全 文 ：櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
［11］Tsaftaris A，Pasentsis K，Makris A，et al． The study of the E － class
SEPALLATA3 － like MADS － box genes in wild － type and mutant
flowers of cultivated saffron crocus (Crocus sativus L．)and its puta-
tive progenitors［J］． Journal of Plant Physiology，2011，168(14):
1675 － 1684．
［12］郭 爽，沈火林，杨文才，等． 利用抑制消减杂交技术分离辣椒
细胞质雄性不育育性恢复相关 EST［J］． 园艺学报，2009，36
(10):1443 － 1449．
［13］Becker A，Theissen G． The major clades of MADS － box genes and
their role in the development and evolution of flowering plants［J］．
Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29(3) :464 － 489．
［14］Kim S H，Mizuno K，Fujimura T． Isolation of MADS － box genes
from sweet potato(Ipomoea batatas(L．)Lam．)expressed specific-
ally in vegetative tissues［J］． Plant ＆ Cell Physiology，2002，43
(3) :314 － 322．
［15］Li H L，Wang Y，Guo D，et al． Three MADS － box genes of Hevea bra-
siliensis expressed during somatic embryogenesis and in the laticifer
cells［J］． Molecular Biology Ｒeports，2011，38(6) :4045 －4052．
［16］Mathew Ｒ，Ｒosenthal A，Fellows K，et al． MADS － box gene family
in rice:genome － wide identification，organization and expression
profiling during reproductive development and stress［J］． BMC
Genomics，2007，8:242．
［17］Zhang B，Su X，Zhou X． A MADS － box gene of Populus deltoides
expressed during flower development and in vegetative organs［J］．
Tree Physiology，2008，28(6) :929 － 934．
［18］Whipple C J，Ciceri P，Padilla C M，et al． Conservation of B － class
floral homeotic gene function between maize and Arabidopsis［J］．
Development，2004，131(24) :6083 － 6091．
［19］Aoki S，Uehara K，Imafuku M，et al． Phylogeny and divergence of
basal angiosperms inferred from APETALA3 － and PISTILLATA －
like MADS － box genes［J］． Journal of Plant Ｒesearch，2004，117
(3) :229 － 244．
［20］刘菊华，徐碧玉，张 静，等． MADS － box 转录因子的相互作用
及对果实发育和成熟的调控［J］． 遗传，2010，32(9):893 － 902．
刘子金，杨小波，林泽钦，等． 10 种藤黄科植物遗传多样性的 ISSＲ分析［J］． 江苏农业科学，2016，44(7):55 － 58．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 07． 015
10 种藤黄科植物遗传多样性的 ISSＲ分析
