全 文 ：第 32 卷 第 6 期
2013 年 6 月
实 验 室 研 究 与 探 索
ＲESEAＲCH AND EXPLOＲATION IN LABOＲATOＲY
Vol． 32 No． 6
Jun． 2013
ITS标记用于松科植物分子谱系研究的可行性
李世兰1， 邢 猛1， 隋 心2， 冯富娟1
(1． 东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040;
2． 中国科学院 沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016)
摘 要:提取伊春市和长白山的红松 DNA和东北林业大学的 3 种松科植物 DNA，利用 ITS 序列分析技
术研究其遗传多样性。测序后通过和 GenBank 中序列比对，采用最大简约法(Maximum Parsimony，
MP)、最小进化法(Minimum Evolution，ML)和邻位相接法(Neighbor Joining，NJ)构建系统发育树。结果
显示，红松、樟子松、黑皮油松被分为一组;花旗松、欧洲冷杉、黑云杉、金钱松被分为另一组;而长白落叶
松单独分了出来。用以上结果与以往的研究进行比较，以探讨 ITS 标记用于松科植物分子谱系研究的
可行性。
关键词:松科;ITS序列;植物分子谱系
中图分类号:Q 949;Q 75 文献标志码:A 文章编号:1006 － 7167(2013)06 － 0043 － 04
ITS Molecular Markers for Phylogenetic Analysis of Pinaceae
LI Shi-lan1， XING Meng1， SUI Xin2， FENG Fu-juan1
(1． Department of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040;2． Institute of Applied Ecology，
Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China)
Abstract:The Pinus koraiensis genomic DNA in two different regions and the genomic DNA of three sonko plants in
Northeast Forestry University were extracted using ITS molecular markers to study genetic diversity． After the sequencing
and comparison in the GenBank，the phylogenetic tree were constructed by sequence maximum parsimony (Maximum
Parsimony，MP)，minimum evolution method (Minimum Evolution，ML)and the o-phase methods (Neighbor Joining，
NJ)，respectively． It turned out that Pinus koraiensis，Pinus sylvestnis and Pinus tabulaeformis，havig quite similar
sequences were divided into a group，while Pseudotsuga menziesii，Abies alba，Picea mariana and Pseudolarix amabilis
were divided into a group，and Larix olgensis was divided into another group． By comparing the results with previous
studies，the possibility of ITS molecular markers for Phylogenetic Analysis of Pinaceae was explored．
Key words:Pinaceae;ITS sequence;phylogenetic analysis
收稿日期:2012 － 07 － 23
作者简介:李世兰(1986 －)，女，河南郑州人，硕士生，主要研究方
向为分子生物学。Tel．:18745729687;E-mail:lishilan929108@ 163． com
通信作者:冯富娟(1972 －)，女，黑龙江哈尔滨人，教授，博士生导
师，主要从事生态学研究。Tel．:13796628587;E-mail:ffj9018@ sina． com
0 引 言
松科(Pinaceae)植物是现存裸子植物中种类最
多、分布最广、占据森林面积和木材蓄积量最大的类
群［1］，是主要森林树种，具有巨大的生态和经济价
值［2］。该科含 10 属约 230 种，是裸子植物中种类最多
的世界性分布大科，在科学上和生产上都有极重要的
意义［3］。
对于松科植物的分类研究已有不少，其中包括根
据其性状特征建立松科的分类系统［4］;从核型资料看
松科各属的进化水平和亲缘关系［3］;运用 PCＲ-ＲFLP
方法对松科植物的 rbcL-accD 基因片段进行分析，探
讨松科植物的属间关系［5］。此外，对于松科属间亲缘
关系的研究方法还包括对于其化学成分研究的方
法［6］，对于花粉形态［7］研究的方法，运用植物化学的
