全 文 ：收稿日期:2012 － 02 － 27
基金项目:北京市自然科学基金项目(编号:6072014)。
作者简介:邓 莲(1982 －) ，女，河北人;硕士，工程师，主要从事兰科植
物栽培与种质资源保护工作。
通讯作者:张 毓，博士，高级工程师;E-mail:bjyzhang@ hotmail． com。
濒危兰科植物大花杓兰种子非共生萌发的研究
邓 莲， 张 毓， 王苗苗， 赵世伟
(北京市植物园， 北京 100093)
摘要:以北京地区自然居群的大花杓兰蒴果为研究材料，对大花杓兰种子进行了非共生萌发研究。种子成熟度是影响大
花杓兰种子萌发的关键因子:授粉后第 6 ～ 8 周，种皮呈透明至浅褐色，体式显微镜下可见白色球形胚时，种子萌发率较
高;种子过于幼嫩或成熟均不易萌发。VWD改良培养基上种子萌发最好，萌发率可达 68． 06%。培养基中加入1． 2 mg /L
的 KT可以促进种子萌发，并维持低褐化率，是适宜大花杓兰萌发的激素浓度。培养基中加入100 mL /L椰乳或 100 g /L
马铃薯有利于大花杓兰种子的萌发及生长。
关键词: 兰科;大花杓兰;种子萌发;非共生
中图分类号: S 685 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2012)06-0031-05
Study on Non-Asymbiotic Germination of Cypripedium macrathos Seed
DENG Lian，ZHANG Yu，WANG Miao-miao，ZHAO Shi-wei
(Beijing Botanic Gardens，Beijing 100093，China)
Abstract:To maximize the in vitro seed germination of Cypripedium macrathos，the optimum time of seed
collection，the suitability of culture medium，phytohormone and natural aqueous extracts were studied． The
results showed that the seeds had higher germination rate when it was collected at 6 － 8 weeks after pollina-
tion，testa color was white to light brown，and white globular embryo could be seen under the stereomicroscope．
The improved VWD culture medium was the best for seed germination． KT 1． 2 mg /L could promoted seed
germination，and retained low browning rate． 100 mL /L coconut milk or 100 g /L potato stimulated seed
germination and growth．
Key words: orchidaceae;Cypripedium macrathos;seed germination;Non-asymbiotic
大花杓兰(Cypripedium macrathos)为兰科杓兰属
植物，地生兰，多生于林下、林缘或灌木草坡的阴湿但
排水良好的地方。在我国主要分布于黑龙江、吉林、辽
宁、内蒙古、河北、山东和台湾，日本、朝鲜半岛、西伯利
亚至欧洲东部也有分布［1］。数十年来，由于资源过度
开发，以及人类活动造成的环境恶化、栖息地丧失，我
国大花杓兰自然种群处于严重濒危状态［2］。2008 年
北京市政府已将大花杓兰列入一级保护植物名录。因
此，亟需对这一濒危物种进行保育研究。一般认为，种
子无菌萌发技术是进行兰花保育的一种实用、有效的
技术［3］。
尽管一些兰科植物的种子非共生萌发取得了成
功［4］。但温带地生兰非共生萌发往往更加困难，因为
其萌发条件更严格，而且这些萌发条件常因属或种而
异［5］。欧美地区较早开始了杓兰属植物种子的萌发
研究，C． reginae 和 C． candidium 种子非共生萌发取得
了成功［6，7］。目前，我国已有关于黄花杓兰和紫点杓
