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长白山2种橐吾属植物乙醇提取物抗肿瘤作用研究



全 文 :第 16 卷 第 6 期 北华大学学报(自然科学版) Vol. 16 No. 6
2015 年 12 月 JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science) Dec. 2015
文章编号:1009-4822(2015)06-0733-04 DOI:10. 11713 / j. issn. 1009-4822. 2015. 06. 008
长白山 2 种橐吾属植物乙醇提取物抗肿瘤作用研究
朱 梅1,孙海明1,任桂红1,赵桂云1,董 然2,刘洪章2
(1.北华大学化学与生物学院,吉林 吉林 132033 ;2.吉林农业大学生命科学学院,吉林 长春 130118)
摘要:目的 探讨复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物体外抗肿瘤作用,为抗肿瘤药物研发以及多途径开发、利用长白
山橐吾属植物资源提供参考依据.方法 采用 MTT法检测复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物(FXEtOH、XBEtOH)在
体外对 2种肿瘤细胞(Hela,A549)增殖的抑制作用;应用流式细胞术检测细胞凋亡;以 Vc 做对照,采用邻二氮菲
法、邻苯三酚自氧化法测定 2 种橐吾乙醇提取物对羟自由基( )、超氧阴离子自由基(O-2·)的清除率.结果
用不同质量浓度的 2种橐吾乙醇提取物处理 A549,Hela细胞 48 h后,对 Hela,A549细胞的抑制率均随样品浓度
增加而增大;对 的清除,FXEtOH,XBEtOH,Vc 的 IC50值分别为 73. 34,335. 30,79. 31 μg /mL;对 O

2·的清除,
FXEtOH,XBEtOH,Vc IC50值分别为 64. 81,131. 89,191. 62 μg /mL.结论 复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提物在体外均具
有一定的抗肿瘤活性和较好的综合抗氧化能力,抗氧化可能是其抗肿瘤作用的机制之一.
关键词:复序橐吾;狭苞橐吾;抗肿瘤;抗氧化
中图分类号:R285 文献标志码:A
【引用格式】朱梅,孙海明,任桂红,等.长白山 2 种橐吾属植物乙醇提取物抗肿瘤作用研究[J]. 北华大学学报(自然科学版) ,
2015,16(6) :733-736.
收稿日期:2015-09-10
基金项目:吉林省科技发展计划项目(20100254) ;吉林省教育厅科学技术研究项目(2012138).
作者简介:朱 梅(1963-),女,博士,副教授,主要从事药用植物资源学研究,E-mail:zhumei108@ sohu. com;通信作者:刘洪章(1958-),男,教授,
博士生导师,主要从事长白山野生经济植物种质资源研究,E-mail:lhz999@126. com.
On Antitumor Effects of Ethanol Extracts from 2 Kinds
of Ligularia Genus Plants in Changbai Mountain
Zhu Mei1,Sun Haiming1,Ren Guihong1,Zhao Guiyun1,Dong Ran2,Liu Hongzhang2
(1. School of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132033,China;
2. School of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)
Abstract:Objective To discuss the antitumor effects of ethanol extracts from Ligularia jaluensis and Ligularia
intermedia in vitro,and to provide references for the development of antitumor drugs as well as the comprehensive
utilization and development of Ligularia genus resources in Changbai Mountain. Method The inhibiting effects
of ethanol extracts from Ligularia jaluensis and Ligularia intermedia on the multiplications of 2 kinds of tumour
cells (Hela,A549)were determined by MTT colorimetric assay in vitro. Flow cytometry was applied to test cell
apoptosis. The effects of ethanol extracts from two kinds of ligularia genus plants on the clearance of Hydroxy free
radical( )and superoxide anion free radical (O-2·)were measured by Phenanthroline and Pyrogallol
autoxidation methods. Results The A549 and Hela cells were treated with different concentrations of the ethanol
extracts for 48 hours,and the inhibition rates increased remarkably with increasing of concentration. For the
clearance of ,the IC50 of FXEtOH,XBEtOH and Vc were 73. 34,335. 30 and 79. 31 μg /mL,respectively. For
the clearance of O-2 ·,the IC50 of FXEtOH,XBEtOH and Vc were 64. 81,131. 89 and 191. 62 μg /mL,
respectively. Conclusion Both the ethanol extracts of Ligularia jaluensis and Ligularia intermedia possess the
antineoplastic activity in vitro and good comprehensive antioxidant capacity which may be one of their possible
mechanism on antitumor.
Key words:Ligularia jaluensis;Ligularia intermedia;anti-tumor;antioxidant
橐吾属(Ligularia Cass) ,菊科,约有 150 种,中
国约有 111 种,多年生草本,分布于西南部至东北
部.橐吾属植物药用种类较多,其中,许多种类的
根、茎、叶、花是我国民间中草药,根及根茎作为中
药“紫苑”的代用品[1],主要有止咳化痰、活血化
瘀、清热解毒、利尿、利胆退黄等功效[2-3].