刘子金1，2，杨小波1，2，林泽钦1，2，吴庭天1，2，周 韬1，2，李东海1，2，岑举人1，2
(1．海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南海口 570228;2．海南大学园艺园林学院，海南海口 570228)
摘要:运用内部简单重复序列(inter － simple sequence pepeat，ISSＲ)分子标记对采自海南省的 10 种藤黄科植物进
行遗传多样性分析，结果显示:(1)从 100 条 ISSＲ引物中筛选出 8 条能扩增出清晰条带且多态性明显的引物;8 条引
物扩增出 331 条条带，其中多态性位点有 106 个，多态性比例为 100%，平均每条引物扩增位点数为 13． 25 个。(2)材
料间的遗传相似系数范围为 0． 407 8 ～ 0． 699 0，平均为 0． 562 2。以 0． 620 0 作为最低遗传相似系数，将 10 种藤黄科植
物划分为 5 大类:①铁力木;②菲岛福木、单花山竹子、山竹子;③多花山竹子、越南黄牛木、黄牛木;④岭南山竹子;⑤
红厚壳、薄叶红厚壳。研究结果首次从分子水平揭示了藤黄科植物的遗传多样性，为合理地引种、驯化、保护、利用藤
黄科植物野生资源提供了重要的参考依据和数据支持。
关键词:藤黄科;ISSＲ;遗传多样性;聚类分析;相似系数
中图分类号:S567． 1 + 90． 32 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)07 － 0055 － 04
收稿日期:2015 － 06 － 16
基金项目:海南省自然科学基金(编号:20153155);海南大学博士科
研启动基金(编号:kyqd1420)。
作者简介:刘子金(1991—)，男，河南新乡人，硕士研究生，主要从事
热带药用植物资源及其活性物质研究。E － mail:1097717416@
qq． com。
通信作者:岑举人，博士，讲师，主要从事热带药用植物资源及其活性
物质研究。E － mail:240729735@ qq． com。
藤黄科(Guttiferae)属双子叶植物纲五桠果亚纲，是一个
热带科。我国有 8 属 87 种藤黄科植物，分别隶属于 3 亚科，
几乎遍布全国各地［1］，海南省主要有黄牛木属、红厚壳属、铁
力木属、藤黄属等。近年来，随着人们对藤黄科植物研究的不
断深入，从中出离出大量黄酮类化合物［2］、呫吨酮类化合
物［3 － 4］、萜类化合物［5］等。药理研究表明:藤黄科植物药用活
性成分具有抗肿瘤［6］、抗艾滋病［7］、抗菌［8］等多种生物活性，
极具研究和开发价值。因此，对藤黄科植物进行深入研究具
有重要意义。
内部简单重复序列(inter － simple sequence pepeat，ISSＲ)
是由 Zietkiewicz 等在 1994 年提出的一种新型分子标记技
术［9］，用于检测简单重复序列(SSＲ)间的 DNA 序列差异，具
有比随机扩增多态 DNA(ＲAPD)更高的可重复性、稳定
性［10］。同时，该试验操作简单、快速、高效，不需要繁锁的构
建文库、设计引物、杂交、同位素显示等步骤，而且 ISSＲ 标记
可以揭示整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗传。目前，
ISSＲ 技术己在品种鉴定［11］、遗传作图［12 － 13］、遗传多样
性［14 － 15］等研究中得到了广泛应用［16］。本研究利用 ISSＲ 技
术对采自海南省的 10 种藤黄科植物进行亲缘关系、遗传多样
性分析，以期为藤黄科植物种质资源的收集、鉴定、保护和利
用提供理论基础。
—55—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 7 期
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料分别为红厚壳、薄叶红厚壳、山竹子、岭南山竹
子、单花山竹子、多花山竹子、菲岛福木、黄牛木、越南黄牛木
和铁力木，所有物种均由海南大学热带作物种质资源保护与
开发利用教育部重点实验室主任杨小波教授鉴定。采集地信
息见表 1。
表 1 材料来源信息
序号 种名 采集地 代号
1 红厚壳(Calophyllum inophyllum L．) 海口市演丰镇 H
2 薄叶红厚壳(Calophyllum membranaceum) 陵水市吊罗山 B
3 山竹子(Garcinia mangostana L．) 五指山市毛道乡 S
4 岭南山竹子(Garcinia oblongifolia) 陵水市吊罗山 L
5 单花山竹子(Garcinia oligantha) 陵水市吊罗山 d
