全 文 ：华北农学报·2010，25(增刊) :60 -64
收稿日期:2010 － 04 － 02
基金项目:“973”计划项目(2007CB106806) ;内蒙古半干旱草原区天然草地改良与人工饲料基地建设技术集成与示范(2006BAD16B05-4)
作者简介:闫伟红(1979 －) ，女，内蒙古赤峰人，在读博士，主要从事牧草资源评价与利用研究。
通讯作者:徐 柱(1955 －) ，男，内蒙古锡盟人，研究员，博士生导师，主要从事牧草资源评价和草地生态研究。
冰草属植物 ISSR遗传分析与评价
闫伟红，徐 柱，李临杭，马玉宝
(中国农业科学院 草原研究所，农业部草地资源与生态重点开放实验室，内蒙古 呼和浩特 010010)
摘要:利用 ISSR分子标记技术，对采自内蒙古、河北、山西、宁夏、甘肃和吉林 6 省区，经引种栽培筛选出的 5 种 12
个冰草属植物居群，进行 DNA 分子水平的遗传结构分析和评价。构建了国内冰草属 ISSR-PCR扩增反应体系。研究
结果表明:供试材料共检测出 88 条谱带，其中多态性谱带 83 条，多态性条带的比例为 94． 32%，表明供试材料遗传多
态性丰富。不同物种居群间遗传多样性丰富程度不同，蒙古冰草遗传多样性最大，其次为冰草，光穗冰草最小。种间
遗传分化占冰草属物种遗传多样性的 56． 35%，冰草物种地区间遗传多样性高于地区内遗传多样性。UPGMA 聚类结
果显示，同种不同材料基本能够聚在一起，但有交叉现象，部分材料表现出地域性;生态环境相似的物种遗传距离较
近，聚类在一起。种间亲缘关系能够推测冰草属 5 个种的系统关系。
关键词:冰草属;ISSR;遗传分析;居群
中图分类号:S543 + ． 9 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2010)增刊 － 0060 － 05
Genetic Analysis and Evaluation of Agropyron． on ISSR
YAN Wei-hong，XU Zhu，LI Lin-hang，MA Yu-bao
(Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Science，Grassland
Resource and Ecology Laboratory of Ministry of Agriculture，Huhhot 010010，China)
Abstract:The genetic structure of 12 Agropyron populations，including five species was analysed and evaluated
by inter-simple sequence repeat (ISSR)markers． These materials were collected from six provinces in China，inclu-
ding Inner Mongolia，Hebei，Shanxi，Ningxia，Gansu and Jilin． ISSR-PCR amplification reaction system on Agropyron
was been construct in China． The results showed that:A total of 88 fragments were amplified from 7 primers，of
which 83 bands (94． 32%)were polymorphic for the test materials，and there were a large amount of genetic poly-
morphism in the tested materials． Populations accessions of different species had different genetic richness． A． mon-
golicum had the most abundant genetic diversity． The second was A． cristatum． Genetic diversity of A． cristatum． var．
pectinforme was relative lower than other species of Agropyron． The genetic variation found among species was 56．
35% and genetic diversity among regions is higher about A． cristatum． By UPGMA clustering，different populations
