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禾本科植物内生真菌研究16:内生真菌Neotyphodium sinicum对宿主鹅观草生长的影响



全 文 :南京农业大学学报 2013,36(1) :52-58 http:/ /nauxb. njau. edu. cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:10. 7685 / j. issn. 1000-2030. 2013. 01. 010
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收稿日期:2012-01-10
基金项目:国家自然科学基金项目(30070019,30970081,30800156)
作者简介:程飞飞,本科生。* 通信作者:王志伟,教授,主要从事农业微生物资源及其利用的研究,E-mail:zwwang@ njau. edu. cn。
程飞飞,高龙,江龙飞,等.禾本科植物内生真菌研究 16:内生真菌Neotyphodium sinicum对宿主鹅观草生长的影响[J].南京农业大学学报,
2013,36(1) :52-58
禾本科植物内生真菌研究 16:内生真菌Neotyphodium sinicum
对宿主鹅观草生长的影响
程飞飞1,高龙1,江龙飞1,郑芳林1,纪燕玲1,王志伟1,2*
(1.南京农业大学生命科学学院,江苏 南京 210095;2.海南丰源无公害农业技术研究所,海南 海口 570207)
摘要:选择含有内生真菌的鹅观草,采集其成熟种子,经过南京的 6—9月室温处理后冷藏。经过发芽、育苗以及田间栽培
试验,调查并分析这些植物的长势、分蘖数、株高、茎宽、叶宽的变化,最后检测这些鹅观草植株中内生真菌的有无。结果表
明:含内生真菌(EI) 的鹅观草植株群苗期生长比较旺盛、分蘖比较多,但在成熟期株高、茎秆直径及叶宽与不含菌植株无显
著差异。从 EI 鹅观草植株中随机分离获得 4 个内生真菌菌株,其形态学特征和系统发育学特征显示,分离菌株均
为 Neotyphodium sinicum Wang,Ji et Kang。本研究首次证明了在田间条件下内生真菌 N. sinicum 能促进其宿主鹅观草的苗
期生长和分蘖,揭示了禾本科植物 /内生真菌共生体可作为麦类作物育种利用的可能性。
关键词:鹅观草;内生真菌;生长;分蘖
中图分类号:Q938. 1 文献标志码:A 文章编号:1000-2030(2013)01-0052-07
Grass endophyte researches 16:effects of endophyte Neotyphodium
sinicum on botanical characters of its host Roegneria kamoji
CHENG Feifei1,GAO Long1,JIANG Longfei1,ZHENG Fanglin1,JI Yanling1,WANG Zhiwei1,2*
(1. College of Life Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2. Fengyuan Institute of
Frontier Technologies for Agriculture(FIFTA) ,Haikou 570207,China)
Abstract:Mature seeds of Roegneria kamoji from an isolated population grown in Nanjing in 2008 were collected. Seedlings rose fol-
lowed by germination tests. Their agronomic properties including tiller number,plant height,and width of the pseudostems and leaves
were investigated in next spring. Endophyte infection of each plant was detected by staining techniques. Enhanced growth and tillering
were recognized in endophyte-infected plants,but plant height,and width of the pseudostems and leaves were not significantly affected
by the endophyte infection. Morphological and phylogenetic evidences indicated that the fungal isolates from those endophyte infected
plants should be Neotyphodium sinicum Wang,Ji et Kang. This is the first report of N. sinicum affecting agronomic properties of its hosts
in the field. Plant growth and tillering enhanced by endophyte infection were firstly observed on Roegneria kamoji plants.