本文对长白山复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取
物体外抗肿瘤和抗氧化作用进行初步研究,旨在为
长白山区橐吾属植物的开发与利用提供参考依据.
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 供试材料
复序橐吾(Ligularia jaluensis Kom.)、狭苞橐吾
(Ligularia intermedia Nakai.)采自吉林省敦化市青
沟子林场,海拔约 416 m的林缘沼泽湿草地,长白县
十五道沟,海拔 939 m的岩石细缝湿地,由吉林农业
大学园艺学院董然教授鉴定.人肺腺癌细胞 A549、
人宫颈癌细胞 Hela,由吉林大学药学院提供.
1. 1. 2 试剂与仪器
5-Fu 针剂(250 mg /10 mL) (上海旭东海普药
业有限公司) ;RPMI-1640 培养基、胎牛血清、
HyClone、胰蛋白酶、GIBCO 、噻唑蓝(MTT)、二甲
基亚砜(DMSO) (美国 Sigma 公司) ;An-nexin-V 和
碘化丙啶 (PI)双染试剂盒(美国 BD 公司) ;其他
试剂均为国产分析纯.
旋转蒸发仪(美国 HeidolPh 公司) ;3550- UV
酶标仪(美国 Bio Rad公司) ;紫外可见分光光度计
(美国 Biochrom 公司) ;MCO-15A CO2培养箱(日本
SANYO公司) ;SW-CJ-IF超净工作台(苏净集团安
泰公司) ;低温高速离心(Labofuge400R) (德国
HERAEU) ;96 孔无菌培养板(上海求精生化仪器
厂) ;流式细胞仪(美国 BD 公司).
1. 2 方 法
1. 2. 1 2 种橐吾乙醇提取物的制备
将干燥的复序橐吾、狭苞橐吾叶粉碎,分别称取
200 g,加 95%乙醇 2 L,室温下浸泡 24 h,热水浴回流
提取 3次,1 h /次,合并滤液,离心(3 000 r /min)10 m
in,取上清液,旋转蒸发仪浓缩,得到棕褐色提取物,冷
冻干燥,得复序橐吾乙醇提取物(FXEtOH)和狭苞橐
吾乙醇提取物(XBEtOH)干浸膏.
1. 2. 2 体外抗肿瘤试验
样品溶液配制:将复序橐吾、狭苞橐吾乙醇提
取物用 95%乙醇溶解,使用时用 RPMl-1640 培养
基稀释,使乙醇终浓度<0. 1%,经无菌滤器除菌,
用 DMSO溶解,配制成 1×104mg /L 贮备液,4 ℃保
存备用.
细胞培养:人肺腺癌细胞 A549、人宫颈癌细胞
Hela培养于含 10%胎牛血清、100 U /mL 青霉素和
100 μg /mL链霉素的 RPMl-l640完全培养基中,37 ℃、
5%CO2饱和湿度条件下常规培养,隔日换液,3 ~ 4 d
传代 1次.
MTT 法测定肿瘤细胞体外生长的抑制试验:
A549,Hela 细胞用 0. 25% 胰蛋白酶和 0. 01%
EDTA消化后悬浮在一定量培养液中,计数,调整
细胞密度为 2×104 /mL,接种于 96 孔培养板,每孔
100 μL,继续培养 24 h.实验组各孔加入不同浓度的
橐吾乙醇提取物各 100 μL,终浓度分别为 25,50,
100,200,400,800 μg /mL.阳性对照组加入 100 μL 5-
Fu,终浓度 5 μg /mL. 同时设空白对照组、细胞对
照组,每组均设 3 个复孔. 置饱和湿度、37 ℃、5%
CO2培养箱中继续培养 48 h,用倒置显微镜动态观
察细胞形态变化.
实验终止前,每孔加入 5 mg /mL MTT 20 μL,继
续培养 4 h后终止培养,小心吸去孔内培养液.每孔
加入 150 μL DMSO,置摇床上低速振荡 10 min,使结
晶物充分溶解.应用全自动酶标仪于 490 nm 波长处
测定吸光度值(OD).
细胞生长的抑制率:
细胞生长的抑制率=1-
OD实验组-OD空白组
OD对照组-OD空白组
×100% .
1. 2. 3 流式细胞术检测细胞凋亡率
取对数生长期的 A549,Hela 细胞,制成单细胞悬
液,细胞密度调整至 2× 104个/mL,接种于 25 mL培养
瓶中,待细胞进入对数生长期.同样设空白对照组、阳性
对照5-FU(5 μg /mL )组及 400 μg /mL样品组,各 3次
重复,培养48 h,常规收集细胞,PBS缓冲液洗涤细胞 3
次,细胞密度调整至 106个/mL,分别于每瓶中加入
Annexin-V 5μL和 PI 10μL,4℃条件下分别避光处理5
和10 min后,应用流式细胞仪进行检测.
