全 文 ：第 51卷 第 2 期
　2005 年 4 月
武汉大学学报(理学版)
J. Wuhan Univ.(Nat. Sci. Ed.)
Vol. 51 No. 2 　
Apr. 2005 , 258 ～ 262
　　收稿日期:2004-09-28　　　　†通讯联系人　E-mai l:aqu at icplan t@w bgcas. cnshiliu@rose. whiob. ac. cn
基金项目:中国科学院知识创新工程方向性项目(KSCX2-SW-104)
作者简介:刘艳玲(1976-),女 ,助理研究员 ,现从事水生植物研究. 　E-mail:shiliu@rose. w hiob. ac. cn
文章编号:1671-8836(2005)02-0258-05
基于 ITS 序列探讨睡莲属植物的系统发育
刘艳玲 , 徐立铭 , 倪学明† , 赵家荣
(中国科学院 武汉植物园 , 湖北 武汉 430074)
　　摘　要:对睡莲属 Nymphaea L. 11 个种和外类群中国莲 Nelumbo nuci f era Gae rtn. nrDNA 的 ITS 区(包括
ITS-1 , 5. 8S rDNA 和 ITS-2)进行了序列测定. 睡莲属植物的 ITS 序列总长度为 678 ～ 711 bp , ITS-1 和 ITS-2 序列
长度范围为 246～ 275 bp 和 266 ～ 275 bp.当空位(gap)作缺失处理时 , 睡莲属植物 ITS 区全序列排序后的长度为
735 位点 , 其中有 265 个(101 个位点在 ITS-1 区 , 164 个位点在 ITS-2 区)为系统发育的信息位点.以 Ne lumbo nu-
ci fera Gaertn.为外类群 , 利用 PAUP4. 0b4a 软件 ,采用最大简约法分析获得了 2 个最简约树 , 其步长为 658 , 一致
性指数(CI)和维持性指数(RI)值分别为 0. 845 0 和 0. 855 5.利用 2 个最简约树获取严格一致树 , 结果表明:热带睡
莲植物和耐寒睡莲植物分别聚成一支构成姊妹群 ,这与基于起源和对生态条件的不同要求 、或根据心皮的排列方
式而对睡莲属植物进行的传统分类一致.在热带睡莲植物内形成两个亚支 , 其内部支持率均为 100%;耐寒睡莲植
物内也形成了两个亚支 ,内部支持率分别为 98%和 85%.
关　键　词:睡莲属;内转录间隔区(ITS);系统发育
中图分类号:Q 949. 746. 1;Q 933　　　文献标识码:A
　　睡莲属 N ymphaea L.是睡莲科中最大的属 ,约
43种 ,广泛分布在欧亚大陆 、美洲 、非洲及大洋洲各
地 ,从北纬 68°11′到南纬 47°都有分布[ 1] . 该属为多
年生宿根浮水型植物 ,是园林水体绿化 、美化和净化
的主体水生花卉之一.睡莲属植物除作为观赏外 ,还
可供鲜切花和制作工艺干花 ,具有较高的经济价
值[ 2] . 另外 ,某些种的根茎 、花芽和种子可食用 、药用
或作染料及制革的媒染剂[ 3] . 如英国人用欧洲白睡
莲(N ymphaea alba)的根作染料;法国人把睡莲用
作酿造啤酒 、制作保健品 、化妆品的重要原料等.
我国虽仅有睡莲属植物 4 、5种[ 4] ,但随着国际
花卉市场的开放与流通 ,目前我国约有睡莲属植物
(含引种栽培)15 ～ 20种 ,品种上百个. 随着外来物
种和品种的增多 ,睡莲属植物同名异物或同物异名
现象相当普遍. 目前关于睡莲属植物的分类 ,一是根
据起源和对生态条件的不同要求[ 5] ,将睡莲属植物
分为热带睡莲(T ropical W ater lily)和耐寒睡莲
(Hardy Water lily)两大类. 二是根据心皮的排列
方式 ,把睡莲属植物划分为两组 5 个亚组 ,即离
生心皮组(Apocarpiae)包括缺柱亚组(Anecphya)
和矮柱亚组(Brachyceras) ,聚合心皮组(Syncarpi-
ae)则包括南非睡莲亚组(Castalia)、棒柱睡莲亚
组(Hydrocallis)和带柱睡莲亚组(Lotus)[ 6] . 关于
睡莲属植物分子系统发育研究 ,迄今未见国内外
的有关资料发表.