Key words:Roegneria kamoji;Neotyphodium sinicum;growth;tillering
植物育种以植物变异群体( 基因组发生了变化的群体) 为材料进行人为选拔,选择农艺性状改良植
株,以达到人们所期望的目的,目前一般以植物本身的基因组为对象展开工作。本研究提示一种新思路,
将麦类植物与特异性内生微生物的共同体(symbiotic complexes) 直接作为选拔对象,通过导入和改良特异
性内生真菌,达到改良麦类植物性状的目的。
将植物和微生物的关系纳入到植物育种中来,这在植物抗病育种中是屡见不鲜的。在这些研究中,一
般是将植物病原微生物作为选拔压力来利用,但是在作物的生长过程中这些微生物事实上是被排斥的对
象。纵观植物育种学历史,以植物和微生物的共同体为直接对象的育种有带花纹( 感染碎锦花叶病毒) 的
郁金香、高抗虫抗逆的草坪草等。前者是园艺专家在实践中凭经验取得的成就,而后者则是禾草育种专家
认识禾本科植物内生真菌后进行的微生物强化育种———向新培育的品种中直接导入内生真菌[1]。现在,
由美国生产、在全球畅销的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、羊茅类(Festuca spp.) 草坪品种绝大多数都
是这种植物 /微生物共生体。这些成功经验为在更多的植物育种领域中培育植物 /微生物共生体、获得更
第 1 期 程飞飞,等:禾本科植物内生真菌研究16:内生真菌Neotyphodium sinicum对宿主鹅观草生长的影响
优良的品种提供了一个新的思路[1-3]。然而这些成功事例仅仅局限在花卉、草坪等少数园艺作物上,在主
要的大田禾本科作物则尚无报道[1,3-4]。本文报道了一种与鹅观草(Roegnaria kamoji Keng et Chen) ( 能与
小麦杂交的植物之一) 营互利共生生活的特异性内生真菌,该菌能给宿主植物带来更加优良的农艺性状,
为麦类作物育种提供了新的渠道。
内生真菌(endophytic fungi) 是指完全生活在植物体内、或在其生活史的某些重要阶段处于植物体内
的真菌。在绝大多数情况下,禾本科植物内生真菌(grass endophytes) 主要是特指epichloae真菌,包括 Neo-
typhodium属和 Epichlo属成员[3,5-6],它们与宿主的共生关系以及共生体对草食动物影响的研究倍受关
注[3-6]。在 epichloae真菌中,某些菌株具有高度的宿主特异性,能增加宿主植物的分蘖数和生物量,促进
宿主的营养生长[7-8]。含有内生真菌(endophyte infected,EI) 的苇状羊茅(Festuca arundinacea Schreber =
Lolium arundinaceum(Schreb.)Darbyshire) 和多年生黑麦草植株的分蘖数和总生物量明显高于不含菌(en-
dophyte free,EF) 植株[9];EI苇状羊茅植株的抗干旱胁迫能力[8]、EI黑麦草植株的抗阿根廷茎象鼻虫(Lis-
tronoyus bonariensis) 能力[10]和有些 EI苇状羊茅植株的抗线虫能力显著提高[11]。此外,在平板培养基上,
内生真菌 Neotyphodium coenophialum对 Rhizoctonia spp.等植物病原真菌具有明显的抑制作用[12],暗示了
该内生真菌的感染有助于宿主植物提高其抗病能力。但是,这类内生真菌在小麦、大麦等同属冷季型植物
中一直没有被发现[3,5-6]。另一方面,禾本科植物内生真菌中,有些菌株和宿主的共生体能产生大量的生
物碱,这些生物碱中有些对牛、马、羊、鸟、昆虫等动物有明显的毒性[5,7,10],也是阻碍将有益内生真菌用于
作物育种的另一因素[5,7,10]。
近年来本课题组加强了对我国原产禾草类植物内生真菌的研究,发现我国原产禾本科植物中有着丰
富的内生真菌资源[13-18],其中地理分布最广、资源多样性最丰富的是鹅观草属植物内生真菌[13-15,18]。但
是,这些真菌对宿主的植物学、生理学影响等的研究尚未进行。禾本科植物内生真菌对宿主植物的影响,
因共生双方的基因型不同而异[5-6,9-11]。因此,丰富的内生真菌资源给予了人们选拔有益组合的巨大
空间。
鹅观草属植物(Roegnaria spp.) 为多年生禾本科草本植物,大多数分布于北回归线以北的绝大部分地
