全 文 ：南京农业大学学报 2013，36(5) :59－64 http:/ /nauxb． njau． edu． cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:10． 7685 / j． issn． 1000－2030． 2013． 05． 010
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收稿日期:2012－11－27
基金项目:国家自然科学基金项目(30670008，30800156，30970081)
作者简介:张红侠，硕士研究生。* 通信作者:王志伟，教授，从事微生物资源及其利用研究，E-mail:zwwang@ njau． edu． cn。
张红侠，纪燕玲，邢转青，等． 禾本科植物内生真菌研究 17:黄山大雀麦 －内生真菌新共生体的生物学特征［J］． 南京农业大学学报，
2013，36(5) :59－64
禾本科植物内生真菌研究 17:黄山大雀麦－内生真菌
新共生体的生物学特征
张红侠，纪燕玲，邢转青，王志伟*
(南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095)
摘要:本研究在 2011 和 2012 年夏季从安徽省黄山市 4 个采样点采集大雀麦(Bromus magnus Keng)559 株，镜检结果表明含
菌率为 48． 0% ～ 77． 8%。含菌植物样品经表面消毒分离得到 31 株菌，根据形态学特征将这些菌株分为 2 个菌群:快速生
长(fast growing，FG)菌群，生长速度为每周 16． 0 ～18． 8 mm;慢速生长(slow growing，SG)菌群，生长速度为每周 4． 3 ～ 5． 3 mm。
FG菌群分生孢子［(4． 5 ～ 5． 1)μm×(2． 9 ～ 3． 6)μm］及分生孢子梗(15． 8 ～ 24． 6 μm)等无性形态结构比 SG 菌群略大。从
同一地点、同种宿主植物中分离得到分属于 FG和 SG菌群的不同菌株，显示出一定的遗传多样性。在基于 tubB 基因片段
构建的系统发育树中，FG和 SG菌群菌株间未表现出差异，全部菌株在 Epichlo bromicola /E． yangzii(EBY)中独立形成后验
概率值为 0． 95 的一支，区别于其他种的菌株，表明菌株出现生长速度显著差异的时间可能并不久远，这些菌株与大雀麦有
可能是一个新的 epichloid真菌－宿主植物组合。
关键词:大雀麦;内生真菌;形态学特征;系统发育学特征
中图分类号:Q939． 5 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2013)05－0059－06
Grass endophyte researches 17:biological properties of
Bromus magnus-epichloid endophyte symbiosis grown in Huangshan
ZHANG Hongxia，JI Yanling，XING Zhuanqing，WANG Zhiwei*
(College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:From 2011 to 2012，559 Bromus magnus Keng plants were collected from 4 sites in Huangshan，Anhui． The infection level
was 48． 0% －77． 8% ． Thirty-one epichloid endophyte strains were isolated on PDA plates，and these strains were divided into FG
(fast growing)and SG(slow growing)groups depended on growth rate on PDA plates． Colonies of FG strains could grow to 16． 0－
18. 8 mm each week，while those of SG strains were 4． 3－5． 3 mm． FG strains had bigger conidia(4． 5－5． 1)μm×(2． 9－3． 6)μm and
longer phialides(15． 8－24． 6)μm than those of SG strains． Strains of FG and SG exhibited diversity although they were isolated from