核糖体 DNA 中的内转录间隔区(internal t ran-
scribed spacer , ITS)序列由于可以提供较丰富的信
息位点 ,已被广泛用于植物系统发育与进化的研究
中 ,尤其是在属和属下分类等级的系统学和分子地
理学研究[ 7 ～ 9] 、杂交以及多倍化等研究中[ 10 ～ 13] . 本
文通过对睡莲属 11 种植物及外类群中国莲的
nrDNA ITS序列分析 ,构建睡莲属植物的 ITS 系统
发育树 ,并在此基础上结合一些重要的形态性状及
地理分布信息探讨其种间的系统发育关系.
1　材料与方法
1. 1　材料
实验材料包括睡莲属 11种植物和 1个外类群
中国莲 ,其来源及 Genbank 序号见表 1.
DOI牶牨牥牣牨牬牨牳牳牤j牣牨牰牱牨牠牳牳牫牰牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牪牱
第 2 期 刘艳玲 等:基于 ITS 序列探讨睡莲属植物的系统发育
表 1　实验材料及其来源
分 类 群 来　源 凭证标本　 基因库序列号
墨西哥睡莲 Nymphaea mexicana Zucc. Kew , 1987 Huang 8714 AY707893
柔毛齿叶白睡莲N ym phaea pubescens
Willd. var. alba
Xiamen Botanical
Ga rden , 1987 Zhao 8705　 AY707894　
柔毛齿叶红睡莲N ym phaea pubescens
Willd. var. rubra
Xiamen Botanical
Ga rden , 1987 Zhao 8706　 AY707895　
埃及蓝睡莲 N ym phaea coerulea Sav.　 The Lotus Garden in Modesto ,California , USA , 1995 Liu 20044　 AY 620420　
南非蓝睡莲 N ym phaea capensis Thunb.　 The Lotus Garden in Modesto ,California , USA , 1995 Liu 20045　 AY 620421　
睡莲 Nymphaea tetragona Geo rgi Nanjing Bo tanical Garden , 1987 Zhao 8711 AY707899
雪白睡莲 N ymp haea candida Pre sl Nanjing Bo tanical Garden , 1987 Zhao 8712 AY707900
香睡莲 N ymp haea odorata Ait.　 The Lotus Garden in Modesto ,California , USA , 1991 Deng 9108　 AY707901　
印度红睡莲 Nymphaea rubra Roxb.　 The Lotus Garden in Modesto ,California , USA , 1999 Liu 200411　 AY707902　
白睡莲 N ymp haea odorata Ait. var. alba Nanjing Bo tanical Garden , 1987 Zhao 8713 AY707903
延药睡莲 N ymp haea stellata Willd. H ainan , China , 1995 Feng 9501 AY707896
中国莲 Nelumbo nuci f era Gaertn. Wuhan Bo tanical Garden Liu 20042 AY620418
1. 2　总 DNA提取 、PCR扩增和 DNA测序
取上述植物的新鲜叶片约 0. 1 g 左右 ,采用改
良的 CTAB法[ 14] 提取总 DNA. 用White 等[ 15] 描述
的一对通用引物 ITS4和 ITS5进行 ITS 区的扩增
(ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′, ITS5:
5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′). PCR 反
应程序为:94 ℃预变性 4 min ,94 ℃变性 1 min ,50 ℃
退火1 min ,72 ℃延伸2 min ,30个循环 ,最后 72 ℃保
温7 min. 扩增产物经回收纯化后克隆到 pMD 18-T
载体上 ,并在含有X-Gal、IPTG和 Amp的 LB-琼脂平
板培养基上培养 ,挑选出阳性克隆送上海生工生物工
程技术有限公司进行序列测定 ,测序引物为 M13+/
M13 - .为了保证测序的准确性 ,对 ITS序列正 、反链
进行测定并加以校准.
