全 文 ：2015 年 9 月 第 17 卷 第 9 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Sep. 2015 Vol. 17 No. 9
·基础研究·
△ ［基金项目］ 国家自然科学基金青年科学基金项目(31200673);重大新药创制国家科技重大专项(2014ZX0930437001，
2014ZX0930437002)
* ［通信作者］ 马双成，博士，研究员，研究方向:中药材检验与质量标准研究;Tel:(010)67095272，E-mail:masc@
nifdc. org. cn
魏锋，博士，研究员，研究方向:中药材检验与质量标准研究;Tel:(010)67095432，E-mail:weifeng@
nifdc. org. cn
聚合酶链式反应 -限制性片段长度多态性方法
对太白贝母鉴别检验的适用性探讨
△
张文娟1，尚柯2，魏锋1* ，马双成1*
(1. 中国食品药品检定研究院，北京 100050;2. 成都市食品药品检验研究院，成都 610045)
［摘要］ 目的:探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCＲ-ＲFLP)对于太白贝母的适用性。方法:
采集太白贝母野生及栽培品，收集市场上太白贝母伪品，利用性状、PCＲ-ＲFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分
析太白贝母与常见伪品的区别。结果:从性状上看，太白贝母栽培品与伪品往往非常相似，较难辨别;通过 PCＲ-
ＲFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品，基于 ITS2 的 DNA条形码方法进一步验证了 PCＲ-ＲFLP法的
准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论:PCＲ-ＲFLP 鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品;市场上太
白贝母伪品较多，应加强监管。
［关键词］ 太白贝母;伊犁贝母;鉴别;性状;聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCＲ-ＲFLP);内
转录间隔区(ITS)
Applicability of PCＲ-restriction Fragment Length Polymorphism
Method in Identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus
ZHANG Wenjuan1，SHANG Ke2，WEI Feng1* ，MA Shuangcheng1*
(1. National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;
2. Chengdu Institutes for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China)
［Abstract］ Objective: To explore the applicability of polymerase chain reaction-restriction fragment length
polymorphism (PCＲ-ＲFLP)on identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus. Methods:The samples of wild and cultivated F.
taipaiensis and the samples from the market were colleeted，and they were identified from the common adulterants adulterants
based on characteristics，PCＲ-ＲFLP，and DNA sequence analysis. Ｒesults:It was difficult to identify F. taipaiensis from its
adulterants by characteristics as they showed similar appearance. With the method of PCＲ-ＲFLP F. taipaiensis was accurately
