全 文 ：中国生态农业学报 2012年 12月 第 20卷 第 12期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Dec. 2012, 20(12): 1636−1642


* 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA10Z404)和安徽科技学院预研项目(ZRC2012311)资助
段海明(1982—), 男, 博士, 讲师, 主要从事农药毒理与应用技术研究。E-mail: heminges88@163.com
收稿日期: 2012−07−15 接受日期: 2012−09−19
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.01636
海藻酸钠固定化细菌对毒死蜱的降解特性*
段海明 1,2
(1. 山东农业大学植物保护学院 泰安 271018; 2. 安徽科技学院植物科学学院 凤阳 233100)
摘 要 毒死蜱的生产和使用日趋广泛, 由其造成的环境污染和危害不容忽视。微生物是影响有机磷农药在
环境中降解的最主要因素, 也被认为是降解有机磷农药最可靠而高效的途径。固定化技术是提高微生物降解
农药效率的有效方法之一。本研究以海藻酸钠为载体 , 采用注射器滴定法将蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cer-
eus)HY-1用海藻酸钠溶胶包埋, 研究了反应时间、固定化菌接入量、pH和毒死蜱初始浓度对毒死蜱降解的影
响以及固定化菌的重复使用效果。结果表明: 海藻酸钠固定化菌能够高效降解基础培养基中的毒死蜱, 制备固
定化小球海藻酸钠溶胶的最适浓度为 2.5%(w/v), 小球的平均粒径为 3 mm。在培养时间为 60 h时, 固定化菌
对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率达到最大。固定化小球接入量为 160 g·L−1时, 对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率最
高。固定化菌对毒死蜱的降解有着较宽泛的 pH适应范围, 碱性环境更有利于其对毒死蜱的有效降解。当毒死
蜱初始浓度为 80 mg·L−1和 100 mg·L−1时, 固定化菌对毒死蜱的降解率较高, 达 90%左右。固定化菌可重复利
用降解毒死蜱, 当利用 4次后, 固定化小球虽已发生崩解, 但对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率仍高达 47%。因此,
海藻酸钠固定化蜡状芽孢杆菌对水体中毒死蜱的降解率较高, 环境适应性较强, 固定化菌可在毒死蜱污染的
净化去毒方面发挥重要作用。
关键词 毒死蜱 生物降解 海藻酸钠 固定化细菌
中图分类号: X172 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)12-1636-07
Biodegradation characteristics of chlorpyrifos by sodium alginate
immobilized bacteria
DUAN Hai-Ming1,2
(1. College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China;
2. College of Plant Sciences, Anhui University of Science and Technology, Fengyang 233100, China)
Abstract Chlorpyrifos [(O,O-diethyl-O-3,5,6-trichloro-2-pyridinyl) phosphorothioate] is a broad spectrum of moderately toxic
organophosphorus pesticide used as insecticide on a large variety of crops including fruits, vegetables, cotton, corn and wheat. With
especially the recent elimination of five highly toxic organophosphorus pesticides, chlorpyrifos has been widely used in China.
Consequently, large quantities of wastewater containing chlorpyrifos have been generated from pesticide industry and lot more
chlorpyrifos scattered in the depths of soils and waters in the fields. Moreover, various reports have noted that chlorpyrifos have had
visible toxicity in mammalians. Therefore the high degree of persistence of chlorpyrifos in the environment and the toxic effects on
humans had necessitated removal. Biodegradation has received increasing attention as an efficient and cheap biotechnological
approach to cleaning up polluted environments. Several chemicals have been successfully removed from soil and aquatic
environments using degrading microbes. Similarly, biodegradation has been the major mechanism for removing chlorpyrifos residues,
especially for treatments of discharged wastewater from the processes of chlorpyrifos production. Previous successes in isolating
Bacillus cereus strain from chlorpyrifos degradation have augmented scarce literatures on this strain of chlorpyrifos biodegradation.