1. 3　序列分析和系统树的构建
本文测定的序列经 Clustal X[ 16] 软件排序 ,个别
位点做必要的人工校正 , 以中国莲为外类群 , 用
PA UP 4. 0b4a
[ 17] 软件进行系统发育分析. 空位
(Gap)被处理为缺失(M issing).最大简约性分析采
用如下选项完成 ,即:树二组重新连接(TBR)、启发
式搜索(Heuristic Search)、多重性选择(MU L-
TREES opt ion)、ACCTRAN 优化和 1 000次随机
附加的重复.利用 bootst rap(1 000次重复)检验各
分支的置信度[ 18] .
2　结果与分析
2. 1　序列分析
本文测得的 11种睡莲属植物 ITS(包括5. 8S)、
ITS-1和 ITS-2序列长度范围分别为 678 ～ 711 bp 、
246 ～ 275 bp和 266 ～ 275 bp , 5. 8S rDNA 长度为
163 bp(其中睡莲 N ymphaea tetragona Geo rgi. 插
入 1 个碱基 A , 为 164 bp;雪白睡莲 N ymphaea
candida Presl.缺失一个碱基 T ,为 162 bp). I TS-1 、
ITS-2区的 G+C 含量分别为 50. 92%～ 58. 80%和
44. 73%～ 50. 54%(表 2). 睡莲属植物 ITS 区全序
列排序后的矩阵长度为 735位点 ,当空位(gap)作缺
失处理时 ,有 410个变异位点 , 265个为系统发育的
信息位点 ,其中 ITS-1区有 101个具有系统发育的
信息位点 ,占该区的 13. 74%, I TS-2区有 164个具
有系统发育的信息位点 ,占该区的 22. 31%.
2. 2　系统发育分析
以中国莲 Nelumbo nuci f era Gae rtn. 为外类
群 , ITS 全序列的简约性分析得到 2 个最简约树
(MPTs),该树树长为 658步 ,一致性指数(CI)和维
持性指数(RI)分别为 0. 8450和 0. 8555.其严格一
致树如图 1所示. 热带睡莲植物和耐寒睡莲植物分
别聚成一支 ,各自形成一单系类群 ,其靴带支持率分
别为 74%(属中度支持)和 100%. 在热带睡莲植物
内部 ,柔毛齿叶白睡莲 N. pubescens Willd. v ar. al-
ba 、柔毛齿叶红睡莲 N. pubescens Willd. var. rubra
和印度红睡莲 N. rubra Roxb. 聚为一小支 ,具有
100%的内部支持率;延药睡莲 N. Stel lata Willd.
则与埃及蓝睡莲 N. coerulea Sav.和南非蓝睡莲 N.
