全 文 ：范 围在 6 .0一 8 0 ., 最 适 生 长的 川 范围在
6
.
5一 7 . 5 之间 , 与过去报道的 rF 幼砂。 内生菌株
相比 , 它所要求的 PH 偏高 。 图 4 表明 , ce l 5 1 3
菌株生长最适温度为 3 0尸 34 ℃ , 它的温度要求
亦高于已报道的 rF 阴形。 菌株 。 该菌对 声 与
温度的要求与其它 F ar 碱 ia 菌株有差异 , 可能
是宿主植物原产于热带沿海沙滩中 , 是否是这
种特殊生境所影响 , 有待进一步探讨 。
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.
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.
P a r 行 , 2 9 5 ( S毛r i e
t 峪 ] 蒋建德 、 朱宝琴 : 科学通报 , 3 : 2 2 5一 2 3 1 , 19 5 5 。
〔 5 ] aL l e o d e M . e t al . : in C ur r e n t P e r s p e c : 10 in N it r .o
g en P i : a d c。 ( ed
.
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19 8 1
.
[ 6 ] L
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,
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p r e s .
,
o r e n g o n
,
p
.
9 ,一 20 , 1 97 , .
[ 7 ] 玫祈萝 0 . H . e t a l . : J . B i o l . C人e。 , 1 9 3 : 2 6 5一2 7 5 ,
19 5 1
.
[ 吕 ] B u r g g r a a f A . J . P . e t a l . : P l a , z a , d 5 0 才l , 6 1 : l 乡7一
1 6 8
,
1 9 8 1
.
[ 9 ] S h ip
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.
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.
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.
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.
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.
B u r g g r a a f : p l o . a , 才
5 0 11
,
69 : 14 9
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.
19 8 2
.
〔1 0 ] B e n s o n D . R . : 办 IP 亩e d a耐 Eo i , o二 , , at l M i c r o -
b i o l
,
44 ( 2 ) : 4 6 1一 4 6 5 , 19 8 2 .
[ 1 1 ] Bl
。边 J . et a l . : F E材 5 M i c r o b矛0 1. 仓 t : , 9 : 13 1一
1 3 5
,
l , 8 0
.
[ 12 ] B l o m J
.
: F E M占 材介 r o厉 0 1. 肠 , : , 1 3 : 5 1一 5 5 , 19 8 2 .
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三种胡颓子科植物根瘤内生菌培养条件研究
杜大至 原福虎 李荣儿
(山西省生物研究所 , 太原 )
顾 德 峰
(山西农业大学 , 太谷 )
弗兰克氏菌与一些非豆科植物所建立的共
生固氮作用 , 对于增加土壤肥力 , 提高林业生
产力起着重要作用 。 近年来 , 国内外已从不同
的非豆科植物根瘤中分离出一批弗兰克氏菌菌
株。 一 31 。 而非豆科植物的共生固氮 , 已成为生物
固氮研究中一个十分活跃的领域 。 但是迄今所
分得的弗兰克氏菌株都属于慢生长型 , 培养菌
体所需要的周期长 , 所能收集到的菌体量也非
常少。 L汕 vc 公er 等 t’1 曾对分离自 7 属 12 种植
物根瘤的 巧 株弗氏菌进行过测定 ,每毫升培养
液收集到的湿菌体为 2一 l , m g , 大约相当于链
霉菌的百分之一。 我们从胡颓子科的四种植物
根瘤中所分离的 60 余株弗兰克氏菌 ,每毫升培
养液也只能收集到 大 约 4一 20 毗 湿 菌 体 。 因
