全 文 ：菌 物 学 报 25（2）：217~226, 2006
Mycosystema
中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及 rDNA-ITS系
统发育分析
李 伟 纪燕玲 于汉寿 莫凌霄 李飞凤 王志伟*
（南京农业大学生命科学学院微生物学系，南京 210095）
摘 要：采用 RAPD技术对分离自我国的 13株 Epichloë spp. 和 9株 Neotyphodium spp. 的禾本科植物内生
真菌进行了遗传多样性分析，同时对其中的 4株进行了 rDNA-ITS序列分析及系统发育研究。RAPD分析
结果显示：原产自我国的菌株与原产自欧洲的菌株 N. uncinatum之间亲缘关系较远；我国的 21个菌株之
间也存在一定的遗传多样性。rDNA-ITS 序列分析表明：原产自我国的菌株聚为一枝，表明我国的
Neotyphodium 属真菌很有可能直接由我国的 Epichloë 属真菌演化而来的新的类群；我国的 Epichloë 属真
菌有可能和国外推测的一个未确定的 Neotyphodium属真菌的杂交进化起源 (LAC) 有关。
关键词：Epichloë，Neotyphodium，分类群，进化起源
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2006）02-0217-0226
Genetic diversity and rDNA-ITS sequence analysis of endophytic
fungi isolated from gramineous plants in China
LI Wei JI Yan-Ling YU Han-Shou MO Ling-Xiao LI Fei-Feng WANG Zhi-Wei
(Department of Microbiology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)
ABSTRACT: Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was used to characterize the genetic
diversity of 13 isolates of Epichloë spp. and 9 isolates of Neotyphodium spp., the endophytic fungi of gramineous
plants, obtained from grasses grown in China. According to the RAPD analysis, the isolates indigenous from
China were distinctly different from those of N. uncinatum native to Europe. The result showed that the abundant
genetic diversity existed in Chinese isolates. Three Chinese isolates of Neotyphodium (N2, N6 and N12) and 1
Chinese isolates of Epichloë (E3) were selected and subjected for the rDNA-ITS sequence analysis. All of these 4
isolates were clustered a distinct clade, which indicated that these isolates maybe a new taxonomical group, and
Chinese Neotyphodium was possibly derived from Chinese Epichloë. The results also indicated that a Chinese
Epichloë isolate (E3) was possibly phylogenetically related with Lolium-associated clade (LAC), an ambiguous
evolutionary source predicted in other studies.
KEY WORDS: Epichloë, Neotyphodium, taxonomical group, evolutionary source

Epichloë属和 Neotyphodium属真菌都是冷季型禾本科植物的内生真菌，它们和宿主植
物之间有着严格的宿主特异性(Schardl, 1996)。Epichloë 属是较早记录的真菌之一，但是直

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30070019）
*通讯作者：E-mail: zwwang@njau.edu.cn
收原稿日期：2005-11-08，收修改稿日期：2006-02-22
DOI:10.13346/j.mycosystema.2006.02.009
218 菌 物 学 报 25卷
到 1977年 Bacon等人发现感染 E. typhina的禾本科植物对家畜有显著的毒性前，该属真菌
除了作为香柱病的病原物以外，几乎没有引起研究人员注意(Bacon et al., 1977)，该属的成
员也只有 E. typhina (Pers.) Tul一个种(White, 1993)。Neotyphodium属则包含了所有的禾本
科植物内生真菌的无性型种。它们系统分布于宿主植物的地上部分(Schardl et al., 2004)，使
宿主植物对生物（昆虫、食草动物、植物病原菌等）或非生物（干旱、寒冷、高温等）的