6 多花山竹子(Garcinia Multiflora) 陵水市吊罗山 D
7 菲岛福木(Garcinia subelliptica) 海口市美兰区 F
8 黄牛木(Cratoxylum． Cochinchinense) 昌江市霸王岭 N
9 越南黄牛木(Cratoxylum formosum) 昌江市霸王岭 Y
10 铁力木(Mesua ferrea L．) 儋州市植物园 T
ISSＲ － PCＲ 扩增反应引物根据 British Columbia 大学公
布的 ISSＲ引物序列，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合
成;Taq DNA聚合酶、2 × Taq PCＲ Master Mix、2 kb DNA mark-
er均购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。
1． 2 试验仪器
主要仪器有:HH － 2 数显恒温水浴锅;Eppendorf Centri-
fuge 5 415Ｒ 冷冻离心机;Biometra TGradient PCＲ 仪;DYY －
11 型电泳仪，北京市六一仪器厂;BG － SubMINI 水平电泳槽;
Alphalmager － 2200 凝胶成像系统。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 总 DNA的提取 采用购自成都福际生物技术有限公
司的植物 DNA提取试剂盒提取基因组总 DNA，用 0． 8%琼脂
糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的完整性、浓度，将其稀释为
20 ng /L，用于 ISSＲ分子标记技术分析，置于 － 20 ℃冰箱中保
存备用。
1． 3． 2 扩增与成像 ISSＲ － PCＲ 反应体系(20 μL):10 μL
2 × Taq PCＲ Master Mix，1 μL Taq DNA 聚合酶(5 U /μL)，
1 μL 模板，用灭菌蒸馏水补足至 20 μL。扩增程序:94 ℃
5 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s;94 ℃ 50 s，43 ℃ 50 s，72 ℃
1 min，40 个循环;72 ℃ 10 min。于 4 ℃贮存。PCＲ 扩增在
Biometra T － Gradient PCＲ仪上完成。ISSＲ扩增产物用 1． 6%
琼脂糖凝胶电泳检测，以 2 kb Ladder Plus Marker为相对分子
质量标记，在紫外凝胶成像系统下拍照记录。
1． 3． 3 数据处理 对 ISSＲ － PCＲ 扩增产物进行条带数目统
计，采取 0 /1 赋值记带，扩增产物相同迁移位置上有条带记为
“1”，无条带记为“0”，得到 0 /1 数据矩阵，然后将数据导入
NTsys 2． 10e 软件进行聚类分析。首先用 SimQual 程序计算
Nei － Li相似系数，再用 SHAN 程序中的非加权成组算术平均
数法(unweighted pair － group method，arithmetic average，UPG-
MA)进行聚类分析，最后用 TＲEEPLOT过程构建树状聚类图。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取结果
基因组 DNA 用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测，由图 1 可
知，所得条带均匀清晰，无蛋白质、ＲNA污染，无拖尾现象，纯
度高，完全满足 ISSＲ分析的要求。
2． 2 ISSＲ扩增结果
用红厚壳、山竹子 DNA为模版，对 100 条 ISSＲ 引物进行
筛选，最终确定 8 条带型清晰、多态性较好的引物用于藤黄科
植物的多态性分析。表 2 结果表明:8 条引物扩增出 331 条
清晰可辨的条带，DNA片断多集中在 750 ～ 2 000 bp 之间，平
均每个引物扩增出 41． 38 条条带，其中位点有 106 个，平均每
条引物扩增位点数为 13． 25 个，均呈现多态性，多态性比例达
到了 100%，说明 10 种藤黄科植物在 DNA 分子水平上存在
着丰富的遗传多样性。引物 ISSＲ扩增图谱见图 2。
表 2 引物序列和扩增结果
引物
引物序列
(5→3)
扩增条
带数(条)
多态性条
带数(条)
退火温度
(℃)
多态性位点
比例(%)
UBC10 (GA)8 T 51 51 48 100
UBC811 (GA)8 C 43 43 48 100
UBC815 (CT)8G 30 30 48 100
UBC822 (TC)8A 33 33 48 100
