soil Biology and Biochemistry, 2000, 32(7): 909–917
[10] Felix P Jr, Mahasin T. Phospholipid fatty acids in forest soil
four years after organic matter removal and soil compac-
tion[J]. Applied Soil Ecology, 2002, 19(2): 173–182
[11] Hesselsoe M, Boysen S, Iversen N, et al. Degradation of or-
ganic pollutants by methane grown microbial consortia[J].
Biodegradation, 2005, 16(5): 435–448
[12] Wilke B M, Gattinger A, Fröhlich E, et al. Phospholipid fatty
acid composition of a 2,4,6-trinitrotolune contaminated soil
and an uncontaminated soil as affected by a humification
remediation process[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2004,
36(4): 725–729
[13] Bodelier P L E, Roslev P, Henckel T, et al. Stimulation by
ammonium-based fertilizers of methane oxidation in soil
around rice roots[J]. Nature, 2000, 403(6768): 421–424
[14] 胡浩, 殷幼平, 张利平, 等. 柑桔黄龙病的常规 PCR 及荧
光定量 PCR 检测 [J]. 中国农业科学 , 2006, 39(12):
2491–2497
[15] 齐鸿雁 , 薛凯 , 张洪勋 . 磷脂脂肪酸谱图分析方法及其在
微生物生态学领域的应用 [J]. 生态学报 , 2003, 23(8):
1576–1582
[16] 卜洪震, 王丽宏, 肖小平, 等. 双季稻区稻田不同土壤类型
的微生物群落多样性分析 [J]. 作物学报 , 2010, 36(5):
826–832
[17] Frostegård Å, Tunlid A, Bååth E. Phospholipid fatty acid
composition, biomass, and activity of microbial communities
from two soil types experimentally exposed to different heavy
metals[J]. Applied and Environment Microbiology, 1993,
59(11): 3605–3617
[18] O’Leary W M, Wilkinson S G. Gram-positive bacteria[M].
London: Academic Press, 1988
[19] Zogg G P, Zak D R, Ringleberg D B, et al. Compositional and
functional shifts in microbial communites due to soil warm-
ing[J]. Soil Science Society of America Journal, 1997, 61(2):
475–481
[20] Steinberger Y, Zelles L, Bai Q Y, et al. Phospholipid fatty acid
profiles as indicators for the microbial community structure in
soils along a climatic transect in the Judean Desert[J]. Biol-
ogy and Fertility of Soils, 1999, 28(3): 292–300
[21] Ratledge C, Wilkinson S G. Microbial Lipids[M]. London:
Academic Press, 1988
[22] White D C, Stair J O, Ringelberg D B. Quantitative compari-
sons of in situ microbial biodiversity by signature biomarker
analysis[J]. Journal of Industry Microbiology, 1996, 17(3/4):
185–196
[23] Zelles L. Identification of single cultured micro-organisms
based on their whole-community fatty acid profiles, using an
extended extraction procedure[J]. Chemosphere, 1999, 39(4):
665–682
[24] Garland J L, Mills A L. Classification and characterization of
heterotrophic microbial communities on the basis of patterns
of community-level sole-carbon-source utilization[J]. Applied
and Environment Microbiology, 1991, 57(8): 2351–2359
[25] 裴鑫德. 多元统计分析及其应用[M]. 北京: 北京农业大学
出版社, 1991
[26] 宇传华 . SPSS 与统计分析 [M]. 北京 : 电子工业出版社 ,
2007
[27] Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopoly-
saccharides in the characterisation of microbial communities
in soil: a review[J]. Biology and Fertility of Soils, 1999, 29(2):
111–129
[28] Zelles L, Bai Q Y, Beck T, et al. Signature fatty acids in
phospholipids and lipopolysaccharides as indicators of mi-
crobial biomass and community structure in agricultural
soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1992, 24(4): 317–323
[29] Federle T W. Microbial distribution in the soil-new tech-
niques[M]//Perspective in Microbial ecology. Ljubljana: Slo-
vene Society for Microbiology, 1986: 493–498
[30] Kieft T L, Ringelberg D B, White D C. Changes in es-
ter-linked PLFA profiles of subsurface bacteria during starva-
tion and desiccation in a porous medium[J]. Applied and En-
vironmental Microbiology, 1994, 60(9): 3292–3299
[31] Marschner P, Kandeler E, Marschner B. Structure and func-
944 中国生态农业学报 2012 第 20卷