1. 2. 4 体外抗氧化活性测定
以抗坏血酸作对照试验,分别利用邻二氮菲
法[4]、邻苯三酚自氧化法[5-6],观察 2 种橐吾乙醇
提取物对 和 O2-·的清除能力.
1. 2. 5 统计学方法
采用 SPSS 19. 0 统计软件包分析实验数据,各
组数据以均数±标准差(珋x±s)表示,采用 t检验对数
据进行统计学分析.
437 北华大学学报(自然科学版) 第 16 卷
2 结果与分析
2. 1 FXEtOH 和 XBEtOH 对 A549 及 Hela 细胞
体外增殖的抑制作用
以 5-FU 作为阳性对照,用不同质量浓度的
FXEtOH和 XBEtOH 处理 A549,Hela 细胞 48 h 后,
MTT法检测细胞活性.实验结果表明:当 2种橐吾乙
醇提取物浓度为 10 μg /mL时,对 A549,Hela细胞的
生长抑制作用不明显,与对照组比较无统计学意义(P
>0 . 05).但随着样品浓度升高,对 2种肿瘤细胞的生
长有较明显的抑制效果.当提取物浓度达 400 μg /mL
时,狭苞橐吾乙醇提取物对 Hela抑制率为 73. 9%,高
于对照组(P<0. 0 5) ,但 FXEtOH 对 Hela 的抑制率
较低;而 2 种橐吾乙醇提取物对 A549 抑制率较相
近,高浓度(400 μg /mL)时接近 5 μg /mL 5-FU的抑
制水平.可见,实验组橐吾乙醇提取物 400 μg /mL的
抑制效果最佳,因此,后续研究可选择以橐吾乙醇提
物作用 48 h为实验条件.见图 1,图 2.
图 1 复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物对 Hela的抑制作用
Fig. 1 Inhibition effects of the ethanol extracts from L.
jaluensis and L. intermedia on Hela
图 2 复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物对 A549的抑制作用
Fig. 2 Inhibition effects of ethanol extracts from L.
jaluensis and L. intermedia on A549
2. 2 FXEtOH 和 XBEtOH 对 A549 及 Hela 细胞
凋亡的影响
采用流式细胞术检测 400 μg /mL FXEtOH 和
XBEtOH作用 48 h 后的 A549 及 Hela 细胞凋亡情
况.结果显示:实验组 A549,Hela 细胞的凋亡率均
高于空白对照组.见图 3.
图 3 流式细胞术分析 FXEtOH 和 XBEtOH 对 A549
和 Hela细胞凋亡的影响
Fig. 3 Influences of FXEtOH and XBEtOH on the apo-
ptosis of A549 and Hela cells by flow cytometric
analysis
2. 3 FXEtOH 和 XBEtOH 对羟自由基和超氧阴
离子的清除能力
2. 3. 1 对羟自由基的清除
2 种橐吾乙醇提取物对 均有一定的清除能
力,随浓度的升高,对 的清除能力逐渐增强.在
100 ~500 μg /mL 质量浓度内,FXEtOH和 XBEtOH对
的消除率分别在 58. 6% ~87. 95%和 18. 79% ~
58 . 79%内(见图 4) ;Vc 10 ~ 50 μg /mL 的质量浓
度对 的消除率在 10. 46% ~ 37. 25%内(见图
5).其 IC50分别为 FXEtOH 73. 34 μg /mL、XBEtOH
335. 30 μg /mL、Vc 79. 31 μg /mL.实验结果说明:复
序橐吾乙醇提取物清除羟基自由基的能力明显高于
狭苞橐吾,且在一定浓度范围内可以和 Vc抗衡.
2. 3. 2 对超氧阴离子自由基的清除
实验结果显示:2 种橐吾乙醇提取物对 O-2·的
清除作用随质量浓度的提高,对 O-2·的清除能力也
增强(FXEtOH 57. 02% ~79. 34%,XBEtOH 44. 63%
~65. 29%) ,且呈现较好的量效关系;Vc 在 10 ~ 5
0 μg /mL 的质量浓度内对 O-2·的消除率为 9. 90%
~29. 70% . FXEtOH,XBEtOH及 Vc的 IC50值分别为
64. 81,131. 89,191. 62 μg /mL. 以上数据充分说明,
FXEtOH和 XBEtOH对 O-2·均有较强的清除能力,
且在一定浓度时清除能力高于 Vc.见图 6.