UBC826 (AC)8 C 42 42 48 100
UBC842 (GA)8YG 33 33 55 100
UBC843 (CT)8ＲA 45 45 55 100
UBC844 (CT)8ＲC 54 54 55 100
2． 3 材料间亲缘关系的聚类分析
由表 3 可知，10 种藤黄科植物的遗传相似系数在
0． 407 8 ～ 0． 699 0 之间，平均遗传相似系数为 0． 562 2。其中
薄叶红厚壳和单花山竹子的遗传相似系数最小，为 0． 407 8，
亲缘关系最远;薄叶红厚壳和红厚壳相似系数最大，为
0． 699 0，亲缘关系最近。通过聚类分析，以阈值 0． 620 0 为基
准，可以将 10 种藤黄科植物明显地划分为 5 个类群，如图 3
所示:第 1 类为铁力木;第 2 类为菲岛福木、单花山竹子、山竹
子;第 3 类为多花山竹子、越南黄牛木、黄牛木;第 4 类为岭南
山竹子;第 5 类为红厚壳、薄叶红厚壳。
3 讨论
藤黄科植物由于其重要的经济价值、食用价值、药用价
值，已经成为世界各国植物资源研究的热点之一，尤其是在化
—65— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 7 期
表 3 供试材料的遗传相似系数
材料代号 T F D d S L H B N Y
T 1． 000 0
F 0． 504 9 1． 000 0
D 0． 582 5 0． 611 7 1． 000 0
d 0． 572 8 0． 621 4 0． 621 4 1． 000 0
S 0． 572 8 0． 582 5 0． 640 8 0． 631 1 1． 000 0
L 0． 572 8 0． 601 9 0． 582 5 0． 553 4 0． 553 4 1． 000 0
H 0． 592 2 0． 582 5 0． 601 9 0． 514 6 0． 592 2 0． 611 7 1． 000 0
B 0． 543 7 0． 456 3 0． 534 0 0． 407 8 0． 543 7 0． 563 1 0． 699 0 1． 000 0
N 0． 504 9 0． 495 1 0． 611 7 0． 524 3 0． 582 5 0． 504 9 0． 563 1 0． 592 2 1． 000 0
Y 0． 563 1 0． 514 6 0． 669 9 0． 524 3 0． 524 3 0． 466 0 0． 485 4 0． 475 7 0． 650 5 1． 000 0
学成分、药理药效方面，近年来人们开展了较为全面的研究，
并取得了丰富的成果。因此，对藤黄科植物资源进行较为统
一、完善、准确的分类，对资源的收集、鉴定及合理利用具有非
常重要的意义。本研究采用分子标记的方法，从分子的角度
—75—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 7 期
去研究植物，更能够发掘物种内部的变异因素，从而更加准确
地获知物种之间的亲缘关系、遗传多样性。因此，本研究通过
所选取的 8 条引物获得了 331 条条带、106 个多态位点，充分
说明所选引物具有信号强、特异性高、覆盖度广等特点，也能
够充分地揭示藤黄科不同植物间的亲缘关系和存在的遗传差
异(充分揭示藤黄科植物具有遗传多样性)。研究表明:10 种
植物聚为 5 类，其中铁力木聚为 1 类，红厚壳、薄叶红厚壳聚
为 1 类，这与它们的传统分类地位是一致的［1］。藤黄属中的
5 种植物山竹子、岭南山竹子、单花山竹子、多花山竹子、菲岛
福木分别聚为 3 类。其中，岭南山竹子单独聚为 1 类，菲岛福
木、山竹子、单花山竹子聚为 1 类，而多花山竹子却与黄牛木
属中的黄牛木、越南黄牛木聚在一起。这可能与它们的生境
有关，多花山竹子、黄牛木属植物生境相同，均分布在次生林
或者灌丛中，地理分布存在一定的重叠。
ISSＲ分子标记具有信息量丰富、操作简单、重复性好、稳
定性强等诸多优点，因而被广泛应用于植物遗传多样性研究
中［17 － 18］。本研究表明，藤黄科植物之间具有丰富的遗传多样
性，这意味着它们具有较高的适应能力、较大的育种和改良能
力。如今，藤黄科植物在人们生活中起到的影响也越来越大，
广泛用作食用水果、木材和各种其他天然产品的来源，也是化
工、医药的重要原料。因此，准确了解植物间的亲缘关系，能
够为繁育出更优质的果树、实用木材以及获得含有更高含量
药物活性成分的品种提供理论依据，从而研发新的技术，从根
本上解决用于现代制药行业所需的植物原料缺乏问题，有效
地避免对藤黄科野生植物资源的过度采挖造成某些物种的濒
危或灭绝，最终达到对植物资源合理有效开发利用目的。
参考文献:
［1］中国科学院植物志编辑委员会．中国植物志［M］． 北京:科学出