tion of the soil microbial community in a long-term fertilizer
experiment[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2003, 35(3):
453–461
[32] 孙剑秋, 郭良栋, 藏威, 等. 药用植物内生真菌多样性及生
态分布[J]. 中国科学 C辑: 生命科学, 2008, 38(5): 475–484
[33] Kumar D S, Hyde K D. Biodiversity and tissue-recurrence of
endophytic fungi in Tripterygium wilfordii[J]. Fungal Divers,
2004, 17: 69–90
[34] Fan Y B, Chen Y, Liu M S, et al. Study on the population di-
versities of endophytic fungus in Ginkgo biloba L.[J]. Journal
of Anhui Agricultural Sciences, 2007, 35(4): 10953–10954
[35] 王爱华, 殷幼平, 熊红利, 等. 广西柑橘黄龙病植株韧皮部
内生细菌多样性分析 [J]. 中国农业科学 , 2010, 43(23):
4823–4833
[36] Araújo W L, Marcon J, Maccheroni W Jr, et al. Diversity of
endophytic bacterial populations and their interaction with
Xylella fastidiosa in citrus plants[J]. Applied and Environ-
mental Microbiology, 2002, 68(10): 4906–4914
[37] Spiering M J, Lane G A, Christensen M J, et al. Distribution
of the fungal endophyte Neotyphodium lolii is not a major
determinant of the distribution of fungal alkaloids in Lolium
perenne plants[J]. Phytochemistry, 2005, 66(2): 195–202
[38] Bardett R D, McAlister E. The measurement of soil fungal:
bacterial biomass ratios as an indicator of ecosystem
self-regulation in temperate meadow grasslands[J]. Biology
and Fertility of Soils, 1999, 29(3): 282–290

JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ
“百人计划”招聘启事

中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心(以下简称中心)面向国家水安全、粮食安全、生态环境安
全的重大战略需求和农业资源与生态学前沿领域开展应用基础研究。根据中心科研布局与学科发展的需要, 现诚聘海内
外杰出人才若干名。
一、招聘研究领域
交叉前沿、农业水资源可持续利用及品种选育、区域与农田水循环、农田面源污染、生态系统过程及管理、农业
生物技术、农业信息与节水等相关领域的应用基础研究。
二、招聘条件
1. 具有中国国籍的公民或自愿放弃外国国籍来华或回国定居的专家学者, 年龄一般不超过 45周岁, 身体健康;
2. 恪守科学道德, 学风正派、诚实守信、严谨治学、尊重他人, 具有团队合作精神, 并对所招聘的研究领域有浓
厚研究兴趣和艰苦创业的奉献精神;
3. 具有博士学位且在相关研究领域有连续 3年以上在海外科研工作经历、在国外获得相应职位, 或在国内本学科
领域已取得有影响的科研成果且获得研究员(教授)职位;
4. 独立主持或作为主要骨干参与过课题(项目)研究的全过程并做出显著成绩;
5. 在本学科领域有较深的学术造诣, 做出过具有国际水平的研究成果, 在重要核心刊物上发表过 3篇及以上有影响的学
术论文并被引用(第一作者或通讯作者), 或掌握关键技术、拥有重大发明专利等, 其研究水平足以担当我中心的学术带头人;
6. 在国内外学术界有一定的影响, 能把握本学科领域的发展方向, 具有长远的战略构思, 能带领一支队伍在国际
科学前沿从事研究并做出具有国际水平的创新成果。
三、岗位及待遇
1. 聘为研究员(全职)、研究组组长、研究生导师;
2. 入选“百人计划”后由中国科学院提供科研经费 200万元人民币;
3. 研究中心提供每年 30万元人民币的研究组研究经费;
4. 研究中心创新领域前沿研究课题 1项, 经费 50万元人民币;
5. 依据科研工作需要提供 100 m2 的科研用房(待新科研大楼建成后再行改善), 以及所需的相关设施与试验用地,
并配备选聘的科研助手;
6. 基本年薪 20万元人民币加研究生导师津贴, 绩效奖励根据业绩发放;
7. 购房补贴 90万元人民币;
8. 10万元人民币的安家费;
9. 享有中心其他的良好福利待遇;
10. 协助安置配偶就业和子女就学, 随迁配偶在暂未落实工作期间, 可享受引进人才配偶生活补贴 1000 元/月, 发
放时间不超过 12个月。
四、应聘材料
1. 填写《中国科学院“百人计划”候选人推荐(自荐)表》;
2. 相关证明材料复印件(已取得的重要科研成果证明、国内外任职情况证明、最高学位证书、身体健康状况证明等);
3. 发表论文目录及代表性论文 3篇(全文, 复印件);
4. 2位教授级国内外同行的推荐信函;
5. 本人认为有必要提供的其他相关材料。
五、联系方式
有意者请将本人应聘材料电子文档发至以下联络方式(请在邮件主题上注明: 姓名+百人计划+研究领域或方向):
联系人: 韩一波
电 话: 86-311-85871740 传 真: 86-311-85815093
E-mail: ybhan@genetics.ac.cn 网 址: www.sjziam.ac.cn