全 文 ：芸香科药用植物 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
柴素芬 , 陈兆贵 , 洪彩霞　(惠州学院生命科学系 ,广东惠州 516007)
摘要　[目的]建立和优化芸香科药用植物的品种的 ISSR反应体系 ,为芸香科药用植物的资源评价、品种鉴定提供依据。[ 方法] 以象头
山芸香科植物柚 、山油柑、 3个品种为研究对象 , 从DNA提取、退火温度 、循环次数 、引物筛选等方面研究 ISSR反应及优化条件。
[结果]选用的 20个引物中有 3种引物扩增效果较好 ,以柚为代表的优化结果表明 ,引物 826对芸香科植物扩增的最适退火温度为 52.0
℃,最佳循环次数为 35个循环。[结论] ISSR适合于芸香科药用植物的品种的鉴定。
关键词　芸香科;ISSR;反应体系
中图分类号　S567.1+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)33-14433-03
Construction andOptimization of ISSR Reaction System of Medicinal Rutaceae Plants
CHAI Su-fen et al　(Department of Life Sciences ,Huizhou University ,Huizhou , Guangdong 516007)
Abstract　[Objective] The research aimed to study the construction and optimization of ISSR reaction system of medicinal Rutaceae plant , and provide
references for resources evaluation and cultivar identification of Rutaceae plants.[ Method] Three varieties of Rutaceae plants including C.grandis(L.)Os-
beck , Acronychia pedunculata(L.)Miq., Z.avicennae(Lam.)DC were used as material for study.The ISSR reaction system included the genomicDNA ex-
traction , amplification , cycle time ,primers screening.[ Result] In the Identification of ISSR molecular markers , 3 primers in 20 of being chose had better
amplification effect.Optimization results representative of C.grandis(L.)Osbeck showed that primers 826 for the optimum temperature of Rutaceae plants
amplification was 52.0 ℃, and the best cycle timewas 35 cycles.[Conclusion] ISSR reaction system can used to identify the cultivar of Rutaceae plants.
Key words　 Rutaceae plant;ISSR;Reaction system
基金项目　惠州市科技计划项目(项目编号:A50·70204)。
作者简介　柴素芬(1964-),女 ,上海人 ,副教授 , 从事植物分类方面
的研究。
收稿日期　2008-09-11
　　芸香科(Rutaceae)为被子植物门双子叶植物纲的一个
科。常绿或落叶乔木 、灌木或攀援藤本或草本 ,通常含挥发
油。叶具透明油腺点 ,互生 ,少数对生 ,单叶 、单身复叶或羽
状复叶。花两性 ,多为辐射对称 ,聚伞花序 ,少数成总状 、穗
状花序或单花;萼片 4～ 5;花瓣 4～ 5 ,离生;雄蕊 4 ～ 5或 8～
10或多数;雌蕊心皮 4～ 5 ,分离或合生 ,或多个心皮;具花盘。
果 、蒴果 、翅果 、核果或柑果。芸香科有 180属 1 300 ～
1 600种 ,主产于热带和亚热带 ,少数温带;我国 29属 150种 ,
主产于西南和华南[ 1] 。
遗传多样性主要是指种内不同居群之间或同一居群不
同个体之间的遗传变异的总和[ 2] 。遗传多样性是植物种质
资源研究的主要内容之一 ,较为全面地了解现有物种的种质
资源的遗传多样性 ,是药用植物保存和利用的前提[ 2] 。近年
来 ,分子标记技术已广泛应用于药用植物种质资源的鉴定 、
遗传多态性分析 、道地性分析等[ 3-6] 。简单序列重复区间
(Inter-Simple Sequence Repeats , ISSR)是近年来发展起来的一
类新型的分子标记技术 ,具有多态性高和重复性好等优点 ,
已广泛用于药用植物的鉴定和遗传多样性研究[ 7-9] 。但将
ISSR分子标记用于芸香科植物的鉴定尚没见报道 。为此 ,笔
者对象头山 3种芸香科药用植物的品种进行 ISSR分析 ,建立
和优化 ISSR反应体系 ,旨在为象头山芸香科药用植物的资
源评价和品种鉴定提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料　选用 3个芸香科药用植物品种 ,分别为柚[ C.
grandis(L.)Osbeck] ,山油柑[ Acronychia pedunculata(L.)Miq.]
