全 文 ：第 39卷 第 1期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.39No.1
2011年 1月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Jan.2011
1)国家自然科学基金项目(30640034)、国家科技基础性工作专
项(2007FY110400-3)资助。
第一作者简介:贯春雨 , 女 , 1980年 2月生 , 东北林业大学林学
院 ,博士研究生。
通信作者:张含国 ,东北林业大学林学院 , 教授。 E-mail:han-
guozhang1@yahoo.com.cn。
收稿日期:2010年 6月 28日。
责任编辑:张建华。
基于松科树种 EST序列的落叶松 SSR引物开发 1)
贯春雨　张含国　张　磊　朱航勇　邓继峰
(东北林业大学 ,哈尔滨 , 150040)
　　摘　要　登陆 NCBI的 dbEST数据库搜索松科树种 EST序列 , 应用 SSRIT软件在线搜索 EST-SSR,用 Primer
3设计 EST-SSR引物。选用日本落叶松(L.leptolepis)×兴安落叶松(L.gmelini)及其 145个 F1为检测植株 , 对所开发 EST-SSR引物进行扩增 ,并以丙烯酰胺凝胶检测扩增产物 ,以获得适合落叶松的 SSR引物 , 以期用于该家
系的图谱构建及 QTL定位的研究。 NCBI数据库搜索松科 EST序列 40608条 ,使用 SSRIT检测得到 SSR位点 1011
个 ,频率为 2.49%。使用 primer3设计 EST-SSR引物 132对。 SSRs以二核苷酸重复最为常见 , 重复基元 11种 ,
重复数量 5598个 ,占全部重复基元比例达到 83.79%;其次为三核苷酸 , 重复基元 40种 ,重复数量 1067, 占全部重
复单元的比例为 15.97%;四核苷酸为 3种重复基元 ,重复数量 16, 所占比例为 1.95%。经扩增检测 125对 EST-SSR引物在日 ×兴亲本及 F
1
中获得扩增产物 , 占 94.7%。
关键词　松科;落叶松;EST-SSR;引物开发
分类号　S722.7;S791.22
DevelopmentofLarixleptolepisSSRPrimersfromESTSequenceofPinaceaeFamily/GuanChunyu, ZhangHanguo,ZhangLei, ZhuHangyong, DengJifeng(SchoolofForestry, NortheastForestryUniversity, Harbin150040, P.R.Chi-
na)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2011, 39(1).-20 ～ 23
AsearchforESTsequenceofPinaceaespeciesweremadebydbESTdatabaseofNCBI.SSRITsoftwarewasusedto
searchEST-SSRonlineandprimer3todesignEST-SSRprimers.Larixleptolepis, L.gmeliniandtheir145ful-sibF1in-
dividualswereamplifiedbytheEST-SSRprimers, andthentheamplifiedproductsweredetectedbyacrylamidegel.Suit-ableSSRprimerswereselectedforlarchtoconstructgeneticmapandQTLmappingforthefamily.Throughthesequence
analysisof40608 ESTsinPinaceaedepositedinNCBI, atotalof1011 SSRlociwereobtainedusingtheSSRITsoftware,
andthefrequencywas2.49%.Onehundredandthirty-twopairsofEST-SSRprimersweredesignedbyprimer3.Thedi-
nucleotiderepeatsweremostcommoninSSRs, andtherepeatedprimitiveswere11, accountingfor83.79% ofthetotalrepeatedprimitives, andtherepeatnumberwas5 598.Thetrinucleotiderepeatsweremorecommon, andtherepeated
primitivesandrepeatnumberwere40 and1 067, respectively, accountingfor15.97% ofthetotalrepeatedprimitives.