In order to enhance degradation efficiency, B. cereus HY-1 strain was immobilized with sodium alginate using the syringe titration
method. Also biodegradation characteristics of chlorpyrifos by immobilized B. cereus strain were further investigated. While the
optimal reaction time was obtained, the effects of the various parameters (e.g., amounts of immobilized biomass, pH and chlorpyrifos
initial concentration) of biodegradation were studied. The results showed that chlorpyrifos were readily degraded by sodium alginate
第 12期 段海明: 海藻酸钠固定化细菌对毒死蜱的降解特性 1637


immobilized B.cereus. The appropriate concentration of sodium alginate was 2.5% (w/v), with an average particle diameter of 3 mm.
The appropriate incubation time was 60 h, with maximum degradation rate of 100 mg·L−1 chlorpyrifos. No significant increase was
noted in chlorpyrifos degradation rate with increasing reaction time. Chlorpyrifos degradation efficiency was highest when
immobilized biomass was 160 g·L−1. Under ensured degradation efficiency condition, immobilized bacteria amount dropped, which
also reduced production costs. Immobilized strains were broadly adaptable to a wide range of pH, with more conducive alkaline
conditions for chlorpyrifos degradation. Compared with high initial chlorpyrifos concentrations, degradation rates at low initial
chlorpyrifos concentrations (80 mg·L−1 and 100 mg·L−1) were higher. Chlorpyrifos degradation rate reached 90% at 100 mg·L−1. But
with increasing concentration, chlorpyrifos degradation rate declined. This showed that immobilized bacteria tolerance to
chlorpyrifos concentration was within a certain limit. Immobilized bacteria were reusable in chlorpyrifos degradation processes. With
repeated use (4 times) of immobilized bacteria, though immobilized bacteria disintegrated, the degradation rate at 100 mg·L−1 of
chlorpyrifos was up to 47%. Therefore immobilized strains showed high application values in removing chlorpyrifos residue with
wide environmental adaptability ranges.
Key words Chlorpyrifos, Biodegradation, Sodium alginate, Immobilized bacteria