胁迫具有更强的抗性(Clay, 1990; Schardl, 1996; Schardl et al., 2004)，因此在世界各地日益受
到重视。
Epichloë 属真菌能感染 7 个族 16 个属以上的禾本科植物，但是它们在形态上没有大
的差别，因此，在以形态学特征为主的经典分类中，代表种 E. typhina 成为感染很多植物
的大种(Clay, 1990；White et al., 1993)。同样，Neotyphodium属真菌能感染 5个族 13个属
以上的禾本科植物，在经典分类学的系统中被归入 Acremonium属的 Albo-lanosa组，其中
的菌株在形态上绝大多数和 A. typhinum Morgan-Jone et W. Gams相似(Clay, 1990；White et
al., 1993)。Glenn等(1996)利用 18S rDNA的系统发育学信息将Albo-lanosa组从 Acremonium
属中独立出来，成立了 Neotyphodium属。从此，在 Epichloë属和无性型 Neotyphodium属
真菌的分类鉴定中，除了形态学特征以外，系统发育学关系成了不可缺少的证据。事实上，
系统发育学证据被采用以来，大量的新种不断被报道 (Moon et al., 2002, 2004; Schardl et al.,
2004)。到目前为止，Epichloë属真菌已经发现了 10个种，其中 6 个欧洲种和 4个北美洲
种 (Schardl et al., 2004)，但没有从亚洲发现新种。Neotyphodium属真菌已经发现至少 14
个种 (Moon et al., 2002, 2004)，我国的禾草中也存在 Neotyphodium属内生真菌 (Li et al.,
2004; 王志伟等, 2005)。
大量的分子系统学数据显示，Epichloë属真菌种间，以及 Epichloë和 Neotyphodium属
间在进化上有着十分复杂的关系 (Leuchtmann & Clay, 1990; Schardl et al., 1994; Moon et al.,
1999, 2000, 2004; Craven et al., 2001a)。特别是最近几年对内生真菌的 β–微管蛋白基因 tub2
(β-tubulin)及翻译延伸因子基因 tef1 (translation elongation factor 1-α)的分析进一步证明：N.
lolli (Latch et al.) Glenn et al.、N. aotearoae Moon et al.和 N. inebrians (JF White et
Morgan-Jones) Glenn et al.等种是直接由 Epichloë的某一个种进化而来的，但与 N. aotearoae
和 N. inebrians对应的有性型 Epichloë种却至今没有找到 (Schardl et al., 1994；Moon et al.,
2004)；而 Neotyphodium 属中更多的种则起源于不同的 Epichloë 的种间杂交，如 N.
australiense Moon et al.、N. chisosum (JF White et Morgan-Jones) Glenn et al.和 N. occultans
Moon et al.等。N. occultans被认为是由 E. bromicola Leuchtm. et Schardl和一个未确定的进
化源 Lolium-associated clade (LAC)杂交而来 (Craven et al., 2001a; Moon et al., 2004)。
Epichloë 属和 Neotyphodium 属之间的这种错综复杂的杂交进化关系给它们的分类带来困
难，单纯依靠形态学特征已经不能很好的满足分类鉴定的需要，分子系统学数据，尤其
Neotyphodium属真菌的进化起源成为分类鉴定的重要依据 (Tredway et al., 1999; Moon et
al., 2000, 2004; Craven et al., 2001a; Schardl et al., 2004)。正因为二者之间存在密切的进化关
系，这两个属的内生真菌又被统称为“epichloë endophyte”(Schardl et al., 2004)。
本研究采用RAPD技术对我国东部尤其是南京地区的内生真菌进行了遗传多样性的研
究，并根据 rDNA-ITS 序列进行了系统发育分析，与国外已经报道的菌株进行了比较。发
现我国的内生真菌菌株与国外菌株间有很大差别，同时也发现我国原产有性型的 Epichloë
2期 李 伟等：中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及 rDNA-ITS系统发育分析 219
菌株和 LAC 这一未确定的无性型菌株的进化源在系统发育学上关系非常密切。因此，我
国的这些有性型菌株可能是欧洲发现的某些无性型菌株的一个杂交源。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试 Epichloë属的 13个菌株及 Neotyphodium 属的 9个菌株均为本研究室分离、保存
（表 1）。其中 N. uncinatum(W. Gams et al.) Glenn et al. N8菌株分离自南京的草坪草苇状羊
茅 Festuca arundinacea Schreb. （原产欧洲）(纪燕玲等, 2003)。部分菌株送中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号见表 1。
表 1 本研究中供试内生真菌菌株的编号、来源
Table1 The origins of fungal isolates used in this study
菌株 分类 宿主植物 采集地点 保藏中心编号
No. of Strain Taxon Host Geographic origin AS No.