此 , 如何在短时间内收集到大量菌体 ,这便成为
将弗氏菌尽早应用于生产实践所首先应解决的
问题 。
弗兰克氏菌由共生状态改变为在人工培养
基上生长 , 其生态条件和营养条件都发生了较
大改变。 尽管对其共生的机理目前所知甚少 ,
但条件的改变及遗传的因素应是菌体生长缓慢
的主要原因 。 本试验旨在探索从胡颓子科不同
属 、 种的寄主植物根瘤中分离的弗兰克氏菌离
体培养的最适生长条件 , 以便增加菌体的收集
量 , 来逐步满足基础研究和应用研究的需要 。
材 料 和 方 法
(一 ) 供试菌
F ,
·
a n不召 印 · H r 3 19 菌株 , 寄主植物 : 中国
菌体蛋白的测定 , 由山西省生物研究所技术室武秀珍 、 翟
云梅 、莫海云 同志协助 ,特此致谢。
.’ 2唯8 -
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 1986. 06. 003
沙棘 ( I HPP oP h a e r几a ” , Oi d c ` L · s s p
oR
u s i )
o 二邓 刀己月口了 以 c F一 1 号为基础培养基 , 改 用适于各菌株生长的碳源 、 氮源 。 将 H r 3 19 菌株接 种 于
c F一 2 号培养基 ( g /l ) : 碳源为果糖 1 0 , 氮源为
牛肉膏 5 、 天门冬素 .0 , ; E u2 26 菌 株 接 种 于
C F一 3号 ( g /l ) : 鼠李糖 1 0 , N .H C I 1 . 0 ; E m 2 8 1
菌株接种于 C F一 4 号 ( 9 1 ) : 果糠 10 , 牛 肉青
1 0 0
C M s
一 1 号 为各 供试菌 的 分 离培 养 基 ;
Qm o d 6[] 为国际上分离 、 培养弗兰克氏菌的较好
培养基 ; lB o m 培养基配方由中科院林业 土 壤
研究所提供 ; 克氏合成一号 、 葡萄糖天门冬素 、
马铃薯浸汁培养基为放线菌分类 鉴 定 用 培养
基 〔” , 各供试菌在这三种培养基上生长较好 。
结 果 和 讨 论
(一 ) 曹养因素
四株供试菌对各种碳源的 利 用 情况 见 表
1 o
衰 1 各 , 株对不同暇滚的利用一况
菌体蛋白 (川 g /管 )
碳 源
L l r 3 19 l了 u 2 2 6 Em 2 8 1
目j吮Jn, , .了O声d.ō勺6-J,已JtU.….`nUO,L`.1óUnù
F r a n石。 s p · E u 2 2 6 菌株 , 寄主植物 : 伞花
胡颓子 ( lE a o a g 。 “ 5 u m b o l l a t a T h u n b . ) 。
F r a诚 i口 s p · E tn Z s l 菌株 : 寄主植物 : 翅
果油树 ( lE a o a g o u s , 0 111, n i le s ) 。
(二 ) 菌体的培养 、 接种与生长 t 的测定
试验在 20 x 巧 0~ 的螺 口试管 中 进 行 ,
每管装培养基 1 0 d 。 接种后除温度试验外均
于 28 ℃ 恒温培养 , 2。、 4 0 天测定结果 ,每次测
3 管菌 , 结果取平均值 。 离心收集供接种用的
菌体 , 磷酸缓冲液 ( 50 m M , p H .7 0) 冲洗 3 次 ,
用组织研磨器研碎菌体并制成菌悬液 , 接种量
约 为每管 10产g 蛋白。 用菌体的蛋白量代表生
长量 , 菌体蛋白用紫外分光光度法测定【习 。
(三 ) 营养杂件
以 C F一 1 号 为基 础 培养 基 ( g l/ ) : K N q
0
.
5 、 K H tP O
; 0
.
5
、
M g s q
·
7 H
:
0 0
.
2
、
C a以 : ·
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:
0 0
.
1
、 天门冬素 0 . 5 、 蔗糖 2 0 、 并加人 M s
培养基的 eF 一E D T A 液 2 . ,而 、 微量元 素母 液
Iln
, p H 6
.
7
o
1
. 碳源利用 : ’ 以去掉碳源的 C F一 1 号为基
础培养基。 除 T w 。。 80 的浓度为 .0 2务外 , 其
余碳源浓度均为 1拓 , 紫外线杀菌 。
2
. 氮源利用 : 在无氮的 即一 l 号基础培养
基内分别加人 0 . 1务 的氨态氮 、 硝态氮和 l 沁的
有机氮 , 以及 0 . 0 5多 的各种氨基酸 , 并配制无
氮培养基 。
3
. 其它辅助成份 : 在 CF 一 1 号培养基 中分
别加人卵磷脂 ( 1 0m g /l ) 、 玉米素 ( 2拌g / l ) 、 激
动素 ( .0 , m g /l) 以及 l d M S培养基的 维 生 素
母液 。
(四 ) 生态杂件
1
. 温度 : 将供试菌接种在 C F一 1 号培养基
中 , 置不同温度下培养 20 、 40 天 , 分别测定结
果 。
2
.