Tetranucleotiderepeatsincludedthreetypesofrepeatedprimitives, andtherepeatnumberwas16, accountingfor1.95%
ofthetotal.Atotalof125EST-SSRprimerpairswereobtainedwhichamplifiedproductsintheparents(L.leptolepis×L.
gmelini)andF1, accountingfor94.7% ofthetotal.Keywords　Pinaceae;Larix;EST-SSR;Primerdevelopment
　　SSR(simplesequencerepeat), 即简单重复序列。 由于微
卫星序列侧翼有相当保守的 DNA序列 , 使得微卫星引物具有
较高的通用性 ,因此 , 在同一物种间或物种亲缘关系比较近的
物种间 ,甚至分类地位很近的物种间 ,可以利用引物序列的通
用性做遗传学研究。由于 SSR标记具有高度的多态性 、共显
性的性质 , SSR标记成为分析遗传多样性和遗传图谱的共同
选择 [ 1-4] 。然而 , SSR引物数量不足制约了 SSR标记的发
展 [ 5] ,采用传统方法开发 SSR引物又耗时 、费力 [ 4] , 于是 , 表
达序列标签或者是信使 RNA, 提供了一个有效开发单一的 、
低拷贝的 、保守的 SSR引物的方法 [ 6] 。目前 GenBank等公共
数据库中已积累了大量的 EST序列信息 ,通过搜索含有 SSR
的 EST来开发 SSR标记是一条快速和有效的途径。马尾松 、
柽柳 、杨树 、白桦 、云杉等许多树种开展了 EST-SSR引物的
开发 [ 5-9] 。落叶松(Larixspp.)为松科(Pinaceae)落叶松属
(Larix),是中国主要用材和造林树种之一;但目前关于落叶
松 SSR引物开发的研究还未见报道 ,因为从针叶基因组 DNA
开发大量的 、单拷贝的 SSR引物是十分困难的 [ 10-13] ,所以开
展落叶松 EST-SSR引物对落叶松基因组的研究十分艰巨和
必要 ,本研究对此进行了初步探讨。
1　材料与方法
1.1　材料来源及 DNA提取
选用日本落叶松(L.leptolepis)×兴安落叶松(L.gmeli-
ni)及其 145个 F
1
为检测植株对所开发 EST-SSR引物进行
检测 ,以期用于该家系的图谱构建及 QTL定位的研究。
日本落叶松原产于日本本州岛中部山区 ,由于生长量大 、
抗病性强 , 种或杂种在中国引种栽培已十分广阔;兴安落叶松
抗寒性好 ,适应力强;二者遗传差异大 ,远源杂交所获得的子
代林有较高的研究和应用价值 , 在遗传育种研究中较有代表
性 , 故本研究选用其 F1为检测群体。
针叶材料来源于黑龙江省林口县青山林场 1980年建立的子
代林。针叶样品为当年新生 ,于 2009年 6月采得 , -80℃冷冻保
存。植株基因组DNA采用 CTAB方法从针叶样品中提取。
1.2　序列搜索及引物设计
登陆 NCBI的 dbEST数据库(htp://www.ncbi.nlm.nih.
gov/dbEST/index.html)搜索松科树种 EST序列 , 应用 SSRIT
(simplesequencerepeatidentificationtool)软件(htp://www.