the same site and same kind of host plant． Phylogenetic tree based on tubB gene fragments revealed that strains of FG and SG clus-
tered together in a distinct subclude within the Epichlo bromicola /E． yangzii clade，with posterior probability of 0． 95． Biological
properties of these strains were different from reported epichloid endophytes． It could be speculated that the significant differences of
growth rate between FG and SG strains happened recently． They could be a new symbiotic association．
Key words:Bromus magnus Keng;epichloid endophyte;morphological characteristic;phylogenetic properties
禾本科植物内生真菌主要指分离自冷季型禾本科植物的 Epichlo 属和 Neotyphodium 属真菌，它们统
称为 epichloid endophytes［1－2］。目前，已报道 Epichlo 属真菌有 14 种，Neotyphodium 属真菌有 23 种 5 变
种［2－4］。有性型的 Epichlo属内生真菌能在宿主植物体上产生子座，阻碍宿主植物正常抽穗，进行水平传
播［5］。多数 Neotyphodium属内生真菌由 2 个或多个 Epichlo 属真菌杂交而来，在宿主植物上不表现任何
症状，通过宿主植物的种子进行传播［6－7］。Neotyphodium属内生真菌与宿主植物在长期的进化过程中形成
了互利共生的关系:宿主植物为内生真菌提供栖息场所和正常生长所需要的营养［7］，同时内生真菌则增
强宿主植物抵抗生物和非生物胁迫，提高宿主植物的繁殖能力［8－9］，因此，其在农牧业上受到越来越多的
重视［10－11］。
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
雀麦属植物约有 150 个种，广泛分布在亚洲、欧洲、非洲和美洲［12］。关于雀麦属植物中内生真菌的分
布研究主要来自瑞士、北美及南美，来自其他地区的报道较少［13－14］。目前，仅在 6 种雀麦属植物中检测到
4 种内生真菌，分别是在瑞士直立雀麦(Bromus erectus)、密从雀麦(B． benekenii)和类雀麦(B． ramosus)宿主
植物中发现的 E． bromicola［15］，在北美 B． anomalus 中发现的 N． starrii［16］，在南美 B． setifolius 和 B． auleticus
中发现的 N． tembladerae［17－18］，以及最近在南美 B． auleticus中发现的 N． pampeanum［19］。
2008 年本课题组发现安徽黄山含菌的雀麦属植物［13］，并在这一地区集中采集雀麦属植物，检测和分
离了其中的内生真菌，调查分离菌株的形态学特征及系统发育学特征，以期为全面掌握黄山地区禾本科植
物内生真菌资源奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 植物样品的采集、保存及鉴定
2011 和 2012 年夏季，从安徽省黄山市采集雀麦属植物的整株或地上部分。样品迅速运回实验
室，4 ℃冰箱中保存。根据植物样品的花序特征，参照文献［20］进行鉴定。
1． 2 内生真菌的检测、分离及保存
用镊子撕取植物叶鞘内表皮，碱性孟加拉红染色液(1 g 孟加拉红，1 mol·L－1 NaOH，100 mL 蒸馏水)
染色，在光学显微镜下观察菌丝体是否存在［21］。
将镜检含菌植物样品茎秆切成小段，依次经 75%(体积分数)乙醇、0． 2 mol·L－1 NaClO、75%乙醇表面
消毒各 1 min，无菌水漂洗 1 min后，置于 PDA平板上 25 ℃黑暗培养，直至长出典型的内生真菌菌落。分
离菌株经纯化后置于 PDA培养基斜面上 4 ℃保藏。
1． 3 内生真菌的形态学特征
分离菌株在 PDA平板上 25 ℃培养 21 d，观察菌落形态特征，测定菌落生长速度，每株菌 5 个重复。
挑取菌落边缘菌丝，在光学显微镜下观察、记录并测量分生孢子和分生孢子梗的形态及大小，每株菌 20 个
重复，计算平均值及标准差。