(Received Jul. 15, 2012; accepted Sep. 19, 2012)
毒死蜱(chlorpyrifos)是由美国陶氏益农公司开
发的一种高效、广谱、中等毒性的有机磷酸酯类杀
虫杀螨剂, 随着我国 5 种高毒农药的禁用, 毒死蜱
的使用范围越来越广, 用量也越来越大, 现已发展
成为大吨位骨干品种, 在环境中的残留也势必会逐
渐增多[1]。但是, 毒死蜱作为一种异源有毒物质, 再
加上其较高的土壤吸附性和水体中较长的半衰期 ,
其对环境造成的可能污染不容忽视。2000 年, 美国
环境保护局(U.S. Environmental Protection Agency,
EPA)宣布禁止在美国家庭和庭院内使用毒死蜱, 并
减少在其他方面的应用, 指出毒死蜱可能对人的神经
系统和脑部发育有潜在影响, 对儿童健康有害[2−3]。
利用微生物降解法消除有机物污染具有其他方
法所无可比拟的优点 [4], 筛选到降解菌后如何进一
步提高菌株的降解效率也同样成为研究的热点, 如
创造良好的外部环境、菌株固定化及污染物的分流
治理等[5]。固定化微生物技术是将微生物固定在载
体上使其高度密集并保持生物活性的一项技术。由
于固定化降解菌具有细胞密度大、使用周期长、抗
不良环境能力强和降解效率高等优点, 这项技术在
有毒废水生物处理中受到特别重视 [6]。海藻酸钠
(sodium alginate, SA)是由 β-D-甘露糖醛酸和 α-L-葡
萄糖醛酸通过 1-4 糖苷链连结而成的线状共聚物。
SA水溶液是一种电荷密度很高的聚电解质, 在二价
阳离子的作用下可以发生溶胶–凝胶转变 , 已在众
多领域被广泛使用, 并显示出良好的应用前景[7]。固
定化微生物具有多种手段, 其中包埋法的综合性能
较好, 用包埋法制得的固定化细胞可以达到较高的
细胞浓度, 且此法操作条件温和、固化和成形方便
及对微生物毒性小, 催化活性保留和存活率都比较
高。因此, 包埋法成为整个固定化生物催化技术中
应用最广泛的方法[8]。
国内外已有许多关于固定化菌株降解多种污染
物的报道 [9−10], 闫艳春等 [11]采用海藻酸钠固定化基
因工程菌, 使其对对硫磷的降解效率得到了较大提
高 ; 李颖等 [12]采用聚乙烯醇固定化藤黄微球菌
(Micrococcus luteus)AD3 研究表明, 固定化菌在低
温、低 pH和高阿特拉津浓度条件下对阿特拉津的降
解率以及储存和操作稳定性都明显好于游离化菌 ;
Parameswarappa 等[13]研究发现通过用海藻酸盐、琼
脂和聚丙烯酰胺固定化荧光假单胞菌(Pseudomonas
fluorescens)CS2, 可以显著加快其对乙苯的降解, 菌
株经聚丙烯酰胺和海藻酸盐固定化后可稳定降解乙
苯达 42 d。但是本研究的对象蜡状芽孢杆菌为本实
验室自主筛选获得的毒死蜱降解新菌株, 目前国内
外针对该菌株的固定化以及固定化菌对毒死蜱的降
解特性研究还鲜见报道。因此, 深入研究该降解菌
的固定化及其降解特性, 将会对降解菌的实际开发
应用起到重要推动作用。
本研究旨在阐明海藻酸钠溶胶包埋蜡状芽孢杆
菌对毒死蜱的降解和固定化菌重复使用的特性, 以
期为以海藻酸钠为载体固定化微生物技术的研究与
毒死蜱污染环境的治理奠定一定基础, 为经济安全
的治理毒死蜱环境污染提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1,
在 Genbank上的注册登录号为 eu915687。供试培养
基主要有普通培养基、基础培养基和发酵培养基 ,
各培养基的配制参照参考文献[14]。
供试已知纯度为 95.9%的毒死蜱原药购于山东
华阳农药化工集团有限公司, 配成 48%毒死蜱乳油
储存于 4 ℃冰箱备用; 海藻酸钠(化学纯)购于上海
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华蓝化学有限公司, 根据试验所需配成不同浓度的
海藻酸钠溶液后, 高压灭菌备用; 无水氯化钙(分析
纯)购于天津凯通化学试剂有限公司, 用去离子水配
成 2%的氯化钙溶液, 用作固定化小球的成型剂; 石
油醚(分析纯)购于天津凯通化学试剂有限公司。其他
试剂均为国产分析纯。
1.2 降解菌的培养和固定化小球的制备
1.2.1 降解菌的培养和菌体的制备
无菌条件下将菌株 HY-1 接种到普通培养基平
板上, 在 33 ℃下培养 72 h。取 2接菌环于 100 mL
发酵培养基中, 于 33 ℃、170 r·min−1下摇培 18 h,
将培养好的菌体利用低温冷冻离心机在 15 ℃、
8 000 r·min−1下离心 10 min, 收集菌体, 在 pH为 6.8