gramene.org/db/searches/ssrtool)在线搜索 EST-SSR, 搜索的
标准为重复序列的重复次数大于或等于 5。 用 Primer3(ht-
tp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3)设计 EST-
SSR引物 ,由上海生工生物技术公司合成。设计引物的主要
参数为(默认设置):碱基 GC含量为 20% ～ 80%, 退火温度
50 ～ 63℃, 引物碱基长度约 20 bp, 预期扩增产物碱基长度
100 ～ 1 000bp。
1.3　PCR扩增及检测
EST-SSR反应体系:PCR扩增反应使用 System 9700
(GeneAmp)。反应体积 20μL,反应体系:模板 DNA2.5ng·
μL-1 , TaqDNA聚合酶(Fermentas)0.05 U· μL-1 , 左侧引物
0.45μmol· L-1 ,右侧引物 0.45μmol· L-1 , dNTP0.25mmol·
L-1 , Mg2+3.0mmol· L-1 , 体系中含 1×PCRBuffer。扩增条
件:94℃预变性 5min, 循环反应包括 94℃变性 30s, 60℃复
性 30s, 72℃延伸 1.5min, 35个循环后 , 72℃延伸 7min。 6%
变性聚丙烯酰胺凝胶检测扩增产物。
2　结果与分析
2.1　EST序列 SSR分析
登陆 NCBI的 dbEST数据库搜索 EST序列。共获 EST序
列 40 608条(截至 2009年 9月 14日), 见表 1。搜索获得落
叶松属(Larix)EST序列 6 2条 , 黄杉属(Pseudotsuga)EST
18 181条,冷杉属(Abies)EST10 362条 ,松属(Pius)EST372 183
条(研究中选用择序列编号位于前 12 000条 EST), 云杉属
(Picea)506 818条(因该属序列已有过开发引物的报道 , 本文
未采用), 铁杉属(Tsuga)3条 , 其余属未获得 EST序列。
表 1　NCBI-dbEST数据库松科 EST检索
松科(Pinaceae) 属 种 EST(20090914)
松亚门(Pinoideae) 松属(Pinus) 约 115种 372 183
云杉亚门(PiceaasperataMast)云杉属(Picea) 约 35种 506 818
落叶松亚门(Laricoideae) 银杉属(Cathaya) 1种 0
落叶松属(Larix) 约 14种 62
黄杉属(Pseudotsuga) 5种 18 181
冷杉亚门(Abietoideae) 冷杉属(Abies) 约 50种 10 362
雪松属(Cedrus) 2 ～ 4种 0
金钱松属(Pseudolarix) 1种 0
油杉属(Keteleeria) 3种 0
长苞铁杉属(Nothotsuga) 1种 0
铁杉属(Tsuga) 9种 3
　　应用 SSRIT软件在线搜索 EST-SSR位点 , 冷杉属检索
共获得拥有 SSR位点 243个 、黄杉属 EST共获得拥有 SSR位
点 398个 、松属 359个 、落叶松属 1个 , 铁杉属 EST序列均不
含 SSR位点(表 2)。利用含有 SSR位点的 EST序列设计物
132对 ,引物由上海生工生物技术公司合成。
表 2　SSRPrimer3所设计 EST-SSR引物的信息
类别 EST SSR SSR频率 /%
松属 12000 359 2.992
黄杉属 18181 398 2.244
冷杉属 10362 243 2.345
落叶松属 62 1 1.613
铁杉属 3 0
总计 40608 1011 2.490
　　EST-SSR主要有 3种重复类型 , 即:二核苷酸重复 、三核
苷酸重复 、四核苷酸重复 , 其出现频率各不相同(表 3)。其
中:二核苷酸重复最为常见 , 共有 5 598个 , 所占全部重复单
元比例达到 83.79%;三核苷酸重复 1 067, 所占全部重复单元
的比例为 15.97%;四核苷酸重复的出现 16, 所占比例为 1.95%。