方法，运用解刨学的方法［4］，运用免疫学方法［5］以及
松科地理分布的研究［8］等等。
核糖体上的基因为多拷贝、中度重复序列，一个重
实 验 室 研 究 与 探 索 第 32 卷
复单位由 5． 8S、18S、26S编码区以及一些间隔区组成。
ITS(Internal Transcribed Spacer)区位于 18S 和 26S 基
因之间，中部被 5． 8S一分为二，即 ITS1 区与 ITS2 区。
5． 8S、18S、26S进化速率慢，常用于探讨科级和科级以
上等级的系统发育问题［9］。而间隔区如 ITS区进化速
率较编码区快，一般用于研究较低等级如属间、种间甚
至居群间的系统关系［10］。而 ITS 分子标记方法在松
科属间的亲缘关系研究还很少有过报道。
本研究利用 ITS分子标记法对松科中的长白落叶
松(Larix olgensis)、黑皮油松(Pinus tabulaeformis)、樟
子松(Pinus sylvestnis)、红松(Pinus koraiensis)以及欧
洲冷杉(Abies alba)、黑云杉(Picea mariana)、金钱松
(Pseudolarix amabilis)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)6
个属 8 种植物进行种间亲缘关系的研究，以探讨 ITS
标记用于松科植物分子谱系研究的可行性。
1 材料与方法
1． 1 材 料
本研究中红松分别是取自伊春市新青林业局和长
白山露水河林业局的天然红松林，樟子松、黑皮油松、
长白落叶松均为取自东北林业大学实验林场的天然红
松林。均采集新鲜的 1a生针叶为材料，于 － 20℃冰箱
保存备用。此外，从 Genebank 中查到的花旗松、欧洲
冷杉、黑云杉、金钱松的 ITS1 序列。种名及收录序列
号分别为:长白落叶松 (JX173184)，黑皮油松
(JX173185);樟 子 松 (JX173186);红 松 (伊 春)
(JX173187);红松(长白山) (JX173188);花旗松
(AF041353 );欧 洲 冷 杉 (JN177292 );黑 云 杉
(AY563395);金钱松(AY570229)。
(1)DNA 的提取。采用改良的 CTAB 法［11］提取
DNA。提取后用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的浓
度、纯度，置于 － 20℃冰箱中保存备用。
(2) PCＲ 扩增。 ITS 序列引物为 ITS1 (5-
AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3) 和 ITS2 (5-
GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)［12］。
PCＲ反应体系:总体积为 20 μL，10xBuffer2 μL，
dNTPs1． 5 μL(25 mmol /L)，引物各 2 μL(10 μmol /L)，
0． 3U Taq DNA聚合酶，DNA 模板 2 μL，无菌去离子
水补足 20 μL。
PCＲ扩增程序为:95℃预变性 5 min;95℃变性 30
s，59℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，72℃延伸 7 min，35
个循环。PCＲ 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检
测。
(3)PCＲ产物的切胶、纯化、测序。ITS 基因扩增
得到的 PCＲ产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳切胶分离后，
用 DNA凝胶回收试剂盒(天根公司)回收纯化，将纯
化所得产物送至上海生物工程公司测序。
1． 2 实验数据的处理及系统发育树构建
采用 ClustaX(1． 8)软件［13］对本研究所测序列进
行比对。用 MGEA4． 0［14］计算各样本的 ITS 基因序列
间的遗传距离;用最小进化法(ME)、最大简约法
(MP)和邻位相接法(NJ)分别构建系统发生树。
2 结果与分析
2． 1 2 个种源间的 ITS1 序列比对
2 个种源间的 ITS1 序列比对情况见图 1。从图 1
可以看出，伊春市新青区的红松与长白山露水河的红
松 ITS1 序列几乎完全一致，没有发生突变。
图 1 2 个种源红松 ITS1 序列比对图
2． 2 基于 ITS序列的系统发育关系分析
采用 Mega4． 0 软件，基于 Kimura 2-paramenter 参
数对 ITS基因序列数据进行分析。统计各个种序列间
的遗传距离(见表 1)。
用 MP对 8 个样本进行聚类分析，所得系统树见
图 2。发现 8 种松科植物组成的聚类树分支很多。
在研究 MP 树之外，还用 ME (见图 3)和 NJ (见
图 4)构建了 2 种聚类树，结果发现 ME、NJ 这 2 种聚
类图总的拓扑结构比较接近，与 MP 的聚类情况差别
较大。
在 3 种聚类树中，长白落叶松均是自成一个枝干，
没有和其他聚在一起。而在 ME、NJ 这 2 种聚类树看
出，红松、樟子松、黑皮油松聚在一起，然后花旗松、欧
洲冷杉、黑云杉、金钱松聚在了一起。而在 MP聚类树
中，花旗松和黑云杉聚在一起，樟子松、黑皮油松和红
松聚在一起，而后又与欧洲冷杉、金钱松聚在一起。从
3 种聚类树的总体来看，樟子松、黑皮油松和红松分为
了一组，花旗松和黑冷杉分为了一组，而金钱松和欧洲
44