p H 值 : 将供试菌接 种 在不 同 p H 的
C F一 1 号培养基中 ,培养 20 、 4 0 天 , 分别测定结
果。 ,
(五 ) 培并签对比试验
D
一果牺
D
一木链
蔗 摘
菊 塘
L
一鼠李塘
D ( 十 )葡萄塘
L
一阿拉伯就
麦 芽 塘
山 梨 塘
甘 露 塘
棉 子 搪
乳 精
半 乳 塘
苹果酸钙
甘 油
肌 醇
甘 露 醉
吐温一80
吐温 一 80 十 2% 葡萄艳
0
。
8 7
0
。
9 3
0
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ù一130CUn甘ù八“
表中“ 一 ” 表示未长 。
除表 1 所列 , 各供试菌都不能 利 用 D 一山
梨醉 、 糊精 、淀粉 、葡萄糖酸钠 、 柠檬酸钠和醋酸
钠。
本试验的结果说明 , 不同的弗兰克氏菌株
对碳源的利用是有差异的 。 尽管在某些菌株之
间可能存在适于它们生长的相同碳源 , 但要想
找到一种适于所有菌株生长的碳源却是不可能
的。 许多糖 、糖醇 、 脂类或有机酸及其盐类都能
作为菌体生长的唯一碳源囚 。 国外的研究者还
将菌株对 T w e 8n 0 的利用情况作为区别不 同
生理型的重要标志〔们。 L e e h e v a l i e r 等〔嘴,曾经证
实 , 某些弗兰克氏菌可以 T w e e n 80 为唯一碳
源 , 在加 2沁浓度葡萄糖的培养基上加 T w e n
80
, 二者协同作用于细胞 , 比分别用两种碳源
菌体增重 “ 沁。 而有些菌株在含 T w e 砧 0 的
培养基中则可能因为脂肪酸的积累生长反而受
抑制。 本试验所选用的三株供试菌中 , H r 3 19
和 E u 2 2 6 菌株不能以 T w e e o 8 0 为唯一 碳 源 ,
在葡萄糖浓度为 2务 的 培养基 中 加 T w e sn o
反而抑制生长。 Em Z s l 菌株在以 T w e e n s o 为
唯一碳源的培养基中生长极差 , 但在 2并 浓度
菊萄糖的培养基中加 T w e en 8 0 时 , 比在 只有
2 外浓度葡萄糖的培养基中菌体有所增长。 看
来三株菌有可能属于不同的生理型 。
弗兰克氏菌对氮源的利用也是不同的。 有
的菌株只能利用氨态氮而不利用硝态氮 , 有些
则可以利用有机氮 。 三株供试菌对各种氮源的
. 2 各 , 株对不网纽洲的利用情况
菌体蛋白 ( m g /管 )
氮 源
H r 3 1 9 E u 2 2 6
K N O ,
N H一C I
( N H
一
)
:
5 0
-
酵母浸汁
班 白 陈
牛 肉 青
甘 振 酸
L一天门冬酸
D L 一“ 一丙氨酸
L一酪氮酸
L ( + )
一谷氮酸
L
一赖氨酸
。
68
。
9 4
:;:
利用见表 2。
表 2 表明 ,尽管三株菌都可以利用氨态氮 、
硝态氮以及表中所列的大部分有机氮 , 但对于
H r 3 19 菌株来说 , 三种无机氮和牛肉膏都是较
好的氮源 ;而 E u2 26 菌株最好的氮源是 N H ; cl ,
其次是 L ( + ) 一谷氨酸 ; E m 2 81 菌株对三种无
机氮的利用都比较差 , 而对有机氮的利用则比
较好 。 其最佳氮源是牛肉膏 。 酵母汁中虽然富
含各种氨基酸和维生素类 , 但各菌株在以它为
氮源的培养基中都不能生长 , 可能其中含有某
种抑制菌体生长的物质。 此外 , 三株菌都能在
无氮培养基中较好地生长 , 说明即便在人工培
养条件下 , 供试菌也可以空气中的氮气为氮源 。
一些外源维生素及其它一些辅助因子 , 对
于供试菌的生长看来并非是必需的 。 本试验所
附加的维生素母液 、 卵磷脂 、 玉米素 、 激动素等 ,
对三株菌的生长均无明显的影响。
三株供试菌均采用作者等自己试验成功的
组织培养法山分离 , 菌株的某些生理生化特性
与国外所报道的弗兰克氏菌株有一定差异。 而
基础培养基所用碳 、 氮源的种类也与国内外所
报道的不尽相同。 而国外进行弗兰克氏菌的生
理试验 , 多以分离自恺木属 ( lA 、 习 的内生菌
为主 , 本试验则以沙棘属 (球P ap 无a 。 ) 和胡颓
子属 ( lE ae o g . )t 的内生菌为材料 , 其中翅果
油树为山西的特有树种 。 这就有可能加深对弗
兰克氏菌生理特性更广泛的了解 。
(二 ) 生态因紊
本试验对三株供试菌生长的 p H 范围 、 最
适 p H 以及温度范围和最适生长温度进行 了 测
定 , 结果见表 3。
o
·
3
1
2
。
0 /
农 3 沮度和 p H 对供试 . 生长的影响
温度 (℃ )
0
。
5 1
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表中“ 一 ” 表示未长 。
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2 , 0
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看来不同菌株的最适生长温度和 p H 是基
本相似的 , 但能够生长的温度和 pH 范围却有
犷2549683nóénUn八1nUùU
一定差异。 这在一定程度上可能与原寄主植物