1． 4 内生真菌的 tubB序列分析
根据宿主植物的形态学特征，选择具有代表性的 6 个菌株采用 IQS 法［22］提取 DNA，用 10 g·L－1琼脂
糖凝胶电泳检测后，DNA置于 4 ℃冰箱中保存备用。以通用引物扩增菌株的 tubB基因片段［4，6－7］，电泳检
测目的条带达到测序要求后，委托上海美吉生物医药科技有限公司直接测序。所得序列在 NCBI 数据库
中进行 BLAST比对，确定是否为目标序列。根据比对结果，选取各属代表性种的对应序列，利用 Clustalx
1. 81 软件进行多重比对。以 PAUP* 4． 0b10、MrModeltest v2． 3［23］为贝叶斯构建系统发育树，选择合适的
模型，用 MrBayes v3． 12 程序运行 500 万次，前 25%的树删除，剩余树用于推断一致树，构建最大似然树
(maximum likelihood，ML)［24］。
2 结果与分析
2． 1 植物样品的采集、鉴定及保存
2011 和 2012 年夏季，从安徽省黄山市黄山区 4 个采样点共采集雀麦属植物样品 559 株(表 1) ，植株
生于山间河岸边和公路两侧路边的砾石间以及乡村小路边的灌丛中。植株很少单独生长，一般生于灌丛及
表 1 黄山各雀麦采集点及内生真菌的含菌率
Table 1 Infection level of Bromus magnus plants collected from Huangshan
采样时间
Sample time
采样地点
Sample site
生境
Habitat
样品数量
Sample number
含菌样品数量
Infected number
含菌率 /%
Infection level
分离菌株数量
Isolate number
菌群
Group
2011－06 甘棠镇 Gantang Town 坡地 Hillside，灌丛砾石 Shrub gravel 96 63 65． 6 0 —
2011－06 仙缘镇 Xianyuan Town 灌丛砾石 Shrub gravel，河岸 River bank 34 20 58． 8 4 SG
2011－06 新明乡 Xinming Country 砾石 Gravel 84 45 53． 6 0 —
2012－06 汤口镇 Tangkou Town 山间砾石 Hill gravel 18 14 77． 8 0 —
2012－06 甘棠镇 Gantang Town 坡地 Hillside，灌丛砾石 Shrub gravel 200 96 48． 0 14 FG，SG
2012－06 仙缘镇 Xianyuan Town 灌丛砾石 Shrub gravel，河岸 River bank 127 72 56． 7 13 SG
总计 Total 559 310 55． 5 31
注:—:未分离出菌株 No strains were isolated;SG:慢速生长 Slow growing;FG:快速生长 Fast growing． The same as follows．
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第 5 期 张红侠，等:禾本科植物内生真菌研究 17:黄山大雀麦－内生真菌新共生体的生物学特征
砾石间，高约 100 ～ 120 cm;圆锥花序展开，稍弯曲;小穗具 5 ～ 7 小花;颖窄;外稃间脉不明显，下部疏生糙
毛，具细弱直芒。植物正常抽穗，未观察到子座的形成(图 1－A)。根据完整的植物花序特征，参照文献
［20］，该样品被鉴定为大雀麦(Bromus magnus Keng)。植物标本(NAU035167)保藏于南京农业大学标
本馆。
图 1 大雀麦及内生真菌的形态特征(PDA，21 d，25 ℃)
Fig． 1 Morphological characteristics of host and fungal endophyte in Bromus magnus(PDA，21 d，25 ℃)
A．大雀麦花序;B．茎髓中的菌丝;C、D和 E分别为 FG菌群 Bhsb201 菌株菌落正面、分生孢子及分生孢子梗;F、G和 H分
别为 SG菌群 Bhsb101 菌株菌落正面、分生孢子及分生孢子梗
A． An inflorescence of B． magnus;B． Fungal hyphae within the pith;C，D and E． Colony obverse，conidium and phialide of
Bhsb201 from FG group;F，G and H． Colony obverse，conidium and phialide of Bhsb101 from SG group
2． 2 植物样品内生真菌的检测