兰种子非共生萌发的报道［8，9］，但大花杓兰的相关研
究较少。本试验研究比较了大花杓兰种子在不同采种
时期和培养条件下的萌发率差异，以期获得最佳采种
时期和优选培养条件，为大花杓兰的保育研究提供技
术支持。
1 材 料
大花杓兰(Cypripedium macranthos )在华北地区
生长于海拔较高的冷凉山区。本试验所用的材料取自
北京市百花山自然保护区内海拔 1 700 m 左右的大花
杓兰野生居群植株。6 月大花杓兰盛开时进行人工授
粉，根据授粉时间进行采样。
2 方 法
2． 1 灭菌方法
未开裂的蒴果:未开裂的蒴果是封闭的，里面种子
是洁净无菌的，所以只需对整个种荚灭菌即可。先小
·13·
研究报告 邓 莲 等:濒危兰科植物大花杓兰种子非共生萌发的研究
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2012.06.064
图 1 大花杓兰种子不同发育阶段的形态观察
心切除多余的果柄、宿存的干枯花瓣等多余部分，用牙
刷沾上肥皂仔细刷洗种荚外表面，流水冲洗 30 min;
75%酒精中浸泡 30 s，无菌水冲洗 3 次;2%次氯酸纳
溶液中浸泡 15 min，用无菌水冲洗 3 次，最后用无菌解
剖刀切开以备播种用。
开裂的蒴果:种子成熟时种荚已经开裂。灭菌前
要先将种荚外部用酒精棉擦拭干净，将种子从开裂的
棕色种荚中轻轻抖出，放入无菌试管中;于超净工作台
内加入 75%酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗 3 次;1%的次
氯酸钠浸泡 15 min，无菌水冲洗 3 次;用无菌滤纸吸干
多余水分备用。
2． 2 试验设计
2． 2． 1 不同发育阶段对种子萌发的影响
据野外观察，北京百花山地区大花杓兰从授粉到
种子成熟大约需要 14 周的时间。授粉后第 4 周至 14
周每 2 周进行种荚取样和无菌播种，各采样时间选用
4 种改良培养基进行试验，各培养基重复 5 次。播种
后每周调查种子萌发率，以种胚突破种皮为萌发标准。
取最大萌发率进行数据分析。
2． 2． 2 不同基本培养基对种子萌发的影响
以萌发最好的授粉后第 8 周种子进行试验。共选
用 4 种培养基:MS 改良培养基、KC 改良培养基、
Harvais改良培养基、VWD 改良培养基(分别在 MS、
KC、Harvais和 VWD 基本培养基中加入 0． 5 mg /L 活
性炭和 100 mL /L椰乳进行改良) ;pH 值 5． 8。各培养
基重复 5 次。播种后每周调查种子萌发率。
2． 2． 3 不同激素浓度对种子萌发及生长的影响
采用萌发较好的授粉后第 8 周种子进行试验，基
本培养基为 VWD，选用激素浓度分别为 KT 0． 3、0． 6、
1． 2、2． 4 mg /L，所有的培养基中均加入 0． 5 mg /L活性
炭和 100 mL /L 椰乳，pH 值 5． 8。各激素浓度重复 5
次。播种后每周统计萌发率，取最大萌发率进行数据
分析。
2． 2． 4 不同有机添加物对种子萌发的影响
采用授粉后第 8 周种子进行试验。VWD 基本培
养基中分别加入 100 mL /L 椰乳、100 mL /L 香蕉匀浆
或 100 g /L 0． 5 cm × 0． 5 cm 马铃薯块，均加入 0． 5
mg /L活性炭，pH值 5． 8。各添加物重复 5 次。播种后
每周统计萌发率。
·23·
第 31 卷 第 6 期 2012 年 6 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 6 May． 2012
2． 3 培养条件
播种后黑暗条件下培养，培养温度为 20 ℃。
3 结果与分析
3． 1 不同发育阶段种子形态观察
大花杓兰授粉后第 4 周种子十分幼嫩，体积小，紧
贴在胎座上，种皮透明;体式显微镜下观察不到成形的
球形胚。授粉后第 6 周种子开始开散，种皮透明至浅
黄色;体式显微镜下可见白色球形胚，部分胚轮廓不清
晰。授粉后第 8 周部分种子已经开散，种皮从浅黄色
过渡至浅褐色;体式显微镜下能清楚地观察到球形胚。
授粉后第 10 周、12 周及 14 周的种子为褐色，完全开
散;体式显微镜下可见种皮上有褐色网状，能清楚观察
到球形胚。
3． 2 不同发育阶段取样对种子萌发的影响
大花杓兰授粉后第 4 周种子紧密着生在胎座上，
很难将种子从胎座上分离下来;播种后种子及附着的