区的亚洲各国,在欧美也有少量的分布。但由于植物分类学体系的差异,它们在欧美往往被归于披碱草属
(Elymus) ,在英国和日本也有人将其归于冰草属(Agropyron)[19]。鹅观草属植物往往是良好的水土保持植
物,并有一定的饲用价值。近年来,本课题组从华东、华北以及西北等地区的鹅观草属植物中发现了
Epichlo yangzii[14]和 Neotyphodium sinicum[15,18]两种不同的特异性内生真菌。在前期研究中,我们还发现
鹅观草内生真菌在温室盆栽条件下能促进幼苗的生长和分蘖,但未能给幼苗带来对麦长管蚜
(Macrosiphum avenae F.) 的抗性[20]。这些研究表明鹅观草内生真菌和多年生黑麦草、苇状羊茅等植物的
内生真菌可能有明显的差异[8-11,20]。
内生真菌在田间能给宿主鹅观草植物带来什么样的影响,至今还没有研究。本研究收集含有内生真
菌的鹅观草植株的种子,研究其内生真菌在田间对宿主植物学特征的影响,为其用于植物育种的可能性探
讨提供了材料。
1 材料与方法
1. 1 生物材料及其保藏
2008 年 6 月初从南京市东郊发现了 1 株含有内生真菌的鹅观草植株。该植株株高 115 cm,有效分蘖
数过百,穗下垂,小穗无柄,有 2 至数个小花,顶生小穗正常发育,排列于总轴之两侧,为顶生、单生的穗状
花序,穗状花序长 7 ~ 20 cm。本研究中的鹅观草种子全部来自该植株。种子外稃披针形,具有较宽的膜
质边缘,背部以及基盘近于无毛或仅基盘两侧具有极微小的短毛,上部具明显的五脉,脉上稍粗糙,第 1 外
稃长 8 ~ 11 mm,先端延伸成芒,芒粗糙、劲直或上部稍有曲折,长 20 ~ 40 mm;内稃约与外稃等长,先端钝
头,脊显著具翼,翼缘具有细小纤毛,符合 R. kamoji Keng et Chen的特征。种子采集后脱粒,装入信封中风
干后先于室温避光保藏,后于同年 9 月中旬 4 ~ 10 ℃低温保藏。
1. 2 种子的发芽和幼苗栽培
2008 年 10 月,用培养皿和滤纸制作湿室,将鹅观草种子进行简单表面消毒(75%乙醇 1 min,1%氯活
性 NaClO 1 min,水洗) 后播种( 每皿50 粒)。在约 25 ℃的黑暗下催芽,每天换水 2 次。待种子露白后,播
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
于装有营养土的穴盆(4 cm×4 cm) 中,在室内育苗。25 d 后调查种子的发芽率。2008 年 12 月初,当幼苗
长超过 5 cm后在室外炼苗 1 周,再选择健苗移栽至试验田( 南京市江宁区麒麟镇泉水村) 并编号。株距和
行距各 25 cm。2009 年 2 月下旬开始,每周进行 1 ~ 2 次的手工除草或松土等,未进行施肥、灌溉等。试验
田前茬为蔬菜地,阳光充足,排水条件好,土质为较疏松的黏土。
1. 3 植物学特性调查和统计分析
2009 年 4 月 1 日开始,从全部 40 株植物中,去除意外受伤等不正常的植株,对剩余的 20 株每周 1 ~ 2
次调查和记录其分蘖数、株高、茎粗、叶宽,6 月 14 日结束。用 SPSS 17. 0 对数据进行统计。
1. 4 植株内生真菌的检测
待田间试验结束后收获全部穗,取穗轴 3 ~ 5 cm,纵切后取髓质,用碱性孟加拉红溶液染色后在光学
显微镜下进行内生真菌检测[13-14]。根据菌丝体及其形态判断内生真菌的存在与否。
为检测所获鹅观草种子中是否都含有内生真菌,将 20 株植株产生的饱满种子各选 20 粒,用碱性孟加
拉红溶液染色后在光学显微镜下进行内生真菌检测,判断内生真菌是否进入种子[13]。
1. 5 内生真菌的分离和鉴定
利用 PDA培养基,从含菌茎髓中分离和纯化内生真菌。参照 Kang 等[15]的方法培养各分离菌株,观
察各个菌株在 PDA培养基上的菌物学特征。提取菌株中总 DNA,进行 tubB基因第 1 拷贝片段的 PCR扩
增和测序。根据测得的序列,在 NCBI网站通过 BLAST软件进行比对,选择近缘真菌菌株的对应基因片段
的序列,用最大简约法进行系统发育学分析[15]。综合菌物学特征和系统发育特征以及宿主植物的种类进
行分离菌株的鉴定。
2 结果与分析
2. 1 鹅观草种子的发芽和生长周期
2008 年 6 月初采集的鹅观草种子饱满、整齐。发芽试验中种子发芽良好,发芽率达到了 98%,说明本