and objectively identified，which was further verified by DNA barcoding based on ITS2. On the market，most of the
adulterants of F. taipaiensis were F. pallidiflora. Conclusion:The method of PCＲ-ＲFLP could be successfully applied in the
identification of F. taipaiensis. The adulterants of F. taipaiensis on the market are so common that its quality control needs to
be strengthened.
［Keywords］ Fritillaria taipaiensis; F. pallidiflora; identification; characteristics; polymerase chain reaction-
restriction fragment length polymorphism(PCＲ-ＲFLP);internal transcribed spacer (ITS)
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2015． 9． 006
太白贝母 Fritillaria taipaiensis P. Y. Li为百合科
贝母属多年生草本植物，其干燥的鳞茎作为药用。
根据《城口厅志》记载，早在清道光二十三年 (公
元 1843 年)城口就有贝母药用［1］。《中华人民共和
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国药典》2010 版将太白贝母作为川贝母的原植物收
载［2］，这给太白贝母资源的开发带来了机遇，同时
也给太白贝母野生资源的保护带来了新的挑战，增
加了紧迫感。
野生太白贝母资源主要分布在大巴山、巫山及
武陵山海拔 1860 ～ 2500 m 的山坡草丛或灌木丛中，
资源稀少，呈带状或片块状分布。太白贝母又称尖
贝、川东贝母，主产重庆市巫溪、城口和陕西太白
县，具有引种栽培适应性强、产量高的特点，为目
前川贝母中最易栽培的品种之一，目前市场上的太
白贝母以栽培品为主［3-4］。
太白贝母栽培品的出现也带来了新的问题。有
些栽培品与市场上川贝母的常见伪品(如伊贝母)相
比，在外观上非常相似，给鉴别检验带来了一定的
困难。《中华人民共和国药典》2010 版 第一增补本
中，收录了基于 ITS 序列的川贝母 PCＲ-ＲFLP 鉴别
法［5］。ITS(internal transcribed spacer)是核糖体 ＲNA
基因的非转录区，包括 ITS1 和 ITS2 两个部分。该区
域在物种内差异不大，然而种间差异较明显，因而
非常适用于植物分类学研究和中药材的基原鉴
定［6，7］。PCＲ-ＲFLP鉴别法即在 PCＲ 的基础上，对特
异片段进行切割，如果酶切位点发生了突变，便不
能被切割;片段是否被切割可以通过琼脂糖凝胶电
泳法检测。由于川贝母基因组 rDNA 的 ITS1 区段存
在限制性内切酶 SmaI的识别位点，而贝母属其他品
种在该区域没有这一位点，因此可以用这种方法区
别川贝母和其他贝母［8］。
该方法从 DNA 角度对样品进行分析鉴别，不
受外观变异的影响，也不易被药材取样部位、放置
时间等因素干扰，结果客观、稳定、准确。川贝母
基原多样、外观多变，一直以来其真伪鉴别是个难
点问题，而该方法的出现无疑为解决这一难题提供
了强有力的武器。检验人员在用该方法检验 “太
白贝母”样品时，发现较多批次不合格，其中多
为栽培品。这些被判为了不合格的 “太白贝母”
本来就是伪品，还是发生了栽培变异，从而导致该
方法不适合太白贝母栽培品的检验?为了揭开这一
疑问，我们收集了太白贝母野生品和栽培品，以及
市场上太白贝母的样品，对这些样品进行性状、
PCＲ-ＲFLP以及 DNA条形码分析，结果发现正品太
白贝母具有符合药典标准的性状特征，PCＲ-ＲFLP
法检验亦符合药典相关标准规定，PCＲ-ＲFLP 法
检验判定为不合格的太白贝母样品，用基于 ITS2
的 DNA 条形码方法进一步得到了验证。我们的研
究结果提示，PCＲ-ＲFLP 法适用于太白贝母的鉴
别检验;市场上太白贝母伪品较多，以伊贝母最
为常见。本研究肯定了 PCＲ-ＲFLP 法在太白贝母
鉴别中的适用性，在一定程度上揭示了太白贝母