第 6 期 李世兰，等:ITS标记用于松科植物分子谱系研究的可行性
冷杉则分组不是很明确。
表 1 Kimura 2-paramenter模式的遗传距离
花旗松 欧洲冷杉 金钱松 黑云杉 长白落叶松 黑皮油松 樟子松 红松
花旗松
欧洲冷杉 0． 347
金钱松 2． 549 2． 004
黑云杉 2． 776 2． 183 0． 011
长白落叶松 0． 493 0． 504 0． 817 0． 940
黑皮油松 1． 179 1． 720 6． 541 6． 791 2． 851
樟子松 0． 608 0． 276 3． 720 3． 937 1． 407 0． 907
红松 5． 631 4． 817 1． 302 1． 078 2． 981 9． 504 6． 817
图 2 基于 ITS1 区基因序列构建 MP树
(各分支上的数字为 Bootstrap1 000 次的自检验值)
图 3 基于 ITS1 区基因序列构建 ME树
图 4 基于 ITS1 区基因序列构建 NJ树
3 讨 论
伊春市新青区与长白山露水河两地的红松 ITS1
序列的比对结果几乎完全一致(见图 2)，这也印证了
ITS序列在同一物种上的的保守性。ITS作为 rDNA中
的非转录编码区，具有高度的保守性，受环境因素影响
较小［11］。在属间亲缘关系比较上，一些属、种的地理
分布区域很广，以致形成差别较大的地理种源，在性状
上产生较大差异，这将会影响分类结果［15］。而 ITS 具
有高度的保守性，受环境因素影响较小［11］，在一定程
度上克服了种源差异造成的问题。本文中两地的红松
ITS1 序列的基本一致也说明了这一点。
从 3 种聚类树来看，8 种松科植物中樟子松、黑皮
油松和红松比较亲近，此 3 种也均为松属植物;花旗松
和黑云杉松较为亲近，花旗松为黄杉属植物，黑云杉为
云杉属植物;而长白落叶松却没有和其他聚在一起，自
己分出一支，长白落叶松为落叶松属植物。从 MP 聚
类树看出，欧洲冷杉、金钱松与樟子松、黑皮油松、红松
这一分支聚在一起，欧洲冷杉为冷杉属，金钱松为金钱
松属。而在 ME、NJ 两种聚类树看出，欧洲冷杉、金钱
松与花旗松、黑云杉的关系较近。从属间关系分析，3
种聚类树得出黄杉属和云杉属较为亲近，ME、NJ 树显
示出冷杉属、金钱松属与黄杉属、云杉属稍亲近些。
松科各属关系有过许多报道，其中有将其划分出
亚科，一种是将松科分为 2 个亚科;另一种是分为 3 个
亚科。即使是将其分为 3 亚科的研究结果也是不尽相
同，每个亚科所包括的属也是意见不一的。划分亚科
的方法也有很多，其中包括根据其性状特征建立松科
的分类系统［4］，此分类是将松科分为 3 个亚科，其中铁
杉属、油杉属、金钱松属、冷杉属、雪松属为冷杉亚科，
落叶松属、黄杉属、银杉属、云杉属为落叶松亚科，松科
为松亚科。此种分类与本实验的结果较为相符，其中
黄杉属和云杉属比较亲近，而从 ME 树看出冷杉属与
金钱松属较为亲近。根据所观察的传粉类型的方
法［4］中则同样是将云杉属、黄杉属分为一组，冷杉属、
金钱松属为一组，只是松属也被加到了前者组中。
Van Tieghem 根据幼根维管柱中的树脂道位置和数
目［4］将松科分成雪松组和松组，前者包括冷杉属、雪
松属、油杉属、金钱松属和铁杉属;后者包括落叶松属、
黄杉属、云杉属和松属，也是将云杉属和黄杉属分在一
组，冷杉属和金钱松属为一组。
而本文中的落叶松属却与其他属的植物关系较
远，值得商榷，本文只是对 ITS 在松科分类上做出尝
试，倘若能进行大量的 ITS 序列比对以及考虑多方面
因素，那么对松科的分类会更加的科学、严谨。而本文
54
实 验 室 研 究 与 探 索 第 32 卷
对 6 个属 8 个种的 ITS序列的比对以及构建 3 种聚类
树也对它们之间的亲缘关系给与了一定的比较，如果
松科中划分出不同亚科的时候再把 ITS 序列的比较添
加进去，则结果也会更加准确。
本研究结果表明，ITS 标记是用于松科植物分子
谱系研究十分有效而可靠的方法，松科植物 ITS 序列
的开发给其属间、种间亲缘关系的比较研究上带来了
很大的帮助。
参考文献(Ｒeferences):
［1］ 李 楠． 论松科植物的地理分布、起源和扩散［J］． 植物分类学
报，1995，33(2):105-130．
［2］ 王荷生． 中国松科植物的分布型和区系分析［J］． 植物研究，
2000，20(1):12-19．
［3］ 李林初．松科的核型和系统发育研究［J］． 植物分类学报，1995，
33(5):417-432．
［4］ 李 楠，傅立国，朱政德． 松科系统学研究［J］．植物研究，1996，
16(1):32-45．
［5］ 汪小全，韩 英，邓峥嵘，等． 松科系统发育的分子生物学证据
［J］．植物分类学报，1997，35(2):97-106．
［6］ Niemann G J，Some aspects of the chemistry of Pinaceae needles
［J］． Acta Bot Neerl，1979，28(1):73-88．
［7］ 张金谈．中国松科花粉形态研究［J］． 植物研究，1989，9(3):87-
95．
［8］ 应俊生．中国裸子植物分布区的研究(l)松科植物的地理分布
［J］．植物分类学报，1989，27(1):27-38．
［9］ Soltis D E，Soltis P S，Nickrent D L，et al． Angiosperm phylogeny
inferred from 18S ribosomal DNA sequences［J］． Ann Missouri Bot
Gard，1997，84:1-49．