of inter-species can be basically clustered together，but a few different populations of inter-species can＇t be clustered
together． The species from similar eco-geographical situations have closer genetic distance and were clustered togeth-
er． The genetic relationship among species can be speculated systematic relationship of five species on Agropyron．
Key words:Agropyron．;ISSR;Genetic analysis;Populations
冰草属(Agroyron Gaertn．)是禾本科(Poaceae)
小麦族(Triticeae)的一个重要多年生属，全世界约
有 15 种，中国有 5 种［1］。大部分分布于欧亚大陆温
寒带高原及沙地上，前苏联境内种的分布最多，几乎
包括了所有种;中东分布有二倍体、四倍体和六倍体
3 个倍性水平的种;北美洲作为优质牧草广为引种
栽培［2］。在中国，主要分布于海拔高度为 1 000 ～
1 500 m的北方沙质地和沙质草原［3］。作为小麦属
的野生近源属之一，冰草属一直是小麦育种工作者
关注的焦点，冰草属的许多优良性状，如抗病性、抗
逆性等可为小麦品种改良提供有价值的基因资源。
ISSR是由 Zietkiewicz 等［4］提出的一种新型分
增刊 闫伟红等:冰草属植物 ISSR遗传分析与评价 61
子标记技术，用于检测 SSR 间 DNA 序列的差异。
ISSR分子标记可用于物种分类、系统学比较，推测
物种的进化，品种鉴定、居群遗传学研究、遗传多样
性分析、构建遗传图谱等许多研究领域，是研究植物
遗传多样性时优先使用的分子生物学技术和方法。
另外，ISSR引物在小麦族各属种间具有通用性［5］。
本研究以经过引种栽培和农艺性状初步评价而
筛选出的冰草属植物 5 种 12 个优质抗逆居群为研
究对象，通过对样本间 ISSR分子标记反映的遗传差
异进行分析，从 DNA分子水平上探讨进行冰草属植
物异地活体保存时的遗传结构、特性和适应性，以期
了解所选材料居群 DNA 分子水平上的遗传演化规
律，发现变异物种材料，为育种改良提供科学理论依
据，为构建人工草地提供适宜优质牧草。
1 材料和方法
1． 1 供试材料
选取中国农业科学院草原研究所太仆寺旗科学
试验基地目前所收集和保存的冰草属植物 5 个种
12 个居群材料，其中冰草(A． cristatum)4 个居群﹑
蒙古冰草(A． mongolicum)3 个居群﹑光穗冰草(A．
cristatum． var． pectinforme)2 个居群、细茎冰草(A．
trachycaulum)2 个居群和沙生冰草(A． desertorum)1
个居群，见表 1。
表 1 参试的冰草属植物居群
Tab． 1 Experimental populations of Agropyron Gaertn
居群编号
Populations number
种名
Species name
来源
Sources
1 冰草 A． cristatum 河北省柴沟堡
2 冰草 A． cristatum 内蒙锡盟太旗格日图
3 冰草 A． cristatum 山西右玉
4 冰草 A． cristatum 内蒙呼郊试验场
5 细茎冰草 A． trachycaulum 内蒙古锡盟蓝旗黑城牧场
6 细茎冰草 A． trachycaulum 吉林公主岭市
7 光穗冰草 A． cristatum． var． pectinforme 宁夏盐池县大水坑
8 光穗冰草 A． cristatum． var． pectinforme 甘肃凉州金塔乡
9 沙生冰草 A． desertorum 内蒙古锡盟蓝旗黑城牧场
10 蒙古冰草 A． mongolicum var． mongolicum 甘肃武威县
11 蒙古冰草 A． mongolicum var． mongolicum 山西省偏关(209 国道旁)
12 蒙古冰草 A． mongolicum var． mongolicum 宁夏盐池县大水坑
1． 2 试验方法
取新鲜叶片 0． 25 g，双蒸水清洗干净，采用
CTAB微量提取法(稍作修改)［6］，提取 DNA。优化
了 ISSR-PCR 分子标记的 25 μL 反应体系(最终浓
度) :Mg2 +(2． 5 mmol /L)4 μL、dNTP(2． 5 mmol /L)2