的 0.04 mol·L−1磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)中
洗涤 3次后离心获取菌体备用。
1.2.2 固定化小球的制备
将海藻酸钠的质量浓度(w/v)设为 1.5%、2.0%、
2.5%、3.0%、3.5%和 4.0%。配制好各种浓度的海藻
酸钠溶液在 121 ℃下灭菌 15 min, 冷却至室温后把
配好的菌悬液[1 g湿菌体加入到 4 mL 0.85%(w/v)的
灭菌生理盐水中]加入到 20 mL不同浓度的海藻酸钠
溶胶中, 充分搅拌混匀后, 用容积为 20 mL 规格的
玻璃注射器滴入到 2%(w/v)的氯化钙溶液中造粒。造
粒完毕后, 固定化小球继续在上述氯化钙溶液中于
4 ℃冰箱中固定化 4 h。最后用 0.85%的灭菌生理盐
水洗涤、过滤。在无菌滤纸上滤干后, 于 4 ℃储存
备用[15]。
1.2.3 固定化小球的物理性能测试
固定化小球的机械强度和传质性能测定参照参
考文献[16]进行。
固定化小球的直径测定: 采用 4 种规格型号的
医用一次性注射器针头(内径分别为 0.45 mm、0.5
mm、0.6 mm和 0.7 mm)进行试验。通过机械强度和
传质性能测定并结合固定化造粒的难易程度确定最
佳粒径。当确定好适合型号的针头造粒后, 用螺旋
测微器测定小球的直径。
1.3 固定化小球对毒死蜱的降解试验
在大试管(18 mm×180 mm)中加入 10 mL毒死蜱
浓度为 100 mg·L−1的基础培养基, 将预先制备好的
固定化小球按 160 g·L−1的接菌量接种, 置于 33 ℃、
150 r·min−1下摇培。反应时间分别为 12 h、24 h、36
h、48 h、60 h和 72 h取样测定残留毒死蜱的浓度, 以
不接固定化菌的含药基础培养基为空白对照, 计算
降解率, 作出毒死蜱的降解曲线, 确定毒死蜱降解
的最适取样时间。每个处理重复 3次。
1.4 降解率的测定方法
降解结束之后, 取 5 mL反应液用等体积的石油
醚提取 2 次, 合并 2 次提取液后检测。利用毒死蜱
在 λ=290 nm左右处有紫外特征吸收峰的特性[17], 通
过紫外分光光度计扫描确定在 λ=292 nm 处测定样
品的 OD292, 根据标准曲线计算样品中毒死蜱的浓
度, 根据式(1)计算毒死蜱的降解率(X)。
X=(CCK1−Cx)/CCK2×100% (1)
式中, CCK1 为未接菌空白对照培养液中药剂的浓度
(mg·L−1), CCK2为培养液中药剂的初始浓度(mg·L−1),
Cx为接菌培养液中培养结束后药剂的浓度(mg·L−1)。
1.5 试验设计与方法
1.5.1 固定化菌浓度对毒死蜱降解的影响
在 pH为 7.0的灭菌基础培养基中, 添加毒死蜱
使其在培养液中的浓度为 100 mg·L−1, 按照 40
g·L−1、80 g·L−1、120 g·L−1、160 g·L−1、200 g·L−1和
240 g·L−1的接入量加入固定化小球, 于 33 ℃、150
r·min−1摇培 60 h。测定毒死蜱降解率, 确定最佳固
定化菌接入量。每个处理重复 3次。
1.5.2 pH对固定化菌降解毒死蜱的影响
在灭菌的基础培养基中, 添加毒死蜱的浓度为
100 mg·L−1, 调节培养液的 pH为 5、6、7、8、9和
10, 固定化小球的加入量为 160 g·L−1, 其他培养参
数同 1.5.1节。测定毒死蜱的降解率。每个处理重复
3次。
1.5.3 毒死蜱初始浓度对固定化菌降解毒死蜱的影响
在 pH为 7.0的灭菌基础培养基中, 添加毒死蜱
使其在培养液中的浓度分别为 80 mg·L−1、 100
mg·L−1、120 mg·L−1、150 mg·L−1、180 mg·L−1、200
mg·L−1、250 mg·L−1和 300 mg·L−1, 其他培养参数同
1.5.1节。测定毒死蜱的降解率。每个处理重复 3次。
1.5.4 固定化小球的重复使用次数试验
为了考察固定化小球的重复使用特性, 当固定
化小球在 100 mg·L−1的毒死蜱溶液中培养 60 h之后,
取出固定化小球用 0.85%的灭菌生理盐水洗涤, 再
加入到含有 100 mg·L−1毒死蜱的培养液中, 重复利
用 4次。每次都观察记录固定化小球的破碎情况, 测
定毒死蜱的残留浓度, 计算降解率, 得出固定化小
球的可重复使用次数。
1.6 数据分析
试验数据均采用 SPSS 13.0软件进行ANOVA方
差分析。
2 结果与分析
2.1 固定化小球的制作
海藻酸钠溶胶的浓度直接影响包埋小球内部孔
隙的大小, 也影响到包埋小球的传质性能和菌体降
解毒死蜱的能力。因此, 必须选择合适的海藻酸钠
第 12期 段海明: 海藻酸钠固定化细菌对毒死蜱的降解特性 1639