研究采用的种子保存条件比较恰当,适合鹅观草种子的保藏。
幼苗移栽后生长状况良好。田间条件下,植株茎秆茁壮,叶色翠绿,出现 3 ~ 5 个分蘖后越冬,生长发
育缓慢。2008 年 12 月植株开始进入越冬期,2009 年 2 月上旬越冬期结束。2 月中下旬鹅观草植株陆续
开始生长,发育正常( 图1-A) ,3 月上旬所有植株进入快速生长期。3 月中下旬植株进入拔节期,4 月 14
日开始观察到抽穗,5 月 2 日进入花期,开始扬花。5 月 10 日鹅观草植株花期基本结束,进入灌浆
期。5 月底至 6 月初种子陆续成熟,植株开始老化。种子成熟后易脱落。6 月 14 日各个穗上的种子全部
成熟。至此,供试鹅观草植株完成一个完整的生长周期。各供试鹅观草植株的生长周期基本一致,生长期
间未出现显著的病虫害和干旱等不良情况。6 月 14 日结束调查,收获全部穗。由于部分种子已自然脱
落,因此本研究未能调查各个植株的种子产量。在所有植株的所有分蘖上均没有发现真菌子座的形成。
图 1 移栽 140 d后的鹅观草植株 R12(A)、茎秆中的菌丝体(B)和分离菌株菌落(C)
Fig. 1 Roegneria plant R12 after 140 d of transplant(A),a fungal hyphae detected from its culm
pith(B)and a fungal colony on PDA plate(C)
2. 2 鹅观草植株的内生真菌
在植株穗轴组织中,菌丝体单行,分布在植物的细胞间隙,平行于植物细胞长轴。菌丝体直径 2. 5 μm
左右,有白色隔膜,粗细较均匀,微弯曲,很少分叉,不侵入植物细胞,也未引起植物细胞明显的变形、变色、
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第 1 期 程飞飞,等:禾本科植物内生真菌研究16:内生真菌Neotyphodium sinicum对宿主鹅观草生长的影响
坏死、膨大或缩小等异常变化( 图1-B)。这些与 N. sinicum 的特征相符。供试 20 株鹅观草中 13 株含有
内生真菌,内生真菌检出率为 65%。这表明,6 月中旬至 9 月中旬,35 ~ 39 ℃的高温闷热环境( 最低温度
30 ℃左右) 对于鹅观草内生真菌的去除(endophyte curing) 有一定的效果。
在茎髓组织中检测到内生真菌的各个植株种子( 每株20 粒) 中也全部检测到了内生真菌菌丝体( 图
片未附) ,说明植物体内的这些真菌能进入胚珠和成熟种子。与在茎髓组织中的菌丝体形态有所不同,鹅
观草种子中的内生真菌菌丝体弯曲度很高,并有分叉。相反,在茎髓组织中没有检测到内生真菌的植株所
产生的种子中均没有检测到相应的内生真菌,没有观察到内生真菌水平传播的发生。
2. 3 鹅观草植株的形态学特征
在苗期,与不含内生真菌(EF) 植株相比,含有内生真菌(EI) 鹅观草植株生长较旺盛,株冠偏大,株高
较高,分蘖数偏多,但茎粗和叶宽没有明显的变化。随着植株的生长,植株间的高度差异和株冠差异均逐
渐消失,但分蘖数和植株的旺盛程度继续保持一定的差异( 表1)。在整个植物生长过程中,叶色没有明显
的差异,植株上的蚜虫出现频率也没有显著的差异( 数据未列出)。
EI植株整体生长旺盛,总分蘖 27 ~ 48 个,平均 34. 3 个,比 EF植株增加约 38%(P=0. 2)。EI 植株株
高 15. 6 ~ 32. 6 cm,平均 22. 8 cm,比 EF 植株降低 13. 5%(P = 0. 41) ; 茎秆直径2. 0 ~ 2. 9 mm,平均 2. 4
mm,比 EF植株增加约 10%(P = 0. 27) ; 叶片宽8. 0 ~ 15. 1 mm,平均 12. 6 mm,比 EF 植株增加约 3. 6%
(P=0. 69)。因此,在株高、茎秆直径和叶片宽方面,EI植株与 EF植株相比无显著差异( 表1)。这些结果
表明,在南京无施肥和灌溉的条件下,epichloae真菌能促进鹅观草植株的苗期生长和分蘖。
表 1 成熟期含有内生真菌(EI)与不含内生真菌(EF)鹅观草植株的形态学特征
Table 1 Morphological properties of endophyte infected(EI)and endophyte free(EF)Roegneria plants
编号
No.