由此可见 , EST-SSR中 ,二核苷酸重复占主导地位。
在搜索出的 EST-SSR中 , 共观察到 54种重复单元(表
4)。其中:二核苷酸重复中 , AG、GA出现的次数较多 , 分别占
二核苷酸重复的 40.1%、19.5%;在三核苷酸重复基元中 , CAG、
CTG、GAG出现较多 ,占三核苷酸重复的 8.25%、8.15%、7.87%;
四核苷酸中重复碱基有 3种类型 ,即:AATA、AATT、TTAT, 所
占比例几乎相同。
表 3　SSR在松树 EST中的出现频率
类型 种类 数目 所占比例 /%
二核苷酸 11 5 598 83.790
三核苷酸 40 1 067 15.971
四核苷酸 3 16 0.240
总　　计 54 6 681 100.000
2.2　引物筛选
用日本落叶松(L.leptolepis)、兴安落叶松(L.gmelinii)
及其随机 F1个体的 DNA为模板 ,对 132对 EST-SSR引物进
行扩增 , 其中 125对引物获得扩增产物 , 占 94.7%, 扩增产物
片断为 100 ～ 250bp;有扩增产物的引物中有 6对引物获得多
态性扩增产物 ,占有扩展引物的 4.8%。 表 5为部分多态性
SSR引物编号及碱基序列 ,图 1、图 2显示了用引物 LS362、LS
394扩增产生的多态位点在部分 F1个体中的分离。
表 4　EST序列中二核苷酸 、三核苷酸 、四核苷酸重复基元信息
重复类型 重复基元
数量 /
个
所占比
例 /% 重复类型
重复
基元
数量 /
个
所占比
例 /% 重复类型
重复
基元
数量 /
个
所占比
例 /% 重复类型
重复
基元
数量 /
个
所占比
例 /%
二核苷酸 tc 410 6.136 8 三核苷酸 cgt 6 0.089 8 三核苷酸 aag 17 0.254 5 三核苷酸 gat 10 0.149 7
tg 76 1.137 6 ctc 65 0.972 9 aat 47 0.703 5 gca 35 0.523 9
ta 647 9.684 2 ctg 87 1.302 2 aca 22 0.329 3 gct 20 0.299 4
ca 120 1.796 1 cct 5 0.074 8 ct 25 0.374 2 acc 5 0.074 8
ct 162 2.424 8 cac 15 0.224 5 gaa 13 0.194 6 aga 39 0.583 7
at 757 11.330 6 cag 88 1.317 2 gag 84 1.257 3 agc 15 0.224 5
ac 　41 0.613 7 cca 16 0.239 5 tga 35 0.523 9 ata 20 0.299 4
ag 2 247 33.632 7 tca 33 0.493 9 tgc 62 0.928 0 atc 35 0.523 9
gt 30 0.449 0 tcc 38 0.568 8 tgg 10 0.149 7 atg 12 0.179 6
ga 1 091 16.329 9 tcg 10 0.149 7 ta 11 0.164 6 四核苷酸 aat 6 0.089 8
gc 17 0.254 5 tat 5 0.074 8 gga 10 0.149 7 aata 5 0.074 8
三核苷酸 tc 59 0.883 1 taa 5 0.074 8 gtg 5 0.074 8 tat 5 0.074 8
tg 5 0.074 8 ggt 5 0.074 8 gt 5 0.074 8 总计 100.000 0
tct 26 0.389 2 ggc 41 0.613 7 at 21 0.314 3
21第 1期　　　　　　　　　　　贯春雨等:基于松科树种 EST序列的落叶松 SSR引物开发
图 1　引物 LS362的扩增片段在日 ×兴 F1群体中的分离
泳道 1.分子量标记;泳道 2.日本落叶松;泳道 3.兴安落叶松;泳道 4 ～ 49.杂种 F1代个体。
图 2　引物 LS394的扩增片段在日 ×兴 F1群体中的分离
泳道 50.分子量标记;泳道 51.日本落叶松;泳道 52.兴安落叶松;泳道 53～ 92.杂种 F1代个体。