concentration /(μg·mL-1)
图 4 Vc对羟自由基和超氧自由基的清除率曲线
Fig. 4 Clearance curve of hydroxyl radical and sup-
eroxide free radical treated with Vc
537第 6 期 朱 梅,等:长白山 2 种橐吾属植物乙醇提取物抗肿瘤作用研究
concentration /(μg·mL-1)
图 5 复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物对羟自由基
的清除率曲线
Fig. 5 Clearance curve of hydroxyl radical treated with
ethanol extracts of L. jaluensis and L. intermedia
concentration /(μg·mL-1)
图 6 复序橐吾和狭苞橐吾乙醇提取物对超氧自由基
的清除率曲线
Fig. 6 Clearance curve of superoxide free radical
treated with ethanol extracts of L. jaluensis and
L. intermedia
3 讨 论
3. 1 体外抗肿瘤作用
体外抗肿瘤实验是从天然产物中寻找抗肿瘤化
合物必不可少的一部分.本试验采用 MTT 法观察了
FXEtOH 和XBEtOH对A549和Hela细胞株的体外生
长抑制情况.结果显示:狭苞橐吾乙醇提取物浓度在
100 ~400 μg /mL内,对 Hela 的生长抑制作用强于复
序橐吾,但 2种橐吾醇提取物对 A549 的抑制作用差
异不大,样品浓度在 400 μg /mL 时,抑制率均高于
60%.综上,2种橐吾乙醇提取物在 50 ~400 μg /mL内
对 A549 和 Hela的生长均有一定的抑制增殖、促进
凋亡的作用,且对肿瘤细胞的抑制呈剂量依赖关
系.因此,可以在本实验的基础上继续进行体内抑
瘤实验,为橐吾属植物抗肿瘤作用的研究提供理论
依据.
3. 2 体外抗氧化作用
本试验通过对复序橐吾、狭苞橐吾乙醇提取物
体外清除 和 O-2·能力的测定表明:FXEtOH 和
XBEtOH具有较好的综合抗氧化作用,且 FXEtOH
比 XBEtOH的抗氧化活性高,因此,复序橐吾、狭苞
橐吾可以作为天然抗氧化剂研发的植物资源.
越来越多的研究显示:抗氧化是一些中草药和
药食两用植物抗肿瘤的重要机制之一[7-8]. 抗氧化
剂能抑制肿瘤生长在于其能够剥夺不稳定的氧自
由基,以避免氧自由基对机体 DNA 的损伤[9]. 此
外,抗氧化剂在抗肿瘤作用中也可能是通过抑制氧
自由基的产生为机制,进而抑制 HIF-1(hypoxi-a-
inducible factor-1)的水平,使肿瘤在缺氧条件下的
生存能力减弱[10].本研究表明:2 种橐吾乙醇提取
物即能够抑制 A549 和 Hela肿瘤细胞生长,又显示
出良好的体外抗氧化活性,因此,2 种橐吾乙醇提
取物的抗肿瘤作用机制可能与其抗氧化作用相关.
抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡可能与提高
抗氧化物酶活性、清除氧自由基有关.
由此可见,抗氧化作用也可能是 2 种橐吾乙醇
提取物抑制 A549 和 Hela细胞生长的机制之一,但
其更深入的抗肿瘤作用机制还有待进一步研究.
参考文献:
[1]张达治,余国奠,张勉,等.橐吾属植物药用研究概况[J].
中国野生植物资源,2003,22(2):4-7.
[2]江苏新医学院.中药大词典(上、下册) [M]. 北京:人
民卫生出版社,1977:7,154,1152,2349.
[3]中国科学院北京植物研究所.中国高等植物图鉴(第四
册)[M].北京:科学出版社,1975:576-589.
[4]王威,左双海,程超.贡水白柚柚皮乙醇提取物的体外
抗氧化作用[J].食品科学,2010,15(31) :143-148.
[5]陈玫,张海德,陈敏,等. 几种中药不同溶剂组分的抗
氧化活性研究[J]. 中山大学学报(自然科学版) ,
2006,45(6) :131-133.
[6] Dejian H,Box in Ou,Ronald L. The chemistry behind
antioxidant capacity assay[J]. Agric Food Chem,2005,
53(6) :1841-1856.
[7]程海霞,徐海滨,严卫星.番茄红素的抗氧化及抗肿瘤[J].
中国食品卫生杂志,2003,15(6):545-586.
[8]陈剑锋.中药抗肿瘤作用机制的研究进展[J].黑龙江
医药,2011,24(3) :453-456.
[9]方莲花,陈若芸,郭晶,等. 桂枝茯苓胶囊提取物的体
外抗肿瘤活性及机制[J]. 中国药学杂志,2012,47
(10) :816-819.
[10] GAO P,ZHANG H,DINAVAHI R,et al. HIF-dependent
antitumorigenic effect of antioxidants in vivo[J]. Cancer
Cell,2007,12(3):230-238.
【责任编辑:陈丽华】
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