分蘖数
Tiller number
株高 / cm
Plant height
茎粗 /mm
Stem diameter
叶宽 /mm
Leaf width
编号
No.
分蘖数
Tiller number
株高 / cm
Plant height
茎粗 /mm
Stem diameter
叶宽 /mm
Leaf width
R1
R3
R4
R6
R7
R8
R11
R12
R13
R15
R16
R18
R19
平均值 Average
方差 Variance
EI
48 16. 0 2. 8 8. 0
44 22. 2 2. 0 12. 6
39 32. 6 2. 6 15. 1
37 15. 6 2. 1 10. 5
35 20. 8 2. 1 14. 2
34 21. 0 2. 8 14. 5
33 25. 0 2. 6 11. 6
31 19. 5 2. 9 12. 9
31 25. 2 2. 2 14. 8
30 19. 9 2. 4 14. 6
29 30. 4 2. 0 11. 0
28 23. 4 2. 0 10. 0
27 24. 1 2. 9 14. 0
34. 31 22. 75 2. 42 12. 60
6. 29 4. 93 0. 36 2. 22
R2
R5
R9
R10
R14
R17
R20
平均值 Average
方差 Variance
EF
33 24. 8 1. 8 10. 4
28 16. 7 2. 4 12. 0
25 21. 3 2. 6 15. 0
24 18. 6 1. 9 11. 0
22 57. 4 2. 4 10. 4
21 20. 4 1. 5 9. 9
24. 9 2. 8 16. 4
24. 86 26. 30 2. 20 12. 16
4. 38 14. 04 0. 47 2. 54
注:分蘖数为全部分蘖;株高选择了植株的最高点测量;叶宽为旗叶的下位叶片的宽度;此表均为6 月 14 日的调查数据。
Note:Tiller number includes all tillers;Height was conducted form the earth to the top of plant;Leaf width was selected especially for the leaf be-
low flag leaf;All the data was determined on June 14,2009.
2. 4 植株内生真菌的分离与鉴定
从含菌植株 R3、R6、R7 和 R15 中分别分离获得了菌株 Rnj0143、Rnj0145、Rnj0146 和 Rnj0147。这些
菌株在 PDA培养基上菌落表型类似( 图1-C) ,白色,棉质,生长3 周后直径达 11. 3 ~ 14. 5 mm;分生孢子
长 4. 6 ~ 5. 0 μm,直径 2. 9 ~ 3. 1 μm;分生孢子梗长16. 6 ~ 18. 7 μm,基部直径为 2. 3 ~ 3. 3 μm,顶部直径
为 1. 2 μm。
通过对菌株 Rnj0143 和 Rnj0146 的 tubB 基因片段的 PCR 扩增和测序,获得了长度均为 730 bp 的
DNA序列。通过 DNAssist 比较,发现这 2 个序列之间相似度为 100%。通过比对发现这 2 个序列
与Neotyphodium 属及 Epichlo属真菌的序列最接近。选择 Neotyphodium 属和 Epichlo 属不同种的相类似
的 52 个对应基因片段的序列构建系统发育树,发现菌株 Rnj0143 和 Rnj0146 的 tubB 基因片段和 N.