E1 Epichloë sp. 鹅观草 Roegneria kamoji Ohwi 江苏南京卫岗 AS 5.867
E2-E5 Epichloë sp. 鹅观草 R. kamoji 江苏南京紫金山 AS 5.868-AS 5.871
E6-E13 Epichloë sp. 鹅观草 R. kamoji 江苏南京玄武湖 AS 5.872- AS 5.879
N1, N2 Neotyphodium sp. 鹅观草 R. kamoji 河北唐山
N3 Neotyphodium sp. 鹅观草 R. kamoji 江苏南京
N4 Neotyphodium sp. 鹅观草 R. kamoji 江苏南京 AS 5.880
N6 Neotyphodium sp. 翦股颖属 Agrostis sp. 江苏南京 AS 5.884
N7 Neotyphodium sp. 翦股颖属 Agrostis sp. 江苏南京
N8
N. uncinatum (W. Gams et
al.) Glenn et al.
苇 状 羊 茅 Festuca arundinacea
Schreb.
江苏南京
N11 Neotyphodium sp. 鹅观草属 Roegneria sp. 福建福州
N12 Neotyphodium sp. 鹅观草 R. kamoji 江苏淮安 AS 5.881

1.2 总 DNA的提取
采用George等人的醋酸钾提取法 (George et al., 1998)对内生真菌的总DNA进行提取。
液体 GY培养基(per 1 L: 5 g glucose, 2 g yeast extract, 0.5 g MgSO4﹒7H2O, 3 g KH2PO4, 2 g
K2HPO4﹒3H2O, pH 6.5)培养 30天后收集菌丝。冷冻干燥后加入液氮充分研磨；约 25 mg
菌丝加入 650 μL提取缓冲液 (100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 50 mmol/L EDTA; 500 mmol/L
NaCl; and 1% SDS)，65℃温浴 30~45 min；加入 100 μL 5 M醋酸钾溶液充分混匀；采用 24：
1的氯仿-异戊醇溶液抽提；无水乙醇沉淀 DNA，最后 DNA沉淀溶于 100μL TE缓冲液(10
mmol/L Tris pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0)中，4℃保存备用。
1.3 RAPD扩增及检测
供扩增的 20条 10bp随机引物(A01-A20)购自南京生兴生物工程公司，从中筛选扩增产
物多态性丰富的引物，用于全部 22个供试菌株的 RAPD分析。25 μL扩增反应体系含 DNA
模板 1 μL (约 10ng)、10×缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)
2.5 μL、dNTP (10 mmol/L，2.5 mmol/L each) 2 μL、引物(0.2 μmol/L) 5μL、Taq酶 0.5 u，加
220 菌 物 学 报 25卷
ddH2O至 25 μL。在MyGeneTM热循环仪(LongGene, 杭州)上进行扩增反应，反应程序为：
94℃预变性 4 min，94℃变性 1 min，37℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 35个循环，最
后 72℃延伸 10 min。反应产物在 1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离(100 V，30 min)，经 EB染
色后，在凝胶成像系统下观察拍照。
1.4 rDNA-ITS扩增，克隆测序
扩增片段为核糖体 RNA (rDNA)的 ITS1，5.8S和 ITS2区域，引物为 ITS4 (5’-TCC TCC
GCT TAT TGA TAT GC-3’)和 ITS5 (5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’)。反应体
系含DNA模板1 μL（约10 ng）、10×缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，1.5 mmol/L
MgCl2) 2.5 μL、dNTP(10 mmol/L，2.5 mmol/L each) 0.5 μL、引物(0.2 μmol/L)各 1 μL、Taq
酶 0.5 U，加 ddH2O至 25 μL。反应程序为：94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，58℃退火
1 min，72℃延伸 45 s，共 35个循环，最后 72℃延伸 10 min。反应产物在 1.5％琼脂糖凝胶
上电泳检测(100 V，30min)。PCR产物电泳检测后切胶, 利用 3S柱离心式琼脂糖胶 DNA
快速回收试剂盒（Shenergy Biocolor，上海）进行回收。目的 DNA片段和载体质粒 pUCm-T
（Shenergy Biocolor，上海）的连接利用 PCR产物 T/A克隆试剂盒（Shenergy Biocolor，
上海）进行。连接产物转化到预先制备的 E.coli JM109感受态细胞中，PCR检测（反应程
序如上），将检验含有目的基因片段的 E.coli JM109菌液委托上海申能博采生物技术公司进