表 5　部分 SSR引物编号及碱基序列
编号 重复基元 左引物序列 右引物序列 产物片段长度 /bp
LS47 (TA)8 TACCCGCTGAGCTTCTTGTT AAAAATGGCTAGAGCGATGC 175
LS98 (TCT)5 GCTCATGCCGTCTTCTTCTT ACCCTCTCAGCTCTGGAACA 179
LS101 (CAG)5 TTGTTAGCATGGCACCACAT GCTTTGGCTGTGAAGCCTAC 161
LS191 (AT)5 CAACTGACAAACAGCGTTTCA GCAGTGGTATCAACGCAGAG 224
LS219 (TA)7(CAG)5(CTC)5 ACCCACGCCTTACAGATCAC AGCTTTCCTCTGGCCTTCTC 250
LS261 (ATC)5 GCTCATGTGCAAGAGGATCA TAGTAATCGCTGCGGGAGTT 153
LS269 (AT)5(CA)6 AGCGATCAAGCCGAGAATAA AAACAAGGGTTCCAGCTCCT 202
LS281 (GAG)5 CTGCATTCATTCACGATAACAAA TGTTCTCCTCCTCCTCCTCA 100
LS283 (CCA)6(ACC)5 ACCAAATATGGGCCAACAAA AAACAAAACGTGGCCAAAAG 241
LS293 (AC)5 CTTTTCATGCAACAGCATCC GTTCAGGAGTCCCCAAGTCC 162
LS308 (TA)5(CAG)5 CACGCCTTACAGATCACCAC ACACCACTGGAGTGTTGCTG 165
LS314 (GCA)5 ATCATCCGCCTCTTCACATT CTCCTTCTGGTGTTGGTGGT 209
LS321 (GAG)5 CCAACTGCATTCATTCACGA TGGTGATTTCCCTTTGTTTCA 167
LS359 (TA)5 AATAGACACCCAAGGCAAGC CTTGTGGGCCATTGATGATA 150
LS378 (TG)6(TA)6 TTGGATATTGCACCAAAAAGG GGGTACAATTCCTTGCTTTTCA 193
LS388 (TA)6(GAG)5 GGCAATTTGTAGCGGAAAGA AAGCTCCCATGGCATACTTG 250
3　讨论
3.1　EST序列中 SSRs出现的频率
从 NCBI数据库中搜索到松科 EST序列 40 608条 , 使用
SSRIT检测得到 SSR位点 1 011个 , 频率为 2.49%,低于其他
树种 EST数据库中筛选的 SSR比率。胥猛等 [ 14]对 6 520条
鹅掌楸 EST序列进行检索 , 在 364条 EST中发现 394个 SSR,
频率是 5.58%;刘公秉等 [ 5]基于松树 EST序列的马尾松 SSR
引物开发研究中 , SSR出现频率是 4.08%;王艳敏等 [ 8]对
2 548个欧洲白桦 EST进行了搜索 ,发现了 307个 SSRs, 出现
频率是 12.05%。这种差异可能是物种间的真实 SSR信息差
异或搜寻 SSR时所用长度最低标准不同造成的 [ 15] 。
3.2　EST序列中 SSRs出现的类型
检测松科 EST序列 SSRs发现 , 重复类型中二核苷酸重
复占 83.79%,处于主导地位。王艳敏等 [ 8]在白桦 EST-SSR
信息分析与标记的开发研究中也发现二核苷酸重复是主导类
型 , 所占 SSR比例达到 81.12%;张新叶等 [ 7]在杨树 EST-
SSR引物开发研究中发现 , 二核苷酸重复是最丰富的重复类
型 , 占总类型的 62.3%;胥猛等 [ 14]对鹅掌楸 EST-SSR引物
的开发研究表明 ,二核苷酸重复占 61.9%。但也有不同的报
道:刘公秉等 [ 5]基于松树 EST序列的马尾松 SSR引物开发研
究中发现 ,三碱基重复类型优势明显 , 占 50.19%。可见 , 不
同植物种中 SSRs的主导类型是不同的。
3.3　SSRs的重复基元