和 [ Z .avicennae(Lam.)DC] ,取自广东象头山国家级自然
保护区。采集各品种的幼叶材料 ,放入封口塑料袋 ,于-80
℃低温冰箱保存备用 。
1.2　方法
1.2.1　芸香科植物形态学鉴定。柚 ,单身复叶 ,叶片椭圆
形 ,叶具宽翅(图 1a)。山油柑 ,灌木 ,三出复叶(图 1b)。
,常绿灌木或乔木 ,奇数羽状复叶(图 1c)。
注:a为柚, b为山油柑 , c为 。
　Note:a , Citrus grandis;b , Acronychia pedunculata;c , Zanthoxylum avi-
cennae.
图 1　3种植物的形态
Fig.1　Themorphology of three species of plants
表 1　用于 PCR扩增的引物序列
Table 1　The primer sequences for PCR amplification
引物编号
Primer No.
引物序列
Primer sequences
808 5 -TATATATATATATATAC -3
811 5 -GAGAGAGAGAGAGAGAC-3
817 5 -CACACACACACACACAA-3
821 5 -GTGTGTGTGTGTGTGGTT-3
822 5 -TCTCTCTCTCTCTCTCA-3
826 5 -ACACACACACACACACC-3
827 5 -ACACACACACACACACG-3
829 5 -TGTGTGTGTGTGTGTGC-3
835 5 -AGAGAGAGAGAGAGAGYC-3
845 5 -CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3
847 5 -CACACACACACACACARC-3
851 5 -GTGTGTGTGTGTGTGTYG-3
853 5 -TCTCTCTCTCTCTCTCRA-3
855 5 -ACACACACACACACACYT-3
859 5 -TGTGTGTGTGTGTGTGRC-3
860 5 -TGTGTGTGTGTGTGTGRA-3
862 5 -AGCAGCAGCAGCAGCAGC-3
864 5 -ATGATGATGATGATGATG -3
876 5 -GATAGATAGACAGACA -3
879 5 -CTTCACTTCACTTCA-3
1.2.2　DNA提取及纯度检测。DNA提取采用 CTAB 法[ 10] ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(33):14433-14435, 14512　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　姜丽　责任校对　傅真治
并略有改动 ,用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质
量 ,用紫外分光光度计测定 DNA的纯度和含量 ,并将其稀释
到 20 ng/μl ,备用。
1.2.3　ISSR-PCR扩增。
(1)引物筛选 。选用宝生物工程(大连)有限公司
(TaKaRa)合成的 20个 ISSR引物 ,见表 1。
　　(2)PCR反应。PCR扩增反应在 PTC200型热循环仪中进
行 ,初始反应条件:10μl PCR反应体系 ,含模板约 1μl , Taq 酶
0.2μl , dNTPs0.5μl ,引物0.5μl ,10×buffer 1μl , ddH2O 6.8μl。
(3)PCR扩增条件。94 ℃预变性 4min;94 ℃变性 1 min ,
52 ℃复性 1min , 72 ℃延伸 2 min ,35个循环;72 ℃延伸 8 min ,
12 ℃Forever。扩增后的 DNA用 1.2%的琼脂糖凝胶进行电
泳 ,紫外检测拍照 。
1.2.4　PCR扩增条件的优化。
(1)退火温度的筛选 。在确定的最佳反应体系基础上 ,
利用梯度 PCR对退火温度进行优化筛选。设定退火温度为:
48 、52、56、60 ℃。
(2)循环次数的筛选 。在确定的最佳反应体系基础上 ,
利用梯度 PCR对循环次数进行优化筛选。设定循环次数为:
30 、35、40、45个。
1.3　数据统计与分析方法　ISSR是显性标记 ,同一引物扩
增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性 , 按照
相同迁移位置上扩增带记为 1 、无带为 O的方法记录电泳谱
带。该研究对电泳结果进行人工读带 ,仅记录清晰 、可重复
的并且长度在 100～ 2 000 bp的扩增带。
2　结果与分析
2.1　DNA质量检测结果　将所抽取的 DNA样品进行电泳
扩增和紫外检测。电泳结果表明 ,用CTAB 法提取的DNA质
量较好(图 2)。紫外检测结果表明:所抽提出的样品较为纯
净 ,峰面平整 ,在 260 nm 附近出现明显的吸收峰(图 3)。所
提DNA可用于PCR扩增。
注:A、B 、C分别为柚子 、山油柑 。
　Note:A , B and C stand for C.grandis , A.pedunculata and Z .Avi-
cennae respectively.