［10］ 赵志礼，徐珞珊，董 辉． 核糖体 DNAITS 在植物分子系统学研
究中的价值［J］．植物资源与环境学报，2000，9(2):50-54．
［11］ Clark M S． 植物分子实验手册［M］． 北京:高等教育出版社，
1998:3-11．
［12］ 吕艳芳．利用 ISSＲ分子标记和 rDNA 的 ITS 序列研究五针松亲
缘关系［D］．哈尔滨:东北林业大学，2004．
［13］ Thompson J D，Gibsonl T J，Plewniak F，et al． The CLUSTAL_X
windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment
aided by quality analysis tools［J］． Nucleic Acids Ｒes，1997，24:
4876-4882．
［14］ Kumar S，Tamura K， Jakobsen IB， et al． MEGA2:molecular
evolutionary genetics analysis software［J］． Bioinformatics，2001，17
(12):1244-1245．
［15］ 陈天华，赖焕林，李宽红，等． 松科植物属间核型进化关系初探
［J］．南京林业大学学报，1992，16(2):
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
37-41．
(上接第 7 页)
体积分数 31%，提取温度 36℃，提取时间 60 min，GSH
得率为(0． 257 ± 0． 001)%。该工艺作用条件温和、时
间短、不需要复杂和贵重的仪器，易于放大，非常适合
于工业化大规模生产，为酿造酒工业产生的废酵母泥
再利用提供理论依据。
参考文献(Ｒeferences):
［1］ Li Y，Wei G Y，Chen J． Glutathione:a review on biotechnological
production［J］． Appl Microbiol Biotechnol，2004，66:233-242．
［2］ 贾 贞，王丹，游 松．谷胱甘肽的研究进展［J］． 沈阳药科大学
学报，2009，26(3):238-242．
［3］ 杨培慧，齐剑英，冯德雄，等．谷胱甘肽的应用及其检测方法［J］．
中国生化杂志，2009，23(1):52-54．
［4］ 徐丽萍，杨春华，王 鑫． 响应曲面法优化玉米胚中谷胱甘肽提
取工艺条件［J］．中国粮油学报，2010，25(5):15-18．
［5］ Wu X T，Tang L M ，Du Y M，et al． Improving glutathione
extraction from crude yeast extracts by optimizing aqueous two-phase
system composition and operation conditions［J］． Korean Journal Of
Chemical Engineering，2010，27(6):1829-1835．
［6］ 马德功，崔文文．啤酒废酵母中还原型谷胱甘肽提取［J］．中国食
品添加剂，2008(4):139-142．
［7］ 衣海龙，郭玲玲，张 巍，等． 啤酒酵母泥的综合利用［J］． 酿酒，
2009，36(6):86-87．
［8］ 范崇东，王 淼，徐榕榕．热水提取酵母中谷胱甘肽的条件优化
［J］．食品工业科技，2004，25(2):132-134．
［9］ 安贤惠． 还原型谷胱甘肽提取方法初探［J］． 淮海工学院学报，
2003，12(2):49-52．
［10］ Xiong Z Q，Tu X Ｒ，Tu G Q． Optimization of medium composition
for actinomycin X2 production by Streptomyces spp JAU4234 using
response surface methodology ［J］． J Ind Microbiol Biotechnol，
2008，35:729-734．
［11］ Wen S H，Zhang T，Tan T W． Optimization of the amino acid
composition in glutathione fermentation［J］． Process Biochemistry．
2005，40:3474-3479．
［12］ Bradford M M． A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding［J］． Analytical Biochemistry，1976 ，72:248-254．
［13］ Xiong Z Q，Guo M J，Guo Y X，et al． Efficient extraction of
intracellular reduced glutathione from fermentation broth of
Saccharomyces cerevisiae by ethanol ［J］． Bioresource Technology．
2009，100:1011-1014．
［14］ 应 芝，励建荣，韩晓祥． 响应面分析法优化桑叶多糖提取工艺
的研究［J］．中国食品学报，2008，8(4):39-45．
［15］ 舒 嫒，王家骐，朱立江，等． 酵母中还原型谷胱甘肽的提取方
法研究［J］．发酵科技通讯，2008，37(3):16-19．
64