行测序。
1.5 数据分析
根据 RAPD电泳检测图谱，按照分子量从大到小的顺序，如果某一 DNA片段在某个
样品中出现，则赋值“1”，不出现赋值“0”，将随机引物对 22个菌株扩增片段多态性的分
子资料转化成二进制的数据。利用 STATISTICA软件以 UPGMA法进行聚类，生成菌株间
的亲缘关系树状图。
根据我国菌株的 rDNA-ITS 测序结果，在 GenBank 数据库中进行 Blast 比对，搜索同
源序列。尽量从不同地理位置，不同宿主植物中选取有代表性菌株序列作进一步的分析（表
2）。首先采用 Clustalx 1.81 (Thompson et al., 1994)将序列对齐，利用MEGA 3.0 (Kumar et al.,
2004)软件进行系统发育分析，并以自展法(bootstrap)进行检测，共循环 1000次，构建邻接
树（NJ树，Neighbor-joining tree）和最大简约树（MP树，Maximum parsimony tree）。
2 结果与分析
2.1 RAPD扩增及 rDNA-ITS测序结果
分别使用 20条引物进行 RAPD-PCR，考察它们的图谱，筛选了 A01、A02等共 12个
扩增产物多态性比较丰富的引物。对其图谱作进一步分析，12个引物对每个菌株扩增出的
清晰的谱带数大小在 0.4-2 kb之间，3-10条不等（图 1）。
从我国产的内生真菌中挑选了四株(N2、N6、N12和 E3)菌株进行了 rDNA-ITS的扩增
和测序。扩增产物包括 ITS1-5.8S-ITS2区段，共得到四条长度为 554bp的序列，其中 ITS1
为 171bp， ITS2 为 178bp。同时将测得的序列提交到 GenBank 中（序列号
DQ234804-DQ234807）。
2.2 供试菌株间的遗传多样性
依据 RAPD 扩增图谱，利用美国 STATSOFT 公司的 STATISTICA 软件，用 UPGMA
法构建 22个菌株的亲缘关系树（图 2）。Epichloë属 13个菌株聚为三个类群：E2和 E4-E6
2期 李 伟等：中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及 rDNA-ITS系统发育分析 221
聚为一组，E1、E3 和 E7 聚为一组，来自南京玄武湖的 E8-E13 聚为一组。Neotyphodium
属的 9个菌株聚类关系相对复杂：原产自欧洲苇状羊茅中的 N. uncinatum与我国的菌株亲
缘关系最远；来自河北唐山鹅观草属植物中的 N1、N2 及南京翦股颖属植物中的 N7 三个
菌株独立成组，与其它菌株的亲缘关系也比较远；江苏淮安鹅观草属植物中的 N12 与
Epichloë属的 E1、E3和 E7四个菌株聚为一组；来自南京鹅观草属植物中的 N3和 N4 高
度聚类；福建鹅观草属植物中的 N11和南京翦股颖属植物中的 N6聚类(图 2)。

图 1 引物 A01对供试 22个菌株扩增的 RAPD图谱
M：分子标记，N1-E13：供试菌株，CK：空白对照
Fig. 1 The RAPD finger printing of the 22 isolates amplified by Primer A01
M: Marker, N1-E13: the isolates for analysis, CK: Check
菌株间的亲缘关系与宿主植物种类及采集地点有一定的相关性：若以欧氏遗传距离
（以两变量差值平方和的平方根为距离）3.5 为阈值，则所有 13 个来自鹅观草属植物的
Epichloë 属菌株为一个类群；来自南京鹅观草属植物的 N3、N4 高度聚类。同时，分离自
我国的菌株也表现出一定的遗传多样性：来自福建鹅观草属植物的 N11和来自南京翦股颖
属植物的 N6 聚类；同样来自河北唐山鹅观草属植物的 N1、N2 独立成组。此外，亲缘关
系树明确显示：原产自我国的所有菌株与原产欧洲的 N. uncinatum N8之间亲缘关系比较远
（图 2）。
2.3 rDNA-ITS序列的系统发育分析
用于系统发育分析的33个菌株的 rDNA-ITS序列（包括 ITS1-5.8S-ITS2）长为500-557bp
（序列来自GenBank，表 2）。MEGA3.0软件构建的MP树步长＝87，一致性指数(CI)=0.782，
总留存指数(RI)＝0.855，总尺度化一致性指数(RC)＝0.668（图略）。NJ树与最大简约树拓
扑结构相似。
系统发育树的拓扑结构显示：原产自我国的四个菌株（N2、N6、N12 和 E3）在同一
个分枝上，以 68％的支持率与 N. occultans（欧洲），N. uncinatum （欧洲）聚为一组 G2，
而且该分枝中只有 E3一个有性型的菌株；该分枝中分离自翦股颖属植物的 N6又单独形成
一分枝；来自黑麦草属，羊茅属和早熟禾属植物的 N. lolii，N. coenophialum和 N. tembladerae
以 82％的支持率与来自羊茅属植物的有性型 E. festucae在同一个分枝上 G1；来自中国内
蒙芨芨草 Achnatherum sibericum 和美国针茅 Stipa eminens的 N. chisosum 高度聚类（自展
值 98％），同时又与 N. typhinum和 E. typhina聚为一组 G3；G4中包含有性型 E. typhina、
E. clarkii和 E. glyceriae三个种，这个组之间的种因遗传关系复杂被称为 ETC (E. typhina