capensis Thunb.聚为一小支 ,支持强度为 100%.耐
寒睡莲植物内部 ,睡莲 N. tetragona Georgi和墨西
哥睡莲 N. mexicana Zucc.聚为一小支 ,内部支持率
259
武汉大学学报(理学版) 第 51卷
表 2　11 种睡莲属植物的 ITS长度和 G+C含量
分类群 ITS /bp ITS-1 ITS-2
Size /bp G+C /% Size /bp G+C /%
柔毛齿叶白睡莲 N ym phaea pubescens Willd. v ar. alba 697 261 56. 70 273 50. 36
柔毛齿叶红睡莲 Nymphaea pubescens Willd. var. rubra 697 261 56. 70 273 49. 64
印度红睡莲 N ym phaea rubra Roxb. 696 261 57. 09 272 50. 54
延药睡莲 N ym phaea stellata Willd. 711 273 50. 92 275 48. 23
埃及蓝睡莲 N ym phaea coerulea Sav. 708 274 51. 82 271 46. 76
南非蓝睡莲 N ym phaea capensis Thunb. 711 275 51. 27 273 45. 36
睡莲 N ymp haea tetragona Geo rgi 678 246 52. 85 268 44. 73
墨西哥睡莲 N ym phaea mex icana Zucc. 680 249 56. 63 268 47. 27
雪白睡莲 N ym phaea candida Pre sl 679 250 57. 20 267 49. 27
香睡莲 N ymp haea odorata Ait. 682 250 58. 80 269 48. 91
白睡莲 N ymp haea odorata Ait. var. alba 679 250 57. 20 266 48. 72
图 1　基于 ITS 序列分析得到的 2 个最简约树的严格一致树
(步长为 658 ,一致性指数(CI)0. 8450 ,维持性指数(R I)为 0. 8555)分枝下面的数值表示枝长变化 ,分枝上面的数值代表自展支持率
为 85%;白睡莲 N. odorata Ait. var. alba则与雪白
睡莲 N. candida Presl. 和香睡莲 N. odorata Ait .
聚为一小支 ,其靴带支持率为 98%.
3　讨　论
基于 ITS 序列构建的系统树(图 1)可以看出 ,
热带睡莲植物和耐寒睡莲植物分别聚成一支 ,并构
成姊妹群 ,这一结果与基于起源和对生态条件的不
同要求而进行的传统分类一致[ 5] .
热带睡莲植物是一单系类群得到支持 ,内部支
持率为 74%,属中度支持.在其内部分成两支 ,一支
是由延药睡莲 、埃及蓝睡莲和南非蓝睡莲组成的昼
开夜闭型睡莲[ 6] ,另一支则由柔毛齿叶红睡莲 、柔毛
齿叶白睡莲和印度红睡莲组成的夜开昼闭型睡
莲[ 6] ,两者的内部支持率均为 100%(图 1). 埃及蓝
睡莲和南非蓝睡莲以 100%的靴带支持率组成姊妹
群 ,这与基于形态特征对睡莲属植物进行的分类结
果一致:两者花柱呈三角形或短圆锥形而被置于短
柱亚组.同时 I TS 区的分析结果也与两者的地理分
布格局较为一致:埃及蓝睡莲 ,又名 Blue Nile Lo tus
或 Egyptian Lotus ,主要分布在非洲的中部和北部.
南非蓝睡莲 ,又名 Cape Blue Waterlily 或 Cape Wa-
terli ly ,主要分布在非洲的东南部和马达加斯加. 延
药睡莲[ 19] 花朵中等大小 ,蓝色 ,偶呈白色 ,星状辐射
型 ,在外部形态上与埃及蓝睡莲和南非蓝睡莲较易
区分 ,在地理分布上(主要分布于东南亚 、婆罗洲和
菲律宾)也与两者相隔较远 ,这在基于 I TS 序列构
建的系统发育树上较好地反映了这一点:埃及蓝睡
莲和南非蓝睡莲聚合后再与延药睡莲构成姊妹群.
柔毛齿叶红 、白睡莲和印度红睡莲叶缘具不等
三角状锐齿 、叶脉明显 、叶柄和叶下表面密生柔毛 、
星状花型 、柱头带状 、雄蕊线形且先端圆形 、花药先
端不延长 、花朵夜晚绽放翌日清晨闭合等独有共征
而与睡莲属其它类群形态差异较大[ 4 , 6] . 本文的 I TS
序列分析结果也表明:三者以 100%的靴带支持率
260
第 2 期 刘艳玲 等:基于 ITS 序列探讨睡莲属植物的系统发育
聚在一起构成一单系类群 ,具有较近的亲缘关系. 其
中 ,柔毛齿叶红睡莲分布于我国西南部 、云南南部 ,
印度 、爪哇岛也有[ 19] . 印度红睡莲原产于印度中部
和南部地区 ,在亚洲热带地区也有分布[ 5] .两者除在
花色 、花药 、雄蕊及萼片颜色(柔毛齿叶红睡莲花色
稍浅 ,花药和雄蕊均为黄色 ,萼片绿色;印度红睡莲
花朵紫红色 ,花药和雄蕊均为红橙色 ,萼片紫色)有
所差异外 ,其他植株形态特征较为相似[ 6] . 本文的
ITS序列分析结果也显示:两者以 85%的自展支持
率聚在一起构成姐妹群.