浓度 , 使其黏度既能满足固定化操作方便的要求 ,
又能达到一定的机械强度, 以达到较为理想的包埋
效果 [18]。比较成球效果发现 , 当海藻酸钠浓度为
1.5%时制得的小球机械强度小, 手捏易碎; 而当浓
度为 4%时制得的小球虽然机械强度大, 但是黏度
大、操作困难、质地硬、传质差。本研究通过分析
确定海藻酸钠溶胶适宜的质量浓度为 2.5%(表 1)。
注射器针头的型号决定凝胶小球的直径, 针头
内径越大, 小球直径也越大, 越不利于传质。传质不
足则使凝胶小球内部的细胞营养供给不足, 或者积
累的代谢产物过多, 势必造成凝胶小球内部环境恶
化, 使得直径较大的凝胶小球内降解菌的死亡数目
增多。因此, 凝胶小球直径越小, 越有利于传质和内
部降解菌的增殖。本研究发现选用内径型号为 0.6
mm 的注射器针头最适合造粒。制备好固定化小球
后, 用螺旋测微器测定小球的平均直径为 3 mm。
2.2 固定化菌对毒死蜱的降解曲线
从图 1 可见, 在接菌量为 160 g·L−1时, 固定化
菌对毒死蜱的降解率随着反应时间的延长而升高。
在 24 h 之前, 固定化菌对毒死蜱的降解率较低, 从
24 h至 36 h为降解率升高最快的时期, 从 36 h开始
逐渐变慢。降解时间为 60 h 时, 固定化菌对 100
mg·L−1 毒死蜱的降解率可达到 90%左右, 再继续增
加反应时间 , 其对毒死蜱的降解率没有明显增加
(P>0.05)。因此, 在既定毒死蜱浓度条件下, 固定化
菌对毒死蜱降解的最适反应时间为 60 h。这可能与
固定化菌的浓度、菌株在固定化小球中的增殖速度
以及小球的传质性能有关。固定化菌的反应时间过
短, 则无法保证底物得到充分降解, 其作用不能充
分发挥; 若反应时间过长, 则会影响重复使用次数,
缩短其使用寿命, 增加成本[19]。
2.3 环境条件对固定化菌降解毒死蜱的影响
2.3.1 固定化菌浓度对毒死蜱降解的影响
从图 2A可见, 随着固定化菌接入量的增加, 固
定化菌对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率逐渐升高, 当
接菌量为 160 g·L−1时, 固定化菌在培养 60 h时对毒
死蜱的降解率达到 88%。但是当接菌量进一步增加
时, 毒死蜱的降解率无明显提高(P>0.05)。在毒死蜱
生物降解过程中, 在保证降解效果的前提下, 则应
尽可能减少固定化小球的使用量以降低生产成本。
因此, 固定化小球的适宜接入量确定为 160 g·L−1。
试验观察发现, 当固定化小球接入量较大时, 反应
液的浊度要比低添加量的高。这可能是由于固定化
菌以毒死蜱作为主要碳源和能源物质, 接菌量较高
时 , 大量细胞处于贫营养状态 , 细胞活性降低 , 可
能出现菌体自溶死亡的现象, 死亡的细胞物质渗出
造成培养基浊度增加。
2.3.2 pH对固定化菌降解毒死蜱的影响
各种微生物都需要在一定的 pH 下才能维持正
常代谢功能。从图 2B可见, 从设置的 pH范围来看,
pH对固定化菌降解毒死蜱的影响较小, 在碱性条件
下较有利于毒死蜱的有效降解。但是过酸或过碱也
对毒死蜱的生物降解产生不利影响(P<0.05)。
2.3.3 毒死蜱初始浓度对降解率的影响
从图 2C可见, 毒死蜱浓度对固定化菌的降解有
重要影响。当毒死蜱浓度较低时(80 mg·L−1 和 100
mg·L−1), 固定化菌对毒死蜱的降解率较高, 培养时
间为 60 h时, 其对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率达到
90%左右。随着毒死蜱浓度的继续升高, 固定化菌对
毒死蜱的降解率开始下降。这说明固定化菌对毒死蜱
的耐受度是在一定限度之内的, 高浓度毒死蜱对菌株
生长的抑制作用使降解率下降。从而得出在固定化
菌的实际利用过程中, 要适时监测环境中毒死蜱的
实际存在浓度, 为固定化菌的科学使用奠定基础。
2.4 固定化小球的重复使用
通过试验可以得出, 随着固定化小球使用次数
的增加, 其对 100 mg·L−1毒死蜱的降解率逐渐下降,

表 1 海藻酸钠质量浓度对固定化小球成型效果的影响
Table 1 Effect of the concentration of sodium alginate on molding of the immobilized bacteria
海藻酸钠浓度
Sodium alginate concentration (%)
成型效果
Molding of the immobilized bacteria
1.5
成球易, 传质性能好, 强度较差。Balling more easily, excellent mass transfer performance, poor
mechanical strength.