222 菌 物 学 报 25卷
complex ) (Craven et al., 2001a)。另外的有性型种 E. baconii、E. bromicola、E. elymi和
E. brachyelytri各自单独聚类。
UPGMA
E13
E12
E11
E9
E10
E8
E1
N12
E3
E7
N4
N3
N6
N11
E5
E6
E4
E2
N7
N1
N2
N8
4.8 4 3.2 2.4 1.6 0.8 0
图 2 供试 22个内生真菌菌株的 UPGMA法聚类分析亲缘关系树状图
Fig. 2 The dendrogram produced by UPGMA among 22 endophyte isolates
表 2 用于 rDNA-ITS序列分析的内生真菌菌株及 GenBank序列号
Table 2 Isolates of endophytic fungi for analyses of rDNA-ITS sequences and their GenBank accession number
内生真菌 采集地 宿主植物 GenBank序列号
Taxon Geographic
origin
Host GenBank accession
No.
Epichloë amarillans JF White USA Agrostis hiemalis (Walt.) BSP AF385206
E. amarillans USA Sphenopholis obtusata (Michx.) Scribn U57664
E. baconii JF White Spain A. castellana Boiss. et Reuter AJ490939
E. baconii England A. stolonifera L. L07138
E. brachyelytri Schardl et Leuchtm. Switzerland Brachyelytrum erectum (Schreb.) Beauv L78296
E. bromicola Leuchtm. et Schardl Switzerland Bromus erectus Huds. L78295
E. clarkii JF White Britain Holcus lanatus L. L78299
E. clarkii England H. lanatus U57666
E. elymi Schardl et Leuchtm. USA Elymus canadensis L. L07131
E. festucae Leuchtm. et al. USA Festuca rubra L. AF059730
E. festucae Spain F. ampla Hack. AJ488497
E. glyceriae Schardl et Leuchtm. USA Glyceria striata (Lam.) Hitchc. L07136
E. glyceriae USA G. striata L78302
2期 李 伟等：中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及 rDNA-ITS系统发育分析 223
续表 2
内生真菌 Taxon 采集地
Geographic
origin
宿主植物 Host GenBank序列号
GenBank
accession No.
E. sylvatica Leuchtm. et Schardl Switzerland Brachypodium sylvaticum (Huds.) Beauv. L78304
E. typhina (Pers.) Tul. Europe Lolium perenne L. L07132
E. typhina Britain Dactylis glomerata L. L20306
E. typhina Switzerland Poa pratensis L. L78298
E. typhina Switzerland P. silvicola Guss. L78293
Neotyphodium chisosum (JF White
et Morgan-Jones) Glenn et al.
China:Inner
Mongolia
Achnatherum sibiricum (L.)Keng AF385203
N. chisosum USA Stipa eminens Cav. AF385201
N. coenophialum (Morgan-Jones
et W. Gams) Glenn et al.
unknown Festuca arundinacea Schreb. X60185
N. lolii (Latch et al.) Glenn et al. Japan L. perenne AB194937
N. occultans Moon et al. Europe L. rigidum Gaud. AF176261
N. occultans Europe L. rigidum AF176263
N. tembladerae Cabral et al. Argentina F. argentina (Speg.) Parodi AF385207
N. tembladerae Argentina Poa huecu Parodi AF385211
N. typhinum (Morgan-Jones
et W. Gams) Glenn et al.