sinicum的菌株 Rxy6101、Rts2102 的 tubB第 1 拷贝片段序列高度聚类( 图2)。说明这些菌株在系统发育学
上高度相似,本研究中所克隆和测序的 Rnj0143 和 Rnj0146 的 tubB基因片段为其第 1 拷贝片段。
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
综合形态学特征、基于 tubB第 1 拷贝片段(ca. 730 bp) 的分子系统学特征以及宿主植物的分类地位,
分离菌株 Rnj0143、Rnj0145、Rnj0146 和 Rnj0147 均被鉴定为 N. sinicum Wang,Ji et Kang。
图 2 根据 Neotyphodium spp.和 Epichlo spp.菌株的 tubB基因序列用最大简约法构建的系统发育树
Fig. 2 Neotyphodium spp. and Epichlo spp. tubB phylogram based on maximum parsimony
步长为 98,一致性指数为 0. 816,总留存指数为 0. 952,总尺度化一致性指数为 0. 777。1 000 次重复,自展值>60%。
●. N. sinicum菌株;▲.供试菌株。
Tree length is 98,consistency index is 0. 816,retention index is 0. 952,rescaled consistency index is 0. 777. 1 000 bootstrap rep-
lications. Bootstrap value>60% .●. N. sinicum strains.▲. Strains in this study.
3 讨论
鹅观草内生真菌不仅能从植物体内检测和分离得到,而且能进入植物种子,通过种子进行垂直传播,
具有比较高度的宿主特异性[14-15,21]。本研究发现,在田间鹅观草内生真菌 N. sinicum 能在一定程度上改
变宿主植物的农艺性状。这说明,用适当的方法导入这种内生真菌有可能作为鹅观草育种的一种手段来
利用。这证明了鹅观草内生真菌能通过和宿主植物的互利共生来影响植物的育种学表型的改变,揭示了
将禾本科植物 N. sinicum用于麦类作物育种的可能性。
对禾本科植物内生真菌的研究表明,许多内生真菌与其宿主存在着互利共生的关系。鹅观草中含有
比较丰富的 N. sinicum、E. yangzii等 epichloae内生真菌资源[14-15,18]。E. yangzii 在宿主植物抽穗后会在旗
叶叶鞘上部形成肉眼可见的子座,而 N. sinicum 则不会。子座形成能力的有无是鉴别这两类真菌的重要
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第 1 期 程飞飞,等:禾本科植物内生真菌研究16:内生真菌Neotyphodium sinicum对宿主鹅观草生长的影响
特征[14-15]。由于 Neotyphodium属真菌在植株上不形成任何肉眼可见的症状,因此,有可能被用于植物育
种[1,3,5]。本研究中植株在其整个生长周期,尤其是拔节后,没有观察到任何植株上有子座的形成。综合
植物样品的分类学特征、分离菌株的形态学特征和系统发育学分析,确定供试鹅观草植株中所含的内生真
菌为我们此前记录的 N. sinicum Wang,Ji et Kang[15,18]。
本研究中所用的植物样品数量不多,两个类群的样品数量也不相等,这是为了尽量消除人为因素而在
数据采集的最后才进行内生真菌检测所致。到目前为止,鹅观草内生真菌只有宿主特异性很强的种传真
菌 N. sinicum和 E. yangzii两种[14-15]。关于它们在鹅观草中的功能,至今仅有较粗放的倾向性预试验[20]。
本研究采用同一植株的种子,利用高温除菌的方法去除了部分种子中的内生真菌的活力后,进一步证实了
鹅观草内生真菌的促生长、促分蘖等特性。但是,室外试验不可控因素较大,特别是植株移栽时给植株造