研究发现 ,二核苷酸重复中 AG、GA出现的次数较多 , 分
22 　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 39卷
别占二核苷酸重复的 40.1%、19.5%。安泽伟等 [ 16]在橡胶树
EST-SSR标记的开发与应用研究中也发现 ,二核苷酸重复基
序中出现最多的是AG/TC和 GA/CT, 分別占SSR总数的
26.51%和 24.42%;胥猛等 [ 14]的研究中发现 , 在二核苷酸重
复类型的 EST-SSRs中 ,含AG/CT基序的数量最多 ,占 92.2%;
而刘公秉等 [5]基于松树 EST序列的马尾松SSR引物开发研究中
AT/AT占绝对优势(72.92%), 其次才是 AG/CT(25.37%)。王
艳敏 [ 8]指出 , GA在大多数植物二核苷酸重复中是主导核苷
酸重复;Morgante等人 [ 17-19]对多种不同植物 EST-SSR综合
分析后所报道的结果与之相符。
研究过程中 ,三核苷酸重复基元 CAG、CTG、GAG出现较
多 ,占三核苷酸重复的 8.25%、8.15%、7.87%。刘公秉等 [ 5]
研究显示 , 三碱基重复基元 AAG/CCT、AGG/CCT、AGC/CGT
3种类型的重复基元比例较大 ,分别为 19%、16%、16%;张新
叶等 [ 7]进行杨树 EST-SSR引物开发研究中 , 三核苷酸重复
(AAG)n所占比例最高 , 胥猛等 [ 14]也发现 , 三核苷酸重复类
型的 EST-SSRs中 , AAG/CTT基序出现频率最高;而 Tuskan
等 [ 20]在毛果杨基因组微卫星的研究中发现 , 最丰富的三核苷
酸重复为(AAT)n。对此 , 王艳敏等 [ 8]认为 , 这种不同物种
EST-SSR主导核苷酸重复的差异 ,以及同一物种中不同报道
结果的差异 ,可能是由于各报道中所用 EST来源和 EST数目
不同所致。
3.4　EST-SSR引物的扩增
经扩增检测所设计的 132对 EST-SSR引物在日本落叶
松 、兴安落叶松及 F
1
中有 125对获得扩增产物 ,占 94.7%,这
个比率比其他报道相对较高。 张树新等 [ 7]约 90%的引物获
得扩增产物;胥猛等为 75% [ 14];王艳敏 [ 8]在白桦中扩增成功
的引物比例为 59.09%。在报道的不同研究中 , 成功的扩增
比例一般为 60% ～ 90%[ 17, 21-25] 。 本研究中所设计的 7对
EST-SSR引物在日本落叶松 、兴安落叶松及 F
1
中没有获得
扩增产物。张树新等 [ 7]指出 , 造成扩增没有产物的可能原因
大致有 3个:EST-SSR引物对的 1端或 2端正好位于 1个剪
切位点上;引物对包含了较大的内含子 , 产生的 PCR产物无
法在电泳图中显示出来;用于设计引物的序列本身存在问题 ,
或来自比较荒诞的 cDNA克隆。本研究中 6对 EST-SSR引
物在日本落叶松 、兴安落叶松及 F1中获得多态性扩增产物 ,
占有扩增引物的 4.8%;I.Fernandez-Silva等 [ 26]的研究中 ,
多态性为 5.4%。 Pfeifer等 [ 27]提出 , 最初基于基因组序列开
发 SSR标记的尝试成功率低 , 结果不理想 , 许多引物会扩增
出复杂的 、遗传上不能解释的带型 , 原因是针叶树基因组序列
存在大量重复 、特异性低。尹佟明等 [ 28]发现 , 在松属不同树
种间能够通用且在单株树中杂合的 SSR位点是比较少的 ,艾
畅等 [ 29-32]的研究也有类似结论 ,而本研究中设计引物所使用
的 EST序列来自于松科的不同属种 , 这可能是造成 EST-
SSR多态性筛选比率低的原因。
本研究的松科 EST序列搜索日期为 2009年 9月 14日 ,
随着 EST序列的大量增长 , 还可进一步开发出更高效的可应
用于落叶松分子标记的 SSR引物。
参　考　文　献
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23第 1期　　　　　　　　　　　贯春雨等:基于松科树种 EST序列的落叶松 SSR引物开发