Africa L. canariense Steud. AF176260
N. uncinatum (W. Gams et al.)
Glenn et al.
USA F. pratensis Huds. L07128
N. uncinatum unknown F. pratensis U57670
Neotyphodium sp. N2 China, Hebei Roegneria kamoji Ohwi DQ234804
Neotyphodium sp. N6 China, Jiangsu Agrostis sp. DQ234805
Neotyphodium sp. N12 China, Jiangsu R. kamoji DQ234806
Epichloë sp. E3 China, Jiangsu R. kamoji DQ234807
3 讨论
利用 RAPD技术对分离自我国的 22株内生真菌菌株进行了亲缘关系分析，结果表明，
菌株间的亲缘关系与宿主植物种类及采集地点有一定的相关性。来自南京鹅观草属植物的
有性型 Epichloë属菌株在一定程度上完全聚类，遗传多样性不明显；而 Neotyphodium属菌
株分离自河北唐山，江苏南京，江苏淮安和福建福州，采集地点多样，宿主植物包括翦股
颖 Agrostis和鹅观草 Roegneria两个属，从而使得 Neotyphodium属菌株之间在比较高的阈
值上才聚类，反映了菌株间较大的遗传差异，具有一定的遗传多样性（图 2）。原产我国的
菌株与欧洲原产的 N. uncinatum存在明显的区别，亲缘关系比较远，说明我国的菌株可能
224 菌 物 学 报 25卷
是不同于国外的新的分类群（图 2）。
Neotyphodium属菌株间遗传学上的差异暗示了它们不同的进化起源。例如，分离自多
年生黑麦草 Lolium pratense 的 N. siegelii 起源于 E. festucae 与 E. bromicola 的种间杂交
(Craven et al., 2001b)，而来源相同但系统发育分析上有差别的 N. uncinatum 却起源于 E.
typhina 与 E. bromicola 的种间杂交(Moon et al., 2004)。本研究中，来自翦股颖属植物的
Neotyphodium 属菌株 N6 和 N7 并没有聚在一起，来自河北唐山鹅观草属植物的
Neotyphodium属菌株 N1和 N2也不聚类，反映了它们的进化起源可能存在差异，即 N6和
N7以及 N1和 N2有可能起源于不同的有性型种之间的杂交 (图 2)。
根据 rDNA-ITS 序列进行系统发育分析，构建系统发育树，是对禾本科植物内生真菌
进行分类、鉴定及遗传分析的重要依据 (Tredway et al., 1999; Schardl et al., 2004)。本研究
中得到的系统发育树的拓扑结构显示了内生真菌不同的种之间的亲缘关系的远近，同时无
性型种与有性型种之间的聚类关系也暗示了无性型种的进化起源（图 3）。有性型 E. festucae
与无性型 N. lolii、N. coenophialum和 N. tembladerae形成一个分枝 G1，可见这三个无性型
种与 E. festucae之间的存在一定的亲缘关系（图 3）。这个结果同时验证了Moon等人的分
析结果，即 N. lolii起源于单独的 E. festucae，而 N. coenophialum和 N. tembladerae起源于
E. festucae与 E. typhina的种间杂交(Moon et al., 2002, 2004)。由 G3的聚类情况可以看出，
无性型 N. chisosum和 N. typhinum与有性型 E. typhina亲缘关系较近（图 3）。同样根据 tub2
和 tef1基因的分析证明 N. typhinum起源于 E. typhina，而 N. chisosum是 E. typhina与
E. amarillans和 E. bromicola三个种间杂交的结果 (Moon et al., 2004)。
原产自我国的 Neotyphodium属菌株 N2、N6和 N12以及 Epichloë属菌株 E3聚为单独
的一枝 G2，说明地理位置对菌株的分类具有一定的影响。G2中虽然包含原产自欧洲的 N.