胎座组织迅速褐化，不能萌发。授粉后第 6 周，种子萌
发率较高，为 19． 85% ～ 37． 19%;此时期种荚内种子
没有完全松散，播种时部分种子附着在胎座组织上。
授粉后第 8 周，种子萌发最好，萌发率为 25． 96% ～
68． 06%;此时期种荚内种子完全松散，播种时可以均
匀地分布于培养基上，易于播种及计数。其中，授粉后
第 8 周 VWD改良培养基上萌发率最高，为 68． 06%。
授粉后第 10 周，种子萌发率迅速下降，萌发率最高仅
为 6． 46%。授粉后 12 周至 14 周(种子成熟) ，种子不
能萌发(图 2)。
图 2 不同发育阶段对未成熟种子萌发的影响(2008 年)
3． 3 不同培养基对种子萌发的影响
由图 3 可知，在试验所用的 4 种培养基上，播种后
14 d时种子开始萌发;播种后 49 d 时多数种胚开始分
化，萌发率达到最高值。MS改良培养基和 KC 改良培
养基上种子萌发率较低，最高萌发率分别为 25． 96%
和 28． 50%。Harvais改良培养基和 VWD 改良培养基
上种子萌发率较高，最高萌发率分别为 60． 22% 和
68． 06%。其中，VWD 改良培养基上种子在播种后
14 ～ 28 d迅速萌发，萌发较为整齐。
图 3 不同培养基对未熟种子萌发的影响(2008 年)
3． 4 不同激素浓度对种子萌发及生长的影响
大花杓兰种子不添加任何激素即可萌发，但萌发
率较低，为 9． 09%。培养基内添加 KT 可以提高种子
萌发率，且随着 KT 浓度的提高萌发率也相应提高。
添加 KT 2． 4 mg /L的培养基上种子萌发率最高，是未
添加激素处理的 3． 3 倍;但原球茎褐化率迅速提高至
4． 79%。培养基添加 KT 1． 2 mg /L后可以促进种子萌
发，并维持低褐化率，是较适宜大花杓兰萌发的激素浓
度。此外，激素的加入对原球茎的进一步分化有较大
影响，添加 KT 0． 6 ～ 2． 4 mg /L后原球茎开始分化的时
间比对照提前了 42 d(表 1)。
表 1 不同激素浓度对授粉后第 8 周种子萌发及
生长影响(2009 年)
激素浓度
(mg /L)
萌发率
(%)
褐化率
(%)
分化时间
(d)
ck 9． 09 1． 24 126
KT 0． 3 14． 62 1． 52 112
KT 0． 6 19． 73 1． 85 84
KT 1． 2 22． 91 1． 39 84
KT 2． 4 30． 30 4． 79 84
3． 5 不同添加物对种子萌发影响
试验结果表明，培养基中添加适当的有机添加物
可以促进大花杓兰种子的萌发(图 4)。未添加有机添
加物的培养基上，播种后 14 d 种子开始萌发，播种后
42 d萌发率最高，随后萌发率变化不大。添加土豆或
椰乳后，种子萌发率均高于对照，其最大萌发率分别比
对照提高了 38． 48%和 55． 19%;种子萌发趋势与对照
相似。添加香蕉匀浆后，虽然播种前期(14 ～ 28 d)种
子萌发率高于其他添加物;但播种 35 d 后原球茎开始
出现褐化死亡，萌发率下降。
·33·
研究报告 邓 莲 等:濒危兰科植物大花杓兰种子非共生萌发的研究
图 4 不同添加物对大花杓兰种子萌发的影响(2008 年)
4 讨 论
部分兰科植物存在未成熟种子可以萌发，而成熟
种子不易萌发的问题。本试验研究表明，发育阶段是
影响大花杓兰种子萌发的关键因子:授粉后第 6 周至
第 8 周采样，种皮透明至浅褐色，体式显微镜下可见白
色胚时，种子萌发率较高;种子过于幼嫩或成熟均不易
萌发。这与 C． reginae、黄花杓兰(C． flavum)、台湾杓
兰(C． formosanum)研究结果相似［6，8，10］。有研究认为，
成熟种子内有某些次生代谢物质抑制了种子萌发［11］，
也有人认为，内种皮的存在导致成熟种子萌发困
难［10］。张毓等研究表明，大花杓兰授粉后第 6 周种子
胚发育成具有萌发潜力的原球胚(早期球形胚阶段) ;
第 10 周后种子内珠被发育成的内种皮形成一层致密
的干膜质结构紧贴于球形胚［12］。本试验中授粉后第
6 ～ 8 周种子萌发率较高;而授粉后第 10 周萌发率显
著降低，可以推测授粉后第 10 周种子内形成的致密内
种皮是导致大花杓兰成熟种子萌发困难的原因之一。
本试验中，大花杓兰种子在不同培养基上，萌发率
有一定差异;MS 改良培养基和 KC 改良培养基不利于