成的伤害导致了本研究没能对植株的苗期生长进行仔细的调查。并且,由于成熟鹅观草种子容易脱落,因
此本研究没有能及时调查内生真菌对植物种子产量以及千粒质量等的影响,这些都是本研究的不足。
内生真菌对其宿主在苗期的生长有比较明显的促进作用,但这个促进效果在成熟期就消失了,这一点
与前人在其他植物上的类似研究结果相符[1-3,9]。这些都是在无灌溉、无施肥等粗放管理条件下的结果,
精耕细作时植株的表现还有待于进一步的研究。
鹅观草、小颖羊茅等禾本科植物的内生真菌能够通过种子垂直传播给下一代[21-22]。本研究从含有内
生真菌的种子培育了幼苗,获得了含有内生真菌的植株,再次证实了这一点。这种类似于“可遗传性”的
特征是禾本科植物内生真菌有可能作为植物育种手段为人类所利用的必要保障[21-22]。
目前,有关鹅观草种子的保藏和发芽适宜条件还未有报道。本研究中鹅观草种子的发芽率达到了
98%,说明南京夏日的高温条件和低温均适于鹅观草种子的保藏。同时,种子先在培养皿中进行发芽,待
种子露白后再播于土壤,这是适宜野生鹅观草的发芽方法。高温高湿的贮存条件往往会引起多年生黑麦
草和苇状羊茅种子中的 Neotyphodium属内生真菌的死亡。因此,禾本科草坪种子的贮藏直接关乎其内生
真菌的稳定性和种子的质量[23]。同时,这也有可能发展成为一种简便的鹅观草内生真菌的去除方法
(curing method) ,具体条件等正在进一步研究中。
苇状羊茅和多年生黑麦草中的内生真菌 N. coenophialum 和 N. lolii 均对宿主植物的苗期生长和再生
有明显的促进作用,能增强宿主植物的长势和竞争力,使这些牧草有更高的载畜量[7-8]。这些内生真菌也
能够提高草坪型苇状羊茅和多年生黑麦草的苗期生长能力和再生能力,同时增强其抗逆性和竞争力[1,3]。
N. coenophialum菌株在培养基中就具有较高的 IAA合成能力[24]。鹅观草中的内生真菌 N. sinicum也被证
明在除葡萄糖以外不含任何有机质的合成培养基内合成大量的 IAA[25],但菌株的 IAA合成能力和促进宿
主植物生长和分蘖的能力之间的关系还有待于进一步论证。因此,严格来讲,内生真菌促进鹅观草分蘖的
生理学机制还不确定。
当供试鹅观草种子来自一个鹅观草群落的复数棵植株时,无法确保该研究中所用的内生真菌及其宿
主植物在遗传上具有很好的同质性(homogeneity)[20]。本研究使用了同一个植株上的植物种子进行了田
间试验,在一定程度上保障了内生真菌在遗传上的同质性,比此前的研究有了显著的改进[20]。但是,由于
鹅观草不是自交植物,本研究中使用的同一株植物上的种子事实上在遗传上依然存在一定的异质性(het-
erogeneity)。要克服这些材料的异质性的影响,今后必须首先用人工的方法获得遗传上完全同质的植株
群,再采用人工接种的方法将同一个菌株接种到这些同质植株群的部分植株中去,或者从含菌同质植株中
去除内生真菌。目前,鹅观草的人工种植技术、epichloae内生真菌的接种技术以及植株中的内生真菌去除
技术在我国还很不成熟,很难获得稳定的、遗传上高度同质性鹅观草 /内生真菌共生体。如何去克服这些
困难,还有待于今后的继续研究。
鹅观草内生真菌是本课题组多年来的研究重点[13-15,18,20,25]。本研究首次报道了鹅观草这一小麦近缘
植物在田间栽培过程中的作物学表型受内生真菌的影响,从而改变了其农业性状,获得了苗期生长、分蘖
数等性状得到明显改良的真菌 /宿主组合。这展示了这类内生真菌作为麦类作物育种的材料加以利用的
可能性。epichloae内生真菌的介入,可能为鹅观草等麦类植物的育种打开一个更广阔的空间。
南京农业大学翟素、崔荣凯等同学在田间试验中给予了很多帮助,盖钧镒院士就本文给予了宝贵建议和建设性讨论,
谨致谢意。
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
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