在显微镜下镜检植物样品，从 559 株雀麦植物样品中确认 310 株含菌，含菌率为 55． 5%(表 1)。叶鞘
中被染成红色的菌丝体细长，宽约 2 μm，粗细均匀，略有弯曲，大致平行于植物细胞长轴排列，不交叉，不
进入植物细胞生长，有隔膜，罕有分叉(图 1－B)。
2． 3 内生真菌的分离、培养及保存
在恒温箱中培养约 1 周后，在 PDA培养基上从茎秆两端长出典型的内生真菌菌落，经纯化后，共得到
31 株内生真菌菌株(表 1)。纯化后的菌株于 PDA培养基斜面上 4 ℃保藏。
2． 4 内生真菌的菌落特征
分离菌株根据生长速度分为 2 种类型:1)FG(fast growing)菌群:共 9 株，分别为菌株 Bhsb201 ～
Bhsb209(2012 年甘棠镇分离菌株)。菌株生长速度较快(每周 16． 0 ～ 18． 8 mm) ，菌落正面白色，棉质，质
地疏松，气生菌丝短，紧贴培养基生长，中央稍有隆起，菌落边缘整齐，菌落背面黄色至褐色(图 1 －
C)。2)SG(slow growing)菌群:共 22 株，分别为 Bhsa101 ～ Bhsa104(2011 年仙缘镇分离菌株)、Bhsb101 ～
Bhsb113(2012 年仙缘镇分离菌株)、Bhsb210 ～ Bhsb214(2012 年甘棠镇分离菌株)。菌株生长速度慢
(21 d菌株直径达 4． 3 ～ 5． 3 mm) ，菌落质地致密，气生菌丝长，中央隆起，菌落边缘整齐，背面深褐色，向
四周颜色渐浅(图 1－F)。
2． 5 内生真菌的无性形态特征
分生孢子梗垂直于菌丝，单生，基部常有隔膜。分生孢子无色透明，半月形或卵圆形，单个顶生(图 1－
E、H)。FG菌群:分生孢子(图 1－D)稍大，(4． 5 ～ 5． 1)μm×(2． 9 ～ 3． 6)μm，分生孢子梗长 15． 8 ～ 24． 6
μm，基部宽 1． 9 ～ 2． 1 μm，顶端宽 0． 8 ～ 1． 2 μm。SG 菌群:分生孢子(图 1－G) (3． 9 ～ 4． 8)μm×(2． 7 ～
3. 4)μm，分生孢子梗长 15． 4 ～ 21． 7 μm，基部宽 1． 7 ～ 2． 0 μm。
2． 6 内生真菌的 tubB序列分析
以通用引物扩增 6 个菌株(2 株 FG菌株:Bhsb201、Bhsb202;4 株 SG菌株:Bhsa101、Bhsb101、Bhsb210、
Bhsb211)的 tubB基因片段。用 PCR 引物直接测序，获得了完整的序列。在这 6 个菌株中 tubB 序列只
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
有 1 个拷贝，扩增片段长度均为 700 bp。用 DNAssist软件比对序列，6 株菌的 tubB序列仅 1 个碱基(第 47
个碱基)有差异。根据在 NCBI 数据库中的相关序列运用 BLAST 功能比对分析，所得 tubB 基因序列与
epichloid endophytes相似。根据比对结果，选择各属代表性种的相应序列构建系统发育树(图 2)。
基于 tubB基因序列构建的最大似然树中，Claviceps purpurea 独立形成外群，N． gansuense、N． gansuense
var． inebrians、N． sibiricum聚为一大支，其余各属均形成各自独立分支，与之前报道一致。雀麦属植物中已
报道的 4 种内生真菌，除来自北美的 N． starrii 无对应序列外，其余 3 种在系统发育树上均形成独立的分
支。大雀麦的 6 株分离菌株均在 E． bromicola /E． yangzii(EBY)分支上，形成一个独立分支，后验概率值
(posterior probability)为 0． 95，表明分离菌株属于新的分类群(图 2)。
图 2 基于 tubB基因片段构建的系统发育树(ML)
Fig． 2 Phylogenetic tree based on tubB fragment(maximum likelihood)
3 讨论
目前，在雀麦属植物中仅有 4 种内生真菌被记录，但在我国还没有具体的研究［15－19］。南志标［14］在
1996 年调查了西北地区部分禾草种子中内生真菌的分布，显示甘肃地区的大雀麦及无芒雀麦种子有很低
的含菌率，分别为 10%和 6%，随后该课题组未有相关报道。2006 年，Wei等［25］对我国内蒙古地区禾本科
植物内生真菌资源进行调查，未发现含菌雀麦属植物。
从 2001 年起，本课题组采集江苏、安徽、浙江、河南、山东等省的雀麦属植物约 2 000 株，植物样品包
括疏花雀麦(B． remotiflorus)、扁穗雀麦(B． unioloides)、雀麦(B． japonicus)和大雀麦(B． magnus) ，部分雀麦
属植物样品未鉴定到种［21］。2008 年，在黄山地区调查发现，雀麦属植物(Bromus sp．)的含菌率为