耐寒睡莲植物以 100%的靴带支持率聚在一起
构成单系类群 ,表明它们可能具有共同的起源.在其
内部又分出两个平行的分支 ,其中睡莲和墨西哥睡
莲聚成一支 ,内部支持率为 85%;香睡莲 、白睡莲和
雪白睡莲聚成一支 ,支持率高达 98%. 在地理分布
上[ 4 , 5 , 19] ,睡莲原产于我国 ,其自然分布区为北美洲 、
东欧 、亚洲 、澳大利亚;墨西哥睡莲原产于墨西哥 ,其
自然分布区为中部美洲;香睡莲原产于北美洲 ,雪白
睡莲原产于欧洲 、北亚以及我国新疆等地 ,其自然分
布区为欧洲的北部和亚洲.但本文基于 I TS 序列构
建的系统发育树显然与它们的地理分布格局不一
致 ,即两个美洲分布种墨西哥睡莲和香睡莲没有聚
在一起.但从形态特征上看 ,睡莲和墨西哥睡莲的叶
片上都有紫色斑块 ,根状茎为直立根状茎或块茎 ,而
香睡莲及其变种白睡莲和雪白睡莲的叶片上表面均
为绿色 ,无斑点 ,根状茎为水平匍匐状 ,与本文基于
ITS序列的分析结果较为一致.
致谢:感谢华中农业大学重点实验室石磊博士 、
陈银华硕士 、武汉大学郭友好教授 、陈进明博士在实
验过程及序列分析中给予的大力支持与帮助.
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Phylogeny Relationship of Nymphaea L. Based on ITS Sequences
LIU Yan-ling , XU Li-ming , NI Xue-ming , Zhao Jia-rong
(Wuhan Botanical Garden , Chine se Academy o f Sciences , Wuhan 430074 , H ubei , China)
　　Abstract:The internal t ranscribed spacer (ITS) regions of nuclear ribo somal DNA from 11 species of
N ymphaea L. and one outgroup species of Nelumbo nuci f era Gaertn. w ere sequenced. The regions
ranged in length f rom 678 to 711 bp , with I TS-1 (246-275 bp) slight ly shorter than ITS-2 (266-275 bp).
Of the 735 aligned sites , 265 si tes (101 in ITS-1 , 164 in ITS-2)were phy logene tically info rmative and the
number of phylo genetically informative lo ci w as highe r in ITS-2 than in ITS-1. Taking Nelumbo nuci fera
Gaertn. as outgroup , phy logenetic analy sis o f ITS sequences using PAUP4. 0b4a sof tw are obtained tw o
most parsimonious t rees (Leng th=658 , CI=0. 845 0 and RI=0. 855 5) when the gaps w ere t reated as
missing . The concensus t ree indicated that Nymphaea L. could be divided into tw o main clades. One clade
w as tropical wa ter lily , the othe r clade w as hardy w ater lily . And the results of ITS sequences analy sis
were consistent w ith that of the t radi tional division of Nymphaea L. on the basis of the di fferent regions ,
habits o r the division of seedpods. At the same time , the t ropical w ater lily w as divided into tw o subclades
wi th identical boo tst rap values of 100% and the ha rdy w ater lily w as also divided into tw o subclades w ith
bootstap values of 98% and 85% repectively .
Key words:Nymphaea L. ;inte rnal t ranscribed spacer(ITS);phy log eny
262