的市场状况，为其市场监控检验提供了理论和技
术指导。
1 仪器材料与方法
1. 1 仪器和材料
1. 1. 1 仪器
PCＲ 仪 (ABI VEＲITI) ，分 析 天 平 (Mettler
AB135-S) ，纯水仪(Millipore 公司) ，电泳仪(EPS-
301， Amersham ) ，全 自 动 凝 胶 成 像 系 统
(SyngeneGeneGenius) ，球磨仪(M400，Ｒetsch) ，微
量紫外分光光度计，水浴锅。
1. 1. 2 试剂
快捷型植物基因组提取试剂盒(DP321，天根生
化科技有限公司) ，Ex Taq(DＲＲ100B，TaKaＲa) ，
dNTP Mixture 10 mM(N0447，New England Biolabs) ，
Sma I(Ｒ0141，New England Biolabs)GelＲed(41003，
Biotium) ，琼脂糖(BLOWEST) ，GelＲed(Biotium) ，
Tris碱，冰醋酸，EDTANa22H2O(国药集团化学试剂
有限 公 司) ，引 物 (华 大 基 因)上 游: 5 ‘-
CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’下 游: 5 ‘-
GCTACGTTCTTCATCGAT-3’，用于测序的引物(华
大基因)上游:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-
3’，下游:5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC -3’。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品来源 本实验所用太白贝母野生品为野外
采集并经过相关专家确认，栽培品部分采自栽培基
地，部分为厂家送样。
1. 2. 2 样品处理 取太白贝母样品一粒，用酒精棉球
将表面擦拭干净，晾干;用球磨仪磨成极细粉末，
称取粉末样品约 30 mg备用。
1. 2. 3 DNA提取和定量分析 按照基因组 DNA提取试
剂盒说明书进行操作。用微量紫外分光光度计进行
DNA定量。
1. 2. 4 聚合酶链式反应(PCＲ)反应条件
预变性 94 ℃ 5 min
反应循环(35 轮)94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃
30 s
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最后延伸 72 ℃ 5 min
1. 2. 5 SmaI 酶切反应:反应体系 20 μL———取 PCＲ
产物 10 μL，加入 SmaI 0. 5 μL，反应缓冲液 2 μL，
高压蒸汽灭菌的去离子水 7. 5 μL。
1. 2. 6 琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像:使用 1. 5%琼脂
糖凝胶进行电泳，电压 5V /cm，约 40 min;之后使
用紫外凝胶成像仪拍照并保存结果。
1. 2. 7 序列测定:PCＲ 反应条件:预变性 94 ℃
5 min;反应循环(35 轮)94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，
72 ℃ 30 s;最后延伸 72 ℃ 5 min。PCＲ 反应体系
25 μL:DNA 模板 1 μL，上下游引物各 0. 2 μL，
Taq DNA 聚合酶 0. 2 μL，dNTP(10 mM)0. 6 μL，
反应缓冲液 2. 5 μL，高压蒸汽灭菌的去离子水
(ddH2O)20. 3 μL
［5］。PCＲ 样品送华大基因完成
测序。
1. 2. 8 序 列 分 析: 用 Codoncode Aligner 4. 06
(Codoncode Co. ，USA)软件进行序列拼接及校对，
去除序列两端的低质量部分。利用 ITS2 数据库
(http: / / its2-old2. bioapps. biozentrum. uni-wuerzburg.
de /cgi-bin / index. ) ，去除序列两端 5. 8S 和 28S 区
域，获得完整的 ITS2 序列。用 MEGA5. 0 软件，对
不同样品的 ITS2 序列进行比对(Clustal W)及变异位
点分析。
2 结果
2. 1 性状特征
收集野生太白贝母样品 10 批，太白贝母栽培品
10 批及以太白贝母送检的样品 6 批。野生样品由中
国食品药品检定研究院张南平老师鉴定。