L、Taq酶(5 U /μL )0． 2 μL、引物浓度(10 μmol /L)1
μL、模板 DNA(20 ng /μL)1 μL、10 × Buffer 3 μL、
D3H2O 13． 8 μL。优化 PCR 扩增反应程序为:94℃
预变性 10 min;94℃变性 1 min，53℃或 55℃退火 1
min，72 ℃延伸 2 min，45 个循环，72℃保温 7 min，然
后在 4℃保存。从 63 条常用 ISSR 引物序列中筛选
出 7 条［6］，引物由上海生工生物工程技术有限公司
合成，引物序列和退火温度见表 2。产物用 3%琼脂
糖凝胶电泳、银染法检测。在 PTC-100PCR 仪上进
行扩增，Gel Doc2000TM凝胶成像系统观察、照相。
1． 3 数据处理
根据表征矩阵，统计扩增产物的条带总数和多
态性条带的数量，计算多态性条带所占比率(P)和
单位引物多态性条带数;根据基因频率矩阵，用
Popgene32 软件和 SPSS 软件［7］计算观测等位基因
数(A) ，有效等位基数(Ne) ，Shannon 多样性指数
(I) ，总基因多样性(Ht) ，种内(属内、居群内、地区
内)基因多样性(Hs) ，基因分化系数(Gst) ，基因流
(Nm)和多态信息指数(PIC) ，依据 Jaccard 系数按
不加权成对群算术平均法(UPGMA) ，在 NTSYS-pc-
Version2． 1 统计分析软件系统中进行聚类分析［7］。
2 结果与分析
2． 1 ISSR扩增片段的多态性分析
对筛选出扩增条带较多、结果稳定清晰的 7 个
随机引物 ISSR谱带，统计结果见表 2 和表 3。12 份
冰草属植物材料中共检测出 88 条谱带，多态性谱带
83 条，多态性条带的比例为 94． 32%。平均每条引
物扩增出 12． 57 条谱带，11． 86 条谱带为多态性谱
带。不同引物扩增的总带数和多态性谱带数不同，
产生总谱带数最多的是引物 UBC815(20 条) ，谱带
数最少的引物为 UBC808(8 条)。多态性比例最高
的为 100%，最低的为 75． 0%。每个引物所扩增出
的谱带数都表现出差异，不同引物在同一材料上扩
增差异较大，最大变幅为 1 ～ 6。
62 华 北 农 学 报 25 卷
表 2 ISSR引物的核苷酸序列
Tab． 2 The squence of ISSR primers
引物
Primer
序列(5→ 3)
Sequence
退火温度 /℃
Annealing
temperature
位点总数
Total
locus
多态性位点数
Polymorphic
locus
多态性位点百分率 /%
Polymorphic
percent locus
UBC808 5-AGAGAGAGAGAGAGAGC -3 55 8 6 75． 00
UBC815 5-CTCTCTCTCTCTCTCTG-3 55 20 20 100． 00
UBC825 5-ACACACACACACACACT-3 53 9 8 88． 89
UBC840 5-GAGAGAGAGAGAGAGAYT -3 53 15 14 93． 33
UBC845 5-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3 55 11 11 100． 00
UBC856 5-ACACACACACACACACYT-3 53 12 11 91． 67
UBC857 5-ACACACACACACACACYG-3 53 13 13 100． 00
总数 Total 88 83 94． 32
平均数 Mean 12． 57 11． 86
表 3 7 个引物对冰草属植物扩增的结果
Tab． 3 Result of 7 primer amplification for Agropyron Gaertn
引物
Primer
种名和居群编号 Species and populations number
冰草
A． cristatum
细茎冰草
A． trachy
caulum
光穗冰草
A． cristatum． var．
pectinforme
沙生冰草
A． desertorum
蒙古冰草
A． mongolicum var．
mongolicum
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
变幅
Range
UBC808 2 5 5 6 4 6 5 4 4 6 4 3 2 ～ 6
UBC815 5 4 3 3 6 3 4 5 6 6 2 4 2 ～ 6
UBC825 3 3 2 3 3 6 2 3 1 3 3 2 1 ～ 6
UBC840 5 5 3 6 5 7 6 3 2 4 6 5 2 ～ 7
UBC845 3 4 2 5 4 6 4 3 4 4 3 1 1 ～ 6