版社，1990:111 － 112．
［2］Kumar S，Sharma S，Chattopadhyay S K． The potential health benefit
of polyisoprenylated benzophenones from Garcinia and related genera:
Ethnobotanical and therapeutic importance ［J］． Fitoterapia，2013，
89:86 － 125．
［3］Deng Y X，Guo T，Shao Z Y，et al． Three new xanthones from the res-
in of Garcinia hanburyi［J］． Planta Medica，2013，79(9):792 － 796．
［4］Niu S L，Li Z L，Ji F，et al． Xanthones from the stem bark of Garcinia
bracteata with growth inhibitory effects against HL － 60 cells［J］．
Phytochemistry，2012，77:280 － 286．
［5］张俊艳，韩英梅，常允平． 藤黄属植物的化学成分和药理作用研
究进展［J］． 现代药物与临床，2012，27(3):297 － 303．
［6］Zhang X，Li X，Sun H，et al． Garcinia xanthones as orally active anti-
tumor agents［J］． Journal of Medicinal Chemistry，2013，56(1) :
276 － 292．
［7］Ｒeutrakul V，Anantachoke N，Pohmakotr M，et al． Anti － HIV － 1 and
anti － inflammatory lupanes from the leaves，twigs，and resin of Gar-
cinia hanburyi［J］． Planta Medica，2010，76(4) :368 － 371．
［8］Arunrattiyakorn P，Suksamrarn S，Suwannasai N，et al． Microbial me-
tabolism of α － mangostin isolated from Garcinia mangostana L．［J］．
Phytochemistry，2011，72(8) :730 － 734．
［9］Zietkiewicz E，Ｒafalski A，Labuda D． Genome fingerprinting by sim-
ple sequence repeat (SSＲ)－ anchored polymerase chain reaction am-
plification［J］． Genomics，1994，20(2) :176 － 183．
［10］罗海燕，陈业渊． ISSＲ 分子标记及其应用［J］． 安徽农学通报，
2008，14(19):45 － 46，27．
［11］徐 君，刘凤军，张国芹，等． 香稻不育系 ISSＲ正交体系优化及
验证［J］． 江苏农业科学，2015，43(4):21 － 24．
［12］战晴晴，隋 春，魏建和，等． 利用 ISSＲ和 SSＲ分子标记构建北
柴胡遗传图谱［J］． 药学学报，2010(4):517 － 523．
［13］李 伦，熊永兴，赵玉霞，等． 麻城福白菊的 ISSＲ遗传图谱的构
建［J］． 中国药师，2014(12):2059 － 2062，2063．
［14］卢家仕，卜朝阳，吕维莉，等． 不同产地石斛属种质资源的 ISSＲ
遗传多样性分析［J］． 中草药，2013，44(1):96 － 100．
［15］王 岚，朱熠鹏，蒋 明，等． 青花菜种质资源遗传多样性的
ISSＲ 分析［J］． 浙江农业学报，2014，26(4):915 － 919．
［16］朱岩芳，祝水金，李永平，等． ISSＲ 分子标记技术在植物种质资
源研究中的应用［J］． 种子，2010，29(2):55 － 59．
［17］刘 娟，廖 康，那斯尔曼苏尔，等． 利用 ISSＲ分子标记构建南
疆杏种质资源核心种质［J］． 果树学报，2015(3):374 － 384．
［18］李志勇，李鸿雁，蔡丽艳，等． 中国扁蓿豆种质资源遗传多样性
的 ISSＲ标记与生态因子相关性分析［J］． 华北农学报，2014
(6):94 － 100．
—85— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 7 期