野生太白贝母以青贝多见，即类扁球形，鳞叶
大小悬殊，大瓣与小瓣抱合不紧;顶部闭合，先端
尖;小瓣中下部近等宽，先端渐尖;大瓣基部明显
隘缩状。高 0. 4 ～ 1. 0 cm，直径 0. 6 ～ 1. 1 cm，呈黄
白色，表面较粗糙，有褐色斑点，气微，略苦。
太白贝母栽培品在性状上变异较大，呈类长圆
柱形，鳞叶大小悬殊，抱合紧密;顶部闭合，先端
钝圆，基部明显隘缩状。高 0. 7 ～ 1. 8 cm，直径
0. 9 ～ 1. 6 cm。表面及气味特征似野生品种。
以“太白贝母”送检的 6 批样品，多呈类圆锥
或圆柱形，外层鳞叶两瓣，肥大，一片较大或近等
大，抱合。顶端稍尖，少有开裂，基部微凹陷。与
野生太白贝母及其栽培品相比，个头较大，一般高
1. 5 ～ 2. 0 cm，直径 1. 0 ～ 1. 5 cm。表面及气味特征
与野生和栽培太白贝母无明显差异(图 1，表 1)。
A 太白贝母 (野生) ;B 太白贝母 (栽培) ;
C和 D:太白贝母伪品 (伊贝母)
图 1 太白贝母及伪品伊贝母
表 1 太白贝母及其伪品(伊贝母)的性状特征
样品名称 形状 大小 色泽 表面 气味
太白贝母
(野生)
呈类扁圆锥形，鳞叶大小悬殊，大瓣与小瓣
抱合不紧;顶部闭合，先端尖;小瓣中下部
近等宽，先端渐尖;大瓣基部明显隘缩状
高 0. 4 ～ 1. 0 cm，
直径 0. 6 ～ 1. 1 cm
黄白色 较粗糙，有褐色
斑点
气微，味微苦
太白贝母
(栽培)
呈类长圆柱形，鳞叶大小悬殊，抱合紧密;
顶部闭合，先端钝圆，基部明显隘缩状
高 0. 7 ～ 1. 8 cm，
直径 0. 9 ～ 1. 6 cm
黄白色 较粗糙，有褐色
斑点
气微，味微苦
伪品
(伊贝母)
呈类圆柱形，外层鳞叶两瓣，肥大，一片较
大或近等大，抱合。顶端稍尖，少有开裂，
基部微凹陷。
高 1. 5 ～ 2. 0cm，
直径 1. 0 ～ 1. 5cm
黄白色 较粗糙，有褐色
斑点
气微，味微苦
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2. 2 PCＲ-ＲFLP结果
按照《中华人民共和国药典》2010 版第一增补
本 川贝母项下的 PCＲ-ＲFLP 鉴别法，我们对这些太
白贝母样品进行了检测。所有野生太白贝母样品的
PCＲ产物都能够被限制性内切酶 Sma I 切成两个片
段，大小位于 100 ～ 250bp，即符合 《中华人民共和
国药典》的相关规定。太白贝母栽培品 10 批中有 8
批也得到相同的结果;另有 2 份栽培品，其 PCＲ 产
物不能被 Sma I 酶切，即不符合《中华人民共和国药
典》的相关规定(图 2，3，4)。所有标为 “太白贝
母”的待检样品，其 PCＲ产物均不能被 Sma I 酶切。
DNA测序结果提示，这些不符合 《中华人民共和国
药典》相关规定的 “太白贝母”样品实际为伊犁
贝母。
a:PCＲ产物;b:PCＲ产物被 SmaI酶切后;
1-6:太白贝母(野生) ;M:DNA分子量标记;
B:空白对照;P:阳性对照
图 2 太白贝母(野生)的 PCＲ-ＲFLP结果
1-4:太白贝母(栽培) ;M:DNA分子
量标记;B:空白对照;P:阳性对照
图 3 太白贝母(栽培)的 PCＲ-ＲFLP结果
2. 3 以 ITS2 作为分子标记的 DNA条形码和序列分析
我们选择被 PCＲ-ＲFLP 鉴定法判定为不符合规
a:PCＲ产物;b:PCＲ产物被 SmaI酶切后;
1-6:太白贝母检品 M:DNA分子量标记;
B:空白对照;P:阳性对照
图 4 太白贝母检品的 PCＲ-ＲFLP结果
定的样品及部分正品的 PCＲ 产物进行测序，得到样
品 DNA的 ITS2 区段，BLAST检索 NCBI的核酸数据
库，得到样品的基原信息，用以佐证 PCＲ-ＲFLP 的
结果。被 PCＲ-ＲFLP 方法判定为合格的样品，确实
为太白贝母;而判定为不合格的太白贝母样品，
DNA条形码方法的分析结果为伊犁贝母(表 2)。即
两种方法的结果是一致的，说明 PCＲ-ＲFLP 法可以
用于太白贝母的检验。
进一步对样品 DNA 的 ITS2 序列进行分析，发
现太白贝母的 ITS2 为 238bp，伊犁贝母为 239bp，二
者之间共存在 12 处变异，其中伊犁贝母在 ITS2 序
列的第 34 位插入了一个 “G”，因此总长度比太白
贝母多一个碱基(图 5)。
3 讨论
按照《中华人民共和国药典》2010 版第一增补
本的规定，太白贝母被作为川贝母来源之一［5］。因
其引种栽培适应性强、产量高，故市场上的太白贝
母以栽培品多见［3-4］。然而栽培品性状变异较大，与
其它贝母属植物来源的贝母(如伊犁贝母)相似度较