2.0
成球易, 传质性能好, 强度一般。Balling more easily, excellent mass transfer performance, general
mechanical strength.
2.5
成球较易, 传质性能较好, 强度较好。Balling easily, good mass transfer performance, good me-
chanical strength.
3.0
成球较难, 传质性能好, 强度好。Balling relatively difficult, good mass transfer performance, good
mechanical strength.
3.5
黏度较大, 拖尾, 成球难, 传质一般, 强度好。High viscosity, tailing, balling difficult, general mass
transfer performance, excellent mechanical strength.
4.0
黏度大 , 拖尾 , 成球难 , 传质差 , 强度好。Higher viscosity, tailing, balling difficult, poor mass
transfer performance, excellent mechanical strength.

1640 中国生态农业学报 2012 第 20卷




图 1 接种 160 g·L−1固定化菌条件下 100 mg·L−1毒死蜱
的降解曲线
Fig. 1 Degradation curve of 100 mg·L−1 chlorpyrifos by
160 g·L−1 immobilized bacteria
数据为3个重复的平均值, 下同; 不同小写字母表示不同反应时间
在0.05水平上差异显著(Duncan检验)。Each value was the average of three
replicates. The same below. Different small letters indicate significant dif-
ference among different reaction times at 0.05 level (Duncan test).

固定化菌使用 4 次后, 其对毒死蜱的降解率从 88%
下降到 47%, 下降幅度几乎达一半。试验观察发现,
在固定化菌使用第 1 次时, 固定化小球还比较坚固,
培养液也较为清澈, 几乎没有菌体渗漏。观察发现
从小球重复使用第 3 次开始, 固定化小球开始发生
不同程度的破损。3次使用完毕后, 小球的状态多种
多样 , 有的完好无损 , 有的残缺不全 , 有的甚至出
现溶胀破裂, 培养液变得浑浊。造成细胞机械强度
存在差别的主要原因可能是在人工挤压造粒过程中,
不同小球的钙化时间存在一定差异, 从而导致固定
化小球内部微细结构的不同。第 4次培养结束之后,
固定化小球发生崩解。这说明随着培养时间的不断加
长, 培养液中存在磷酸盐等多种因素对小球具有一定
的破坏作用, 从而致使小球的机械强度下降, 菌体开
始发生渗漏。随着不断循环使用, 使得固定化小球的
实际含菌量下降。因此, 在 60 h 的培养时间内, 固定
化菌对相同浓度毒死蜱的降解率也随之下降。
3 讨论与结论
3.1 固定化降解菌对污染物的高效降解作用
固定化菌剂之所以能够在复杂受污染的环境中
发挥高效降解作用, 主要在于其独特的微环境能够
对外界干扰产生良好的屏蔽效应, 如可以抵御土著
微生物的恶性竞争、防止或减缓噬菌体、毒性物质
及高渗透压物质的吞噬和毒害等[20]。良好的固定化
微环境有助于强化污染物的生化处理过程, 也大大
拓展了其在农药废水处理领域的利用价值。首先 ,
降解菌经固定化后增强了菌体对农药的耐受力, 这
是由于固定化载体起到了一个保护屏障的作用, 使
细胞不直接与高浓度的农药相接触, 对固定化菌的
生物降解起到一定缓冲作用, 因此表现为抗毒物能


图 2 环境条件对固定化菌降解毒死蜱的影响
Fig. 2 Effects of environmental factors on the degradation rate
of chlorpyrifos by immobilized bacteria
不同小写字母表示不同处理在0.05水平上差异显著(Duncan检
验)。Different small letters indicate significant difference among dif-
ferent treatments at 0.05 level (Duncan test).