图 2　DNA电泳图
Fig.2　DNA electrophoresis map
2.2　多态性分析　共选用了20条引物对3种材料进行PCR
扩增 ,其中柚能扩增出较多的 DNA条带 ,共有 14条引物能扩
增出DNA条带(图 4～ 5);引物 826、827、864等 3条引物能在
3个样品中扩增出较多的DNA条带(图 6～ 8)。
　　分别用 826、827和 864对 3个材料进行多态性分析 ,在
ISSR分析中 ,每个引物可扩增出 10～ 14条DNA条带 ,平均 12
条(图 6 ,表 2)。3个引物共扩增出 36条条带 ,其中 33条条带
具有多态性 ,多态性比率为 91.7%。这表明 ISSR标记能够
有效地揭示材料间的多态性。
图 3　DNA紫外分光吸收值图谱
Fig.3　The ultraviolet spectrometry spectrum of DNA
　注:1代表 847;2代表 821;3代表 822;4代表 817;5代表 855;6代
表 829;7代表 835;8代表 811;9代表 827;10代表 845。
　Note:1 , Primer 847;2 , Primer 821;3, Primer 822;4 , Primer 817;5 ,
Primer 855;6 , Primer 829;7, Primer 835;8 , Primer 811;9 ,
Primer 827;10 , Primer 845.
图 4　扩增柚子的引物Ⅰ
Fig.4　The amplified primer I of C.grandis
　注:1代表 876;2代表 862;3代表 808;4代表 826;5代表 864;6代
表 853;7代表 860;8代表 879;9代表 851;10代表 859;11代表
845。
　Note:1, Primer 876;2 , Primer 862;3 , Primer 808;4 , Primer 826;5 ,
Primer 864;6 ,Primer 853;7 ,Primer 860;7 ,Primer 879;9 ,Primer
851;10 ,Primer 859;11 ,Primer 845.
图5　扩增柚子的引物 Ⅱ
Fig.5　The amplified primerⅡ of C.grandis
2.3　ISSR反应体系的优化结果
2.3.1　不同退火温度对 ISSR-PCR反应的影响 。退火温度对
ISSR-PCR扩增有明显的影响。从图 7可以看出 ,退火温度较
低时(48 ℃),除主带外 ,还有杂带;当退火温度较高时 ,扩增
条带减少(56 ～ 60 ℃);在退火温度为 52 ℃时条带的稳定性
和重复性较好 ,扩增效果较好 ,这与理论上的 Tm 值(52 ℃)
相一致。因此 ,选取 52 ℃为最佳退火温度。
14434 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
　Note:1-3 stand for C.grandis , A.pedunculata and Z .Avicennae respectively.
图 6　引物826(a)、827(b)、864(c)扩增产物
Fig.6　The amplified products of primer 826(a),primer 827 and Primer 864(c)
表 2　3个有效 ISSR引物的扩增结果
Table 2　Amplified results of 3 effective ISSRprimers
引物编号
No.of primers
扩增带数∥条
Amplified bands
多态性条带∥条
Polymorphic bands
多态性比率∥%
Polymorphic ratio
826 14 　　　13 92.9
827 12 11 91.7
864 10 9 90.0
注:1～ 4对应温度分别为 48 、52、56 、60.0 ℃。
　Note:The corresponding temperature of 1-4 are 48, 52 , 56 and 60.0 ℃
resp.
图7　引物 826退火温度对柚子 ISSR-PCR反应的影响
Fig.7　Effects of the annealing temperature of primer 826 on ISSR-
PCR reaction of C.grandis
注:1～ 4对应循环次数分别为 30、35 、40 、45。
Note:The cycle number of 1-4 are 30 , 35 , 40 and 45 resp.