高，因此仅依靠性状鉴别往往难以得出真伪与否的
结论。PCＲ-ＲFLP 鉴别法与仅凭肉眼观察的形状鉴
别法相比，客观，准确，很好的解决了这一难题［5］。
然而，利用该方法对市场上的太白贝母进行检验之
后，发现很少有合格产品。面对这种情况，检验人
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表 2 样品信息及对应的 PCＲ-ＲFLP、DNA条形码鉴定结果
编号 样品名称 来源 PCＲ-ＲFLP结果 DNA条形码结果提示
A2 太白贝母(野生) 重庆巫溪 符合规定 Fritillaria sinica(太白贝母)
A3 太白贝母(野生) 重庆巫溪 符合规定 Fritillaria sinica(太白贝母)
B1 太白贝母(野生) 陕西太白 符合规定 Fritillaria sinica(太白贝母)
B2 太白贝母(野生) 陕西太白 符合规定 测序失败
C1 太白贝母(栽培) 重庆巫溪 符合规定 Fritillaria sinica(太白贝母)
C2 太白贝母(栽培) 四川城口 符合规定 Fritillaria taipaiensis(太白贝母)
D1 太白贝母(栽培) 四川城口 不符合规定 Fritillaria pallidiflora(伊犁贝母)
D2 太白贝母(栽培) 四川城口 不符合规定 Fritillaria pallidiflora(伊犁贝母)
E1 太白贝母检品 四川城口 不符合规定 测序失败
F1 太白贝母检品 重庆巫溪 不符合规定 Fritillaria pallidiflora(伊犁贝母)
G2 太白贝母检品 四川城口 不符合规定 Fritillaria pallidiflora(伊犁贝母)
H2 太白贝母检品 四川城口 不符合规定 Fritillaria pallidiflora(伊犁贝母)
图 5 太白贝母与常见混伪品伊犁贝母的序列比对分析
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员不禁产生了疑虑:究竟是市场上太白贝母伪品多，
还是该 PCＲ-ＲFLP 鉴别法不适用呢?本研究通过对
基原明确的太白贝母样品以及检品，同时进行性状、
PCＲ-ＲFLP和 DNA条形码的分析，明确了正品太白
贝母，无论野生还是栽培品，均应符合 《中华人民
共和国药典》2010 版第一增补本川贝母项下 PCＲ-
ＲFLP鉴别法的规定进行测序的样品中，有 2 批(符
合和不符合 PCＲ-ＲFLP鉴别法规定的各有 1 批)样品
测序结果因严重套峰而导致测序失败。溯源样品发
现这两批样品真菌污染非常严重，可能 PCＲ 产物中
存在真菌 ITS 的污染，从而导致测序套峰的出现。
尽管我们尽可能去除真菌污染部分之后，重复试验
并再次送样测序，仍然是严重套峰的结果。ITS 存在
多拷贝现象［9］，也可导致套峰的出现。究竟是因为
真菌污染还是 ITS多拷贝，目前尚不清楚。
在本研究中，DNA 条形码技术作为对 PCＲ-
ＲFLP结果的验证方法，起到了关键性作用。由于可
以精确知晓待鉴定药材的基因序列，DNA 条形码的
方法较之其他的 DNA 分子鉴别法，其结果更为准
确、可靠。因此，当我们在实际工作中遇到用其他
方法难以鉴别的中药材时，可采用该方法予以检验，
从而得到比较确定的结论。目前，中药材 DNA 条形
码方面的应用研究已有较大进展:对于现行 《中华
人民共和国药典》收录的绝大多数中药材品种，已
获得其准确的 DNA 条形码序列;并且，在此基础
上，将二维码技术与 DNA条形码技术相结合，为每
个药材基原物种提供标准二维 DNA条形码，有利于
DNA条形码信息在不同平台间转换，为二维 DNA条
形码技术在实际流通监管工作中的应用提供理论基
础，能有效实现对中药材流通的数字化监管，推动
中药材流通监管现代化、国际化进程。这些研究成
果为 DNA条形码在中药材鉴定中的应用打下了良好
的基础。由陈士林教授课题组起草的 “中药材 DNA
条形码分子鉴定指导原则”已收录入 《中华人民共
和国药典》，表明该技术面向应用迈出了坚实的一
步，未来的应用前景十分广阔［10-13］。本研究结果提
示，市场上太白贝母伪品较多，需加强监管力度。
在未来，如果二维 DNA 条形码技术得到推广应用，
相信类似贝母这样基原复杂中药材的市场乱象将得
到很好控制。
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(收稿日期 2015-08-03)
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