力的增强[21−22]。其次, 固定化载体内部具有较高的
孔隙度, 可以容纳不断利用培养基中的营养物质进
行增殖的细胞, 从而使某一固定区域内具有较高的
菌体密度。因此, 固定化降解菌将对有毒污染物的
生物强化处理产生强大的推动作用[23−24]。从本研究
可以看出, 海藻酸钠固定化蜡状芽孢杆菌能够在较
短时间内高效降解培养基中的毒死蜱, 这可能也是
由于被海藻酸钠固定化后的菌体处于高度密集状态,
降解菌的稳定性和抗毒性都得到明显增强的缘故。
一种理想的固定化细胞应具有较高的降解活性、机
械强度高、适合长时间使用和大规模生产的特点。
本研究制作的固定化小球只是初步在实验室模拟废
第 12期 段海明: 海藻酸钠固定化细菌对毒死蜱的降解特性 1641


水的条件下进行了试验, 而且其机械强度还需进一
步加强。因此, 要提高固定化菌在农药生化处理池
(或生物反应器)中的利用价值, 还需要进一步研究。
3.2 固定化降解菌小球的机械强度对开发应用的
影响
从本研究可以看出, 制得的固定化小球在应用
于毒死蜱废水样的生物降解过程中, 其重复使用次
数较少, 且会发生不同程度的溶胀破裂。因此, 该固
定化菌应用于实际生产的可能性较小。固定化小球
的机械强度越大, 小球可重复利用率越高, 在工程
上的应用价值就越大[25]。因此, 应在不降低固定化
小球传质性能的前提下, 提高小球的机械强度。分
析其强度不高、不利于重复使用的可能原因有: (1)
海藻酸钠溶胶本身的机械强度偏低。有学者报道在
海藻酸钠溶胶中添加适量氧化铝、二氧化硅、氯化
锰和活性炭等可提高凝胶的机械强度和稳定性[26]。
同样, 张蕾等[27]也报道通过两种包埋剂按一定比例
配合也可以提高固定化小球的稳定性和降解污染物
的能力。如可以把海藻酸钠(SA)和聚乙烯醇(PVA)
配合制成凝胶, PVA能提高 SA固定化小球的凝胶强
度, SA 能提高小球的传质性能, 只要寻找到最佳的
组合方式, 就可以达到增强固定化小球机械强度和
提高固定化菌降解污染物能力的目的。(2)培养基中
的磷酸盐成分偏高。发酵培养基中磷酸盐成分能够
逐渐使海藻酸钙凝胶破裂。为了规避磷酸盐对固定
化小球的破坏作用, 在利用固定化小球进行降解试
验时, 可以采用离子置换法或者用其他类型的缓冲
液以消除磷酸盐对降解的影响。宋向阳等[28]利用铝
离子对钙离子置换法 , 将低浓度的树干毕赤酵母
(Pichia stipitis)细胞固定, 形成的海藻酸铝固定化酵
母细胞耐磷酸盐能力显著增强, 海藻酸铝固定化酵
母细胞使用寿命明显延长。这是因为海藻酸铝、海
藻酸锰的固定化细胞耐磷酸盐能力明显强于海藻酸
钠(钙)固定化细胞。谢慧[29]用巴比妥钠–盐酸缓冲液
代替磷酸盐缓冲液开展了固定化酶对毒死蜱的降解
特性研究, 效果较好。(3)成型剂 CaCl2的浓度偏低。
许多研究报道表明, 通过提高成型剂氯化钙的浓度
可以显著提高固定化小球的机械强度。王军等[30]通
过海藻酸钠固定化莠去津降解酶的研究表明 , 当
CaCl2 浓度为 4%时, 得到的固定化酶降解莠去津的
能力最强。然而本研究中的 CaCl2浓度仅为 2%, 是
否可以通过提高氯化钙的浓度来增大固定化小球的
机械强度还有待于进一步研究。(4)液菌比过小造成
固定化小球机械强度较小。这是因为包埋的菌量越
多, 菌体增殖后对小球壁的冲击越大, 从而逐渐使
小球由内向外发生变化 , 使小球的机械强度下降 ,
造成小球壁破裂, 而导致菌体渗漏严重[31]。(5)固定
化时间偏短。固定化时间较短造成固定化小球机械
强度较小, 内部不是十分紧密, 以致小球较易发生
崩解, 菌体流失严重[32]。因此, 要提高固定化菌小球
的机械强度, 需从以上 5 个方面入手, 逐一进行研
究, 以期为可高效降解毒死蜱, 且机械强度高的固
定化小球的开发利用提供技术支持。
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