图8　引物 826循环次数对柚子 ISSR-PCR反应的影响
Fig.8　Effects of the cycle number of primer 826 on ISSR-PCRreac-
tion of C.grandis
2.3.2　循环次数对 ISSR-PCR反应的影响 。PCR的循环次数
决定产量 ,次数太少 ,产物量极低 ,次数太多 ,达到反应平台
后 ,循环不会使产物明显增加 ,反而引起非特异性扩增[ 5-7] 。
该试验进行了 30、35 、40 、40个循环的尝试 ,发现 30、40、45个
循环时产物不稳定 ,部分条带缺失且条带模糊 ,而 35个循环
时条带丰富 ,较清晰稳定(图 8)。因此 ,选取 35个循环为最
佳循环次数。
3　结论与讨论
3.1　影响 PCR 结果的因素分析　ISSR是 Zietkiewicz 等于
1994年提出的一种DNA分子标记技术 ,兼有 RAPD操作简单
和 SSR多态性好的优点 ,同时它的重复性和稳定性较高 ,成
本较低[ 11] 。但由于 ISSR技术也是基于 PCR的一种分子标
记技术 ,所以同其他分子标记一样 ,其结果容易受多种因素
的干扰 ,如引物反应条件 、模板 DNA 、Taq 酶 、dNTPs、引物以
及 Mg2+浓度等 ,因此在研究时都应先针对这些影响PCR反
应的因子建立起合适的反应体系[ 12] 。
该研究对PCR扩增的退火温度和循环次数进行了优化 ,
确定最佳退火温度为 52 ℃,这与理论上的 Tm 值(52 ℃)相
一致;对循环次数进行了 30、35、40 、45个循环的尝试 ,选取 35
次循环为最佳循环次数。
3.2　ISSR标记在芸香科植物分类鉴定中的应用　该试验对
所采集的芸香科植物品种资源进行 ISSR分析 ,并建立 ISSR
反应优化体系 ,用 3条引物总共扩增出 36条条带 ,其中 33条
条带具有多态性 ,多态性比率为 91.7%。这表明 ISSR标记
能够有效地揭示材料间的多态性。该试验选取的材料较少 ,
无法进一步研究芸香科其他植物材料的遗传多态性。相信 ,
随着材料数的增加 ,能提供更多有效的信息 。
参考文献
[ 1] 黄成就.中国芸香科植物资料[ J] .广西植物 ,1992(3):215-216.
[ 2] 傅荣昭 ,邵鹏柱,高文远,等.DNA 分子标记技术及其在药用植物研究
上的应用前景[ J] .生物工程进展 ,1998, 18(4):14-18.
[ 3] 马小军 ,汪小全,肖培根,等.人参农家类型的AFLP 指纹研究[ J] .中国
中药杂志 ,2000, 25(12):707-710.
[ 4] 陈永久 ,王文 ,杨跃雄 ,等.冬虫夏草的随机扩增多态 DNA及其遗传分
化[ J] .遗传学报 ,1997, 24(5):410-416.
[ 5] 任冰如 ,贺善安,於红,等.用 RAPD技术评估苍术居群间的亲缘关系
[ J] .中草药 ,2000, 31(6):458-461.[ 6] 黄璐琦 ,王敏 ,付桂芳 ,等.中药白芷种质资源的 RAPD分析[ J] .中国中
药杂志, 1999 ,24(8):157-159.
[ 7] 关萍, 马丹炜,王贵侠 ,等.利用 ISSR标记对天麻的贵州种群遗传多样
性分析[ J] .北京林业大学学报, 2007 ,29(6):35-40
[ 8] 周俊亚 ,唐绍清, 向悟生.栽培罗汉果遗传多样性的 ISSR分析[ J] .广
西植物, 2005 ,25(5):431-436.
[ 9] 李巧明 ,赵建立.云南干热河谷地区余甘子居群的遗传多样性研究
[ J] .生物多样性 ,2007, 15(1):84-91.