occultans和 N. uncinatum，但由系统发育树的拓扑结构看还是存在一定的差异（图 3）。此
外，鹅观草属植物起源于我国，是禾本科小麦族 (Triticeae) 最大的属之一，广泛分布在欧
亚大陆，在我国绝大部分地区都有分布（蔡联炳, 2002）。鹅观草属植物中的内生真菌在国
外没有报道，在国内的研究也不多（王志伟等, 2005）。同时考虑菌株的形态学特征，宿主
植物和地理分布的不同，我国的菌株很有可能是不同于国外报道的新的内生真菌分类群,
这也验证了 RAPD 分析的结果（图 2）。此外，分离自翦股颖 Agrostis sp.的 N6 单独一枝,
与分离自鹅观草 R. kamoji的 N2、 N12和 E3之间存在一定的差异（图 3），也暗示了宿主
植物特异性可能对内生真菌菌株遗传性状产生影响。
值得注意的是，G2分枝中只有 E3一个有性型菌株，与 Epichloë属的已知种的亲缘关
系明显比较远（图 3），这说明我国的 Epichloë属菌株有可能是不同于已报道种群的新菌群。
由于 Neotyphodium真菌多数起源于不同的有性型种之间的杂交(Moon et al., 2004)，G2分
枝的拓扑结构也暗示了我国的 Epichloë真菌与 G2中的 Neotyphodium真菌菌株间存在一定
的亲缘关系（图 3）。结合宿主植物和地理位置的特异性，可以说明原产我国的 Neotyphodium
很有可能直接起源于原产我国的 Epichloë，或者是有其参与的种间杂交的结果（图 3）。Moon
等 (2002, 2004)认为，N. occultans 是 E. bromicola 与一个未确定的进化源 LAC
(Lolium-associated clade)杂交产生的，但是这个未确定的进化源至今没有一个有性型种与之
对应。本研究中 rDNA–ITS系统发育分析结果显示 N. occultans和我国产的菌株聚类，暗示
了我国的 Epichloë属真菌 E3极有可能和这个进化源 LAC有关（图 3）。因此，继续深入研
2期 李 伟等：中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及 rDNA-ITS系统发育分析 225
究我国的 Neotyphodium菌株的进化过程，及与 Epichloë菌株之间的遗传关系将是一个十分
有意义的课题。
AF385207 N.tembladerae
AF385211 N.tembladerae
AJ488497 E.festucae
X60185 N.coenophialum
AB194937 N.lolii
AF059730 E.festucae
G 1
AJ490939 E.baconii
L07138 E.baconii
AF385206 E.amarillans
U57664 E.amarillans
L78295 E.bromicola
L07131 E.elymi
L78296 E.brachyelytri
N6-ITS DQ234805 Agrostis sp.
L07128 N.uncinatum
U57670 N.uncinatum
AF176261 N.occultans
AF176263 N.occultans
N2-ITS DQ234804 Roegneria kamoji
N12-ITS DQ234806 R. kamoji
E3-ITS DQ234807 R. kamoji
G 2
AF385201 N.chisosum
AF385203 N.chisosum
AF176260 N.typhinum
L78298 E.typhina
G 3
L78304 E.sylvatica
L78293 E.typhina
L20306 E.typhina
L78299 E.clarkii
L07132 E.typhina
U57666 E.clarkii
L07136 E.glyceriae
L78302 E.glyceriae
G 4
66
77
99
66
86
59
66
82
51
88
91
94
53
53
68
2
图 3 根据 rDNA-ITS序列分析构建的最大简约系统发育树
分支上的数字代表该分枝的自展支持率（bootstrap值，1000次重复，显示>50%）
Fig. 3 The maximum parsimony tree based on rDNA-ITS sequences.
The number on each branch denotes bootstrap value (>50%, 1000 replication).

[REFERENCES]
Bacon CW, Porter JK, Robbins JD, Luttrell ES, 1977. Epichloë typhina from toxic tall fescue grasses. Applied Environmental
Microbiology, 34: 576~581
Cai LB, 2002. Geographical distribution of Roegneria C. Koch (Poaceae). Acta Bot Boreal -Occident Sin, 22: 913~923 (in Chinese)
Clay K, 1990. Fungal endophytes of grasses. Annual Review of Ecology and Systematics, 21: 275~295
Craven KD, Hsiau PTW, Leuchtmann A, Hollin W, Schardl CL, 2001a. Multigene phylogeny of Epichloë species, fungal symbionts of
grasses. Annals of the Missouri Botanical Garden, 88: 14~34
Craven KD, Blankenship JD, Leuchtmann A, Hignight K, Schardl CL, 2001b. Hybrid fungal endophytes symbiotic with the grass
226 菌 物 学 报 25卷
Lolium pratense. Sydowia, 53: 44~73
Glenn AE, Bacon CW, Price R, Hanlin RT, 1996. Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications. Mycologia,
88: 369~383
George MLC, Nelson RJ, Zeigler RS, Leung H, 1998. Rapid population analysis of Magnaporthe grisea by using rep-PCR and
endogenous repetitive DNA sequences. Phytopathology, 88: 223~229
Ji YL, Wang ZW, Yu HS, Wang SM, 2003. Neotyphodium uncinatum, an endophytic fungus obtained from Festuca arundinacea Schreb.