UBC856 2 2 3 3 3 7 5 4 3 3 3 6 2 ～ 7
UBC857 3 3 3 5 4 5 3 3 3 4 4 3 3 ～ 5
2． 2 基于 ISSR标记的各遗传参数比较分析
有效等位基因数 Ne、多态信息指数 PIC、Shan-
non多样性指数 I 和多态位点比例 P 是反映遗传多
样性和遗传结构的几个主要指标，具有重要的遗传
学意义［8］。基于 7 个引物扩增得到的谱带数据，分
别进行计算等位基因数、有效等位基因数、多态信息
指数、Shannon多样性指数和多态位点比例(表 4)。
由表 4 可以看出，种水平上，有效等位基因数、多态
信息指数和 Shannon多样性指数三个遗传参数表现
出的遗传差异为蒙古冰草 ＞冰草 ＞细茎冰草 ＞光穗
冰草;而等位基因数和多态位点比例表现出的遗传
差异为冰草 ＞蒙古冰草 ＞细茎冰草 ＞光穗冰草。种
间遗传多样性指数(0． 144 0)高于种内遗传多样性
指数(0． 111 6) ;种间遗传分化为 0． 563 5，表明种内
的遗传分化占 43． 65%。由表 5 知，冰草地区间遗
传多样性指数(0． 221)高于地区内遗传多样性指数
(0． 069 0) ，76． 2%的遗传变异发生在地区间。
表 4 冰草属植物 12 个居群遗传参数
Tab． 4 Genetic differential parameters for 12 populations of Agroyron Gaertn
种名
Species
等位基因数
Number of
alleles
有效等位基因数
Effective number
of alleles
多态信息含量
Polymorphic
information
content
Shannon
多样性指数
Diversity
index
多态位点
比例 /%
Polymorphic
percent locus
冰草 A． cristatum 1． 826 1 1． 556 5 0． 328 8 0． 484 4 82． 61
蒙古冰草 A． mongolicum var． mongolicum 1． 775 5 1． 620 4 0． 344 7 0． 493 6 77． 55
细茎冰草 A． trachycaulum 1． 620 0 1． 620 0 0． 310 0 0． 429 8 62． 00
光穗冰草 A． cristatum． var． Pectinforme 1． 578 9 1． 578 9 0． 289 5 0． 401 3 57． 89
种水平 1． 943 2 1． 394 4 0． 247 4 0． 391 0 94． 32
整体 Total Ht 0． 255 6
种内 Hs Within species 0． 111 6
种间 Dst Between species 0． 144 0
基因分化系数 /% Gst 56． 35
Coefficient of gene differentiation
基因流 /% Nm Gene flow 38． 73
增刊 闫伟红等:冰草属植物 ISSR遗传分析与评价 63
表 5 冰草在不同地区内和地区间的遗传多样性分布
Tab． 5 Partition of genetic diversity of A． cristatum within and between different areas based on 7 primer
引物
Primer
整体
Total Ht
地区内
Within regions Hs
地区间
Between
regions Dst
基因分化系数
Coefficient of gene
differentiation Gst
基因流
Gene flow Nm
均值 Mean 0． 290 0 0． 069 0 0． 221 0 0． 762 0 0． 156 2
2． 3 依据 ISSR标记的聚类分析
依据 Jaccard 遗传相似系数矩阵，采用 UPGMA
法进行聚类分析，获得基于 ISSR 标记的聚类图(图
1) ，当 GS 为 0． 322 时，可将 12 份冰草属种质材料
分为三类，第Ⅰ类包括三份冰草、两份光穗冰草、一
份沙生冰草和一份蒙古冰草;第Ⅱ类材料由两份蒙
古冰草和一份冰草组成;第Ⅲ类材料是两份细茎冰
草。从聚类结果可以看出，同种不同材料基本能够
聚在一起，但有交叉现象，具体表现在来自山西偏关
蒙古冰草材料和内蒙古呼郊冰草材料，与上述冰草
属材料醇溶蛋白分析结果一致，表明这两份材料在
自然选择、适应生存过程中发生了遗传分化。部分
材料聚类表现出地域性，来源相近的材料能够聚在
一起。上述结果与王方［8］利用 ISSR 标记技术研究
国外冰草属植物遗传多样性得出材料地理来源与聚
类结果相关的结论相似。
图 1 12 份材料基于 ISSR标记的聚类图