(下转第 14512页)
1443536卷33期　　　　　　　　　　　　　紫素芬等　芸香科药用植物 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
表2　不同入棚时间不同品种的见花期出现时间
Table 2　The appearing time of the flowering period of different cultivars with different time of entering the shed
入棚时间
Time of entering the shed
长寿冠
Changshouguan
长寿乐
Changshoule
复色海棠
Fusehaitang
银长寿
Yinchangshou
世界一
Shijieyi
第1批 The first batch 第52天 第 28天 第40天 第 42天 第87天第2批 The second batch 第27天 第 20天 第30天 第 35天 第80天
第3批 The third batch 第25天 第 17天 第25天 第 25天 第72天
表3　不同入棚时间不同品种春节前开花量比较
Table 3　The flower amount comparison among different cultivars with different time of entering the shed before the Spring Festival
入棚时间
Time of entering the shed
长寿冠
Changshouguan
长寿乐
Changshoule
复色海棠
Fusehaitang
银长寿
Yinchangshou
世界一
Shijieyi
第1批 The first batch 很少 较多 少 少 无
第2批 The second batch 多 多 多 多 无
第3批 The third batch 较多 多 多 多 无
表 4　不同品种催花温度与入棚时间
Table 4　The flower-forcing temperature and the time of entering the shed
of different cultivars
品种
Cultivars
温度∥℃
Temperature
催花时间
Flower-forcing
time
提前入棚时间∥d
Advanced time of
entering the shed
长寿冠 18～ 25 10月中旬 35
Changshouguan长寿乐 10～ 15 10月下旬 30左右
Changshoule复色海棠 18～ 15 10月下旬 15～ 20
Fusehaitang银长寿 18～ 25 10月中旬 35
Yinchangshou世界一 18～ 25 10月中旬 35
Shijieyi
2.2　不同品种的最佳催花技术　不同品种的催花温度与入
棚时间及最佳催花时间见表 4。温室内应经常保持空气湿
润 ,空气湿度不能低于 50%,故应经常喷水。应当注意的是 ,
喷水时切不可直接喷于花蕾或花朵上 ,这样会使健康的花蕾
或花朵很快枯萎。
2.3　冬季催花对木瓜海棠花色的影响(表 5)　催花试验中
发现 ,冬季经温室催花后 ,木瓜海棠颜色都有所变化 ,但无论
哪个品种 ,经催花处理后其花色都更娇嫩 ,更具观赏价值。
2.4　生长调节剂对促进木瓜海棠开花的影响　试验结果经
分析表明 ,生长调节剂对促进木瓜海棠开花的效果不明显。
表 5　不同品种催花后花蕾/花色变化比较
Table 5　The flower bud and color changes comparison among different cultivars after forcing the flowering
条件
Conditions
长寿冠
Changshouguan
长寿乐
Changshoule
复色海棠
Fusehaitang
银长寿
Yinchangshou
世界一
Shijieyi
自然条件 深红/鲜色 粉红/红色 粉红/红色 绿白/象牙白 粉红/红色
Natural conditions
温室催化 红色/亮红 粉白色/黄红色 淡红/粉红 绿色/白色 绿白/象牙白
Forcing in greenhouse
3　结论与讨论
由试验观察结果可知 ,催花不仅需一定的温度 ,每个品
种还必须具备经过充分低温处理的条件。早开类需冷量少 ,
所经低温处理时间短;中 、晚开类需冷量多 ,所经低温处理时
间也相应长 。
木瓜海棠夏季即完成花芽分化 ,具备在春节提前开花的
生理条件。木瓜海棠在入温室前必须在室外接受一定的低
温处理才能充分打破休眠 ,提前开花。品种不同 ,需冷量多
少也不相同。木瓜海棠在经过充分的低温处理下 ,温度达到
10～ 25 ℃即能提前开花。在相同温度处理下 ,品种不同 ,其
提前开花的时间也不同 。影响木瓜海棠花期调控的诸多因
素中温度是关键 。在保持室内空气湿润的情况下 ,即可在家
中 ,在春节期间 ,欣赏木瓜海棠娇艳的花姿。
参考文献
[ 1] 中国树木志编委会.中国主要树种造林技术(下册)[M] .北京:农业出
版社, 1978:677.
(上接第 14435页)
[ 10] 彭瑜 ,王劲,胡进耀 ,等.柚 ISSR-PCR反应体系的建立与优化[ J] .西华
师范大学学报 ,2007, 28(3):225-228.
[ 11] ZIETICWIEZ E, RAFALSKI A , LABUDA D.Genome fingerprinting by simple
sequence repeats(SSR)anchored polymerase chain reaction amplification[ J] .
Genomics ,1994, 20:176-183.
[ 12] 冯富娟,王凤友 ,刘彤.红松 ISSR-PCR实验系统影响因素[ J] .植物学
通报, 2004 ,21(3):326-331.
[ 13] YU J F ,BAO F ,HAN X L , et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR
system in Trachidermus fasciatus heckel[ J] .Agricultural Science &Technolo-
gy ,2008, 9(5):37-39, 95.
[ 14] 邱长玉,高国庆,陈伯伦 ,等.茉莉花 ISSR-PCR反应体系的建立[ J] .北
方园艺 , 2008(2):214-217.
14512 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年