52%［13］。基于此，本课题组在这一地区集中采集雀麦属植物，该样品被鉴定为大雀麦(Bromus
magnus)［20］。同时，在江苏省南京市采集到的大雀麦未检测到内生真菌。因此，本研究在黄山检测到的大
雀麦中的内生真菌是华东地区少有的例子。本研究从大雀麦中分离到内生真菌，这是国内首例成功分离
内生真菌的雀麦属植物，大雀麦(B． magnus)则是内生真菌的新宿主。
在所调查的地区中，内生真菌的含菌率达 55． 5%，与此前的研究［13］相吻合，这也表明内生真菌与宿
主植物大雀麦在长期的进化过程中形成了良好的共生关系。在调查的 4 个采样点，含菌率最高的汤口镇
及稍低的新明乡，大雀麦中均未分离到内生真菌;含菌率相对低的甘棠镇和仙缘镇，大雀麦植物中分别分
离出 14 和 17 株菌。本研究没有来自汤口镇及新明乡的菌株，需要后期采样继续研究。
禾本科植物内生真菌的分类首先依据菌株的形态特征，结合交配型、宿主特异性、地理分布及系统发
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第 5 期 张红侠，等:禾本科植物内生真菌研究 17:黄山大雀麦－内生真菌新共生体的生物学特征
育学特征等信息作为综合判断［3－7，17］，而形态学特征一直还是主要依据［26－27］。根据生长速度，本研究中大
雀麦 31 个分离菌株分为 FG和 SG 2 个分类群，SG菌群在数量上占据优势，FG菌群菌株在生长速度及无
性结构上均略大于 SG菌群，同种宿主植物中分离到的菌株间显示出一定的多样性［3，28－29］。FG 菌群菌株
生长速度与 E． bromicola类似［15］，而分生孢子及分生孢子梗都比 E． bromicola大，比一般 Neotyphodium属菌
株生长速度快［2，6－7］。SG菌群菌株生长速度介于 N． tembladerae［17－18］和 N． pampeanum［19］菌株之间，分生孢
子比 N． pampeanum菌株小，与 N． tembladerae菌株类似，属于无性型的 Neotyphodium 内生真菌。黄山雀麦
中分离到的内生真菌菌株分生孢子梗基部常有隔膜。除 N． tembladarae菌株外，已报道的雀麦属内生真菌
分生孢子梗基部均无隔膜或罕有隔膜［15－19］。本研究中的雀麦内生真菌菌株，与已报道的雀麦属植物及本
土禾本科植物内生真菌在形态学特征上存在差异［2］，推测为一个新的分类群。
值得注意的是，从仙缘镇只分离到 SG菌群菌株，而从甘棠镇同时分离到 FG 和 SG 菌群的菌株，不同
采样点的雀麦分离菌株显示了多样性，同时同一采样点的分离菌株也存在形态多样性［3，28－29］。在本试验
所用的消毒条件下，SG菌群占总分离菌株的 71． 0%，表明 SG菌群具有较强的适应性;也表明 FG和 SG菌
群对消毒剂的敏感性不同，可能是 FG和 SG菌群菌株不同所致，这个现象在分类学上的意义，需要更深入
的讨论。
本研究共分离 31 株内生真菌，根据采样时间、采样地点以及形态类群等不同因素，选取 6 个菌株为代
表进行系统发育学分析。菌株分别为 2011 年和 2012 年来自仙缘镇的菌株 Bhsa101 和 Bhsb101，以及 2012
年来自甘棠镇的菌株 Bhsb210 和 Bhsb211(SG 菌群) ，2012 年来自甘棠镇的菌株 Bhsb201 和 Bhsb202(FG
菌群)。基于 tubB片段序列构建的系统发育树中，每个种的代表性菌株各自形成独立的分支，与此前的报
道一致［6－7，19，28］。大雀麦分离菌株在系统发育树上形成一个独立的分支，后验概率值为 0． 95，与其他菌株
存在显著的系统发育学差异［6－7，19］。FG和 SG 菌群之间在系统发育学上未显示出差异，而大雀麦分离菌
株存在形态多样性，到底是 FG菌群派生出 SG菌群，还是 SG菌群派生出 FG菌群，目前尚不能判断，推测
其出现生长速度显著差异的时间可能并不久远［3，28－29］。结合形态学特征及系统发育学特征，鉴定黄山大
雀麦内生真菌属于一个新的分类群，也表明大雀麦－内生真菌为一个新的组合。
在长期的进化过程中，大雀麦－内生真菌成为新的共生体。在安徽省黄山市的调查显示，大雀麦只生
长在部分地区，且分布范围不如雀麦及鹅观草广，属于当地少见物种。对黄山大雀麦中内生真菌的研究，
有利于探讨禾本科植物－内生真菌的共生机制，以利于充分利用禾本科植物内生真菌资源。
黄山区环境监测站桂岚笙在植物样品采集上给予了帮助，谨致谢意!
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责任编辑:刘怡辰
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