的生态环境有关。 沙棘是一种耐寒 、 耐盐碱 、 适
应性很强的树种 。 分离自这种 寄 主 的 Hr 31 9
菌株的生长温度和 pH范围都比较广。 而翅果
油树生长于山西南部 , 当地气候比较温和 ,土壤
基本属中性 , 分离自翅果油树的 E m 28 1 菌 株
生长温度和 p H 范围都相对较窄 。 这可能是这
些菌株在各 自长期的生态环境中与寄主共生所
形成的遗传特性 。
(三 ) 培养甚的对比试验
供试菌在各种培养基上的 生 长 情 况 见 表
弓o
农 4 供试曲在各种培养若中的生长情况
长缓慢 、不易收集菌体的问题无疑是一个进步 。
从上述试验结果可以看出 , 就胡颓子科而
言 , 分离自不同属 、 种寄主的弗兰克氏菌株 , 在
人工培养条件下所适宜的营养条件和生态条件
是不尽相同的。 要提高其生长速度 , 首先必须
摸清并满足这些条件。 ’当然 , 弗兰克氏菌的营
养和代谢是一个极为复杂的生理生化过程 , 除
本试验所探讨的几种因素外 , 还有其它一些因
素影响着它们的生长。 所以在基础研究和实际
应用中 , 必须根据各菌株的不同特点 , 综合考虑
各因素之间的相互关系 , 以便满足菌种生长的
不同需要。
菌体蛋白 ( m g /管 ) 参 考 文 献培 养 基
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,
E l s e v i e r / N o r t h
一
H o l l a dn B i
o m
e
d i“ I P代” , p .
4 7 9 , 19 8 1
.
杜大至等 : 微生物学报 , 24 ( l :) 4卜 一朽 , 1 98 4。
蒋建德等 : 生态学杂志 , 3 : 42一 4 3 , 30 , 1 98 3 0
L e e h e v a l e r
,
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.
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.
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.
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8 , 198 2
.
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,
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.
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,
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, 4 4 7
,
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:
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x a t i o n in t h e M a n g e m e n t o f T 七m p e r a t u r e F o r e .
( J
.
C
.
G o r d o n e d
.
) ( O r e g o n S t a t e U n i
v e r s i t y
,
O R )
,
P P
.
95一 1 1 0 , 19 7 9 .
阮继生 : 《放线菌分类基础》 ,科学出版社 ,北京 , 19 77 。
M u
r r y , M
,
A
.
e t a l
.
: F
r a 二花i a S ym b i o s e s , M a r d n “
N i ih o f f / D r
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, T h e H a g u e
,
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6 1一 7 8 , 19 8峪·
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表中“ 一 ” 表示未长。
从表 4 可知 , 供试菌在修改后的各种培养
基中 , 生长量不仅比在原分离培养基 C M S一 1号
中增重 3一 4 . 6 倍 , 而且比在其他培养基中的生
长量也有较大幅度增长。 这对于解决供试菌生
{; {
香 菇 的 杂 交 育 种 研 究
1
. 抱子 、 单核菌株 、 异核体的观察与判别
张厚铿 孙慧明 舒娅玲
(江西省林业科学研究所 , 南昌 )
香菇 [ eL , ri , u , e d o d。 , ( B e n k ) s i n g ] 是我
国的传统食用菌 , 但单产较低 , 特别是以木屑
为主的代料栽培中产量更低 , 通过杂交育种途
径 , 培育新的优良香菇品种 , 是提高香菇品质
与产量的积极措施 。 本文报道香菇杂交育种中
抱子收集和异核体形成以及判别方法等试验研