种子萌发;VWD改良培养基上种子萌发率最高，且萌
发较为整齐。Lee 等研究认为，不同基本培养基对台
湾杓兰(C． formosanum)种子萌发影响不显著［10］。黄
家林等研究表明，使用 VWD 及 Harvais 培养基利于黄
花杓兰(C． flavum)未熟种子萌发;而 MS 培养不利于
其萌发，且形成的原球茎容易死亡［8］。De Pauw 等研
究认为，C． reginae 不同培养基间种子萌发无显著差
异，C． calceolus var． parviflorum 和 C． candidum 不同培
养基间种子萌发差异显著［6］。可见，杓兰属内不同种
的植物种子萌发对培养基的要求不同。
许多研究表明，6 BA、IAA、NAA和 KT等生长调节
剂单独或配合使用对兰花种子萌发有促进作用。春兰
种子非共生萌发中，添加植物激素的培养基上种子萌
发率明显高于不含植物激素的培养基，尤以添加了
6 BA的表现显著［13］。曾宋君等认为，兜兰的无菌播种
一般不需要添加植物生长调节剂，萌发的原球茎能发
育成小苗，添加合适浓度的植物生长调节剂能促进原
球茎的增殖［14］。在黄花杓兰未熟种子萌发中，外源细
胞分裂素起到了明显促进萌发的作用，而且低浓度的
KT和 BA即可使种子萌发率成倍提高［8］。本试验中，
不添加激素大花杓兰种子可以萌发，但萌发率较低;
KT可以提高种子萌发率，但高浓度 KT 会导致原球茎
褐化及死亡加剧;综合考虑 KT 1． 2 mg /L 为适宜的激
素浓度。
兰科植物组织培养时常常添加各种有机物，促进
培养物的生长与分化。常用的添加物有椰乳、马铃薯、
椰汁、香蕉、苹果等等。椰乳中含有较多的蛋白质、硫
胺素、核黄素、抗坏血酸、钾、钠、钙、镁、磷等营养成分。
马铃薯中含有蛋白质、硫胺素、维生素 C、维生素 E、维
生素 A、磷、钾等［15］。虽然添加物成分复杂，难以确定
其有效因素，但效果显著，在生产上有较高的应用价
值。有研究认为，大苞鞘石斛在不添加椰子乳的培养
基中，种胚基本不能萌发［16］。曾宋君等研究发现，一
定浓度的椰乳、香蕉泥、马铃薯等都对石斛兰胚萌发、
成苗、生根有促进作用［17］。本试验中，培养基中添加
100 mL /L椰乳或马铃薯有利于大花杓兰种子的萌发;
添加香蕉后，播种前期种子萌发较快，但后期原球茎容
易出现褐化死亡。
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(下转第 39 页)
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第 31 卷 第 6 期 2012 年 6 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 6 May． 2012
3． 4 PAGE胶分离与银染
选择性扩增产物的显示是通过变性 PAGE胶的分
离来实现的。首先，玻璃板要清洗干净，亲和硅烷与剥
离硅烷涂抹均匀，清洗和涂抹注意要分开操作，及时更
换手套。在制备 PAGE胶时，一定要充分搅拌均匀，通
过抽真空去除溶液中的空气，使胶聚合均匀，灌胶时避
免气泡产生。插入鲨鱼齿梳时，保证胶面平直，两侧用
夹子夹紧，否则加样时样品易向周围孔渗漏，电泳时条
带易倾斜。预电泳前，将玻璃板边缘析出的尿素及残
胶清洗干净，避免点样时样品加不进去。预电泳时间
控制在 30 min左右。使胶板温度达到 45 ～ 50 ℃，低于
此温度，条带可能模糊不清，温度过高则会出现弥散
带。上样前，样品要充分变性，变性后迅速放置冰上。
插梳子前将胶面上清洗干净，保证点样孔的洁净。
PAGE 胶分离结果通过快速银染的方法来进行，
操作前注意硝酸银应充分溶解，显影液应事先预冷。
染色时注意遮光，染色结束后水洗动作一定要迅速，时
间过长胶面背景中会出现黑点，影响显影。显影时加
入预冷的显影液，反之背景容易变深，不易观察谱带;
显影时间要把握得当，过短条带模糊，甚至分子量较小
的 DNA片段不能显现，而显影时间过长则胶背景太
深。本试验结果表明，水稻 cDNA-AFLP 选扩产物 8 ～
12 min即可充分显影。该试验找到了适合于水稻叶片
cDNA-AFLP的反应体系，为日后抗高温基因的筛选、
克隆和功能分析等奠定了基础。
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研究报告 许锦彪 等:水稻叶片 cDNA-AFLP技术体系的建立和优化