Fig． 1 Dendrogram of 12 Agropyron Gaertn． germplasm resources based on ISSR marker
以 7 个引物的扩增产物在每个多态位点的不同
迁移率的谱带出现的频率计算物种间的遗传距离，5
个冰草属野生栽培种的聚类分析结果如图 2，可以
看出种间亲缘关系表现为冰草→蒙古冰草→光穗冰
草→沙生冰草→细茎冰草。与上述物种醇溶蛋白分
析结果类似，验证了冰草属物种传统形态分类的系
统演化和进化关系。同时结果表明冰草属植物进行
异地活体保存具有遗传稳定性，异位保护是该属植
物资源的有效手段之一;ISSR 标记可以作为检测该
属植物亲缘关系和遗传变异的分子标记之一。
图 2 冰草属 5 个种基于 ISSR标记的聚类图
Fig． 2 Dendrogram of 5 species Agropyron Gaertn． germplasm resources based on ISSR marker
3 讨论
ISSR是在 SSR 的基础上发展起来的一种新型
的分子标记，与 RAPD相比，ISSR 标记重复性高，产
生的多态性更丰富［10，11］。与 SSR 相比，ISSR 技术
不需要预先知道基因组序列信息，因此大大减少了
多态性分析的预备工作［9］。与 AFLP 相比，ISSR 技
术具有程序简单、快捷和成本较低的优点［10］。目
前，李永祥［12］利用 ISSR标记选用 33 条引物对披碱
草属 12 个物种进行遗传多样性检测，结果发现，18
个 ISSR引物扩增出 486 条谱带，多态性位点百分比
率为 84%，表现出较高的多态性。尚海英［13］利用 7
64 华 北 农 学 报 25 卷
个引物对 16 份黑麦属材料进行同样的研究发现，7
个引物共扩增出 269 条谱带，其中 229 条谱带
(85. 1%)具有多态性，可以有效的评价黑麦属的遗
传多样性。
ISSR标记可以揭示整个基因组的一些特征，并
呈孟德尔式遗传，因此该技术一问世就被广泛应用
于植物遗传作图与基因定位、种质资源鉴定、植物分
类、进化及遗传多样性研究［14］。本试验采用 ISSR
标记对 5 种 12 个冰草属植物居群进行遗传分析和
评价，结果发现种间遗传差异显著，依次为蒙古冰草
﹥冰草﹥细茎冰草﹥光穗冰草，而醇溶蛋白分析结
果为冰草 ＞蒙古冰草 ＞光穗冰草 ＞细茎冰草，二者
研究结果存在差别，研究还发现基于 ISSR标记遗传
分析的遗传多态性和各遗传参数值均高于醇溶蛋白
分析得出结果，因此 ISSR标记检测结果更具有说服
力，可靠性更强，进而说明 DNA 分子水平更能较好
的反映本研究所选物种的真实遗传特性，而不易受
外界环境的干扰。
基于 ISSR标记的冰草属物种系统关系研究，结
果表现为冰草→蒙古冰草→光穗冰草→沙生冰草→
细茎冰草，这与车永和［15］结合醇溶蛋白的 A-PAGE
和 SSR 两种技术检测结果，推测冰草属植物在我国
境内的四个物种系统演化关系，冰草和蒙古冰草可
能为原始的亲本，而沙生冰草可能为冰草和蒙古冰
草杂交种的衍生物种结论相似，也与传统植物志描
述光穗冰草是冰草的变种相符。原因是分布于我国
的上述 4 个冰草属物种，从它们的遗传距离和外部
形态上可以看出它们间相对的系统进化关系，沙生
冰草遗传距离介于冰草与蒙古冰草之间，同两者之
间的遗传距离分别为 0. 163 5 和 0. 813 7;而在田间
形态学观察上，沙生冰草居于冰草和蒙古冰草的中
间状态;因此，从遗传距离和外部形态推测，沙生冰
草为冰草与蒙古冰草天然杂种的衍生种。另外，由
于沙生冰草居群数目较少，也可能是影响种间亲缘
关系没有完全反映出沙生冰草位于冰草和蒙古冰草
的中间状态的原因，但本研究还是发现居群聚类时
沙生冰草位于冰草和蒙古冰草中间状态。
5 种 12 份冰草属材料表现出较高的 DNA 分子
水平的遗传多样性，表现为种间差异大于种内差异;
冰草物种地理类群间遗传变异较大，遗传多样性丰
富。这与车永和［16］利用 SSR 标记技术研究 P 基因
组植物系统演化关系得出冰草属植物遗传分化主要
发生在种内和地区内结论相反，与孙志民［16］利用
RAPD标记技术研究冰草属植物遗传多样性获得种
间遗传多样性最小结论相反。原因可能是对所选物
种材料各遗传参数与原生境环境因子进行相关分
析，并没有表现出显著或极显著相关性，说明生态环
境因素造成的差异不大，只是小生境发生了变化;而
主要是由所选物种材料本身遗传特性，异花、风媒传
粉的外繁育系统与引种栽培的试验区没有进行生殖
隔离所决定的，可能会由于不同属、种间的天然杂
交，以及与当地生境自然选择的作用，导致它们发生
了趋同适应，形成了上述冰草属物种的遗传结构。
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