J Nanjing Agric Univ, 26 (2): 47~50 (in Chinese)
Kumar S, Tamura K, Nei M, 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment.
Briefings in Bioinformatics, 5: 150~163
Li CJ, Nan ZB, Paul VH, Dapprich PD, Liu Y, 2004. A new Neotyphodium species symbiotic with drunken horse grass (Achnatherum
inebrians) in China. Mycotaxon, 90 (1): 141~147
Leuchtmann A, Clay K, 1990. Isozyme variation in the Acremonium/Epichloë fungal endophyte complex. Phytopathology, 80: 1133~1139
Moon CD, Tapper BA, Scott B, 1999. Identification of Epichloë endophytes in planta by a microsatellite-based PCR fingerprinting
assay with automated analysis. Applied Environmental Microbiology, 65: 1268~1279
Moon CD, Scott B, Schardl CL, Christensen MJ, 2000. Evolutionary origins of Epichloë endophytes from annual ryegrasses. Mycologia,
92: 1103~1118
Moon CD, Miles CO, Jarlfors U, Schardl CL, 2002. The evolutionary origins of three new Neotyphodium endophyte species from
grasses indigenous to the southern hemisphere. Mycologia, 94: 694~711
Moon CD, Craven KD, Leuchtmann A, Clement SL, Schardl CL, 2004. Prevalence of interspecific hybrids amongst asexual fungal
endophytes of grasses. Molecular Ecology, 13: 1455~1467
Schardl CL, Leuchtmann A, Tsai H-F, Collett MA, Watt DM, Scott DB, 1994. Origin of a fungal symbiont of perennial ryegrass by
interspecific hybridization of a mutualist with the ryegrass choke pathogen, Epichloë typhina. Genetics, 136: 1307~1317
Schardl CL, 1996. Epichloë species: fungal symbionts of grasses. Annual Review Phytopathology, 34: 109~130
Schardl CL, Leuchtmann A, Spiering MJ, 2004. Symbioses of grasses with seedborne fungal endophytes. Annual Review of Plant
Biology, 55: 315~340
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment
through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673~4680
Tredway LP, White JF, Gaut BS, Reddy PV, Richardson MD, Clarke BB, 1999. Phylogenetic relationship within and between Epichloë
and Neotyphodium endophytes as estimated by AFLP markers and rDNA sequences. Mycological Research, 103 (12): 1593~1603
Wang ZW, Wang SM, Ji YL, Zhao MW, Yu HS, 2005. Plant endophyte research 6: Detection and distribution of endophytic fungus in
Gramineous plants in saline-alkali area in Dongying. Pratacultural Science, 22 (2): 60~64 (in Chinese)
White JF, 1993. Endophyte-host associations in grasses. XIX. A systematic study of some sympatric species of Epichloë in England.
Mycologia, 85: 444~455
White JF, Morgan-Jones G, Morrow AC, 1993. Taxonomy, life cycle, reproduction and detection of Acremonium endophytes.
Agriculture, Ecosystems and Environment, 44: 13~37
[附中文参考文献]
蔡联炳, 2002. 鹅观草属的地理分布.西北植物学报, 22 (4): 913~923
纪燕玲, 王志伟, 于汉寿, 王世梅, 2003. 分离自苇状羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的内生真菌 Neotyphodium uncinatum. 南
京农业大学学报, 26 (2): 47~50
王志伟, 王世梅, 纪燕玲, 赵明文, 于汉寿, 2005. 中国禾本科植物内生真菌研究－东营市盐碱地区的禾本科植物内生真菌的检
测与分布特征. 草业科学, 22 (2): 60~64