全 文 ：Vol.32 , No.11
pp.1764-1766　Nov., 2006
作　物　学　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 32 卷 第 11期
2006年 11 月　1764～ 1766 页
研究简报 通过甘蓝型油菜和白芥属间杂种后代的小孢子培养获得二体异　附加系
张永泰1　李爱民1　陆　莉2　陈　柳2　惠飞虎1　王幼平2 , ＊
(1 江苏里下河地区农业科学研究所 ,江苏扬州 225007;2 扬州大学生物科学与技术学院 ,江苏扬州 225009)
摘　要:对3 株甘蓝型油菜-白芥单体异附加系(2n=39)进行小孢子培养 ,共获得 15 株单倍体植株。经 GISH 鉴定 , 其中
11株 n =19 , 4株附加有一条白芥染色体(n=20)。经秋水仙素加倍处理 ,获得了二体异附加系(2n=40), 这为远缘杂交
后代外源基因的保存 、纯合和利用提供了一条新的途径。
关键词:甘蓝型油菜;白芥;小孢子培养;二体异附加系
中图分类号:S565
Disomic Alien Addition Lines Generated through Microspore Culture from Progeny
of Intergeneric Hybrids between Brassica napus and Sinapis alba
ZHANG Yong-Tai1 , LI Ai-Ming1 , LU Li2 , CHEN Liu2 , HUI Fei-Hu1 and WANG You-Ping2 , ＊
(1 Jiangsu Institute of Agricultural Science in the Lixiahe District , Yangzhou 225007 , Jiangsu;2College of Bioscience and Biotechnology , Yangzhou University ,
Yangzhou 225009 , Jiangsu , China)
Abstract:Microspore culture of three monosomic alien addition lines from the hybrids between B.napus and S.alba(2n =39)was
carried out.In total , fifteen microspore-derived plants were obtained , among them eleven seedlings were determined to have 19
chromosomes , and four seedlings to have 20 chromosomes.Doubled haploid plants were produced after treatment with colchicine and disomic
chromosome addition lines(2n=40)were identified by GISH analysis.This method is a novel route to preserve , purify and utilize the
genetic germplasm with important agricultural characteristics in further rapeseed breeding.
Key words:Brassica napus L.;Sinapis alba L.;Microspore culture;Disomic alien addition line
　　甘蓝型油菜(Brassica napus L., AACC)是我国油菜的主
要栽培品种 , 但其遗传基础单一的问题十分突出[ 1] 。 菌核
病 、病毒病和霜霉病是我国油菜生产中的主要病害[ 2] 。白芥
(Sinapis alba L.)属于十字花科白芥属 , 和油菜关系非常相
近 ,具有很多优良的农艺性状(如黄籽 、抗旱和抗裂荚
等)[3-4] ,而且对十字花科多种病虫害如病毒病 、黑胫病 、黑斑
病和线虫病等有较高的抗性[5-8] 。国内有关白芥利用的报道
很少 ,巩振辉等通过子房培养获得抗黑斑病白菜型油菜与白
芥的属间杂种[ 9] 。我们通过电融合技术 , 获得甘蓝型油菜与
白芥的属间杂种 F1(AACCSS)[ 4] , 通过和甘蓝型油菜不断回
交的方法 , 获得 3 个附加不同白芥染色体的单体异附加
系[ 10] 。本研究针对这些单体异附加系有可能丢失染色体的
缺点 ,对其进行小孢子培养 , 以期建立纯合二体异附加系 , 为
保存这些特殊的材料和进一步利用这些材料开展优质 、高抗
油菜育种创造条件。
1　材料和方法
1.1　试验材料
　　甘蓝型油菜(Brassica napus L., 品种为来自德国的
Maplus)和白芥(Sinapis alba L., 来自德国 IPK)属间杂种后代
与江苏里下河地区农科所选育的甘蓝型油菜新品种(国审
油:2004026)及育种中间材料(扬鉴8 号 、扬选 215 和扬 0401)
不断回交 ,从 BC3 代中筛选到单体异附加材料(2n=39)。
1.2　甘蓝型油菜-白芥单体异附加系小孢子培养
1.2.1　小孢子的分离　　从含有 39 条染色体的植株上取主
花序或第一次分枝花序上长 3～ 4.5 mm 左右的花蕾(单核晚
期的小孢子), 用 96%酒精表面消毒 15 s ,再用 4% NaOCl消
毒15 min , 无菌水冲洗 3 次 , 置灭菌小烧杯中 , 加 25 mL NLN
基金项目:国家自然科学基金(30571175)和江苏省自然科学基金(BK2005048)资助。
作者简介:张永泰(1964 ),男 ,江苏兴化人 ,硕士 ,副研究员,主要从事油菜遗传育种和栽培研究工作。
＊通讯作者(Corresponding author):王幼平(1965 ),男 ,博士 ,教授,博士生导师 ,主要从事油菜遗传和生物技术育种研究。 Tel:
0514-7997303 , E-mail:wangyp@yzu.edu.cn
Received(收稿日期):2005-12-13;Accepted(接受日期):2006-04-14.
培养基 ,其中蔗糖浓度为 13%[ 11] , 用研磨杵轻轻将花蕾研
碎 , 通过45 μm 的尼龙网膜过滤 , 收集滤液 ,离心 5 min(转速
为500×g)。吸出含有小块药壁残渣的上清液 , 再加蔗糖浓
度为13%的 NLN培养基 , 离心5 min(转速为 450×g)。吸去
上清液 , 将沉淀的小孢子悬浮于蔗糖浓度为 13%的 NLN 液
体培养基中 , 按小孢子的密度 6×104 mL 定溶 , 转入直径 90
mm 的培养皿中 ,每皿 2 ～ 3 mL。
1.2.2　小孢子培养和植株的再生　　将分离到的小孢子于
30 ～ 33℃黑暗条件下静置培养 5 d , 25℃下继续暗培养 2 周。
再于摇床上暗光震荡培养(90 r min)1 周后在光照条件下继
续培养 ,直到小孢子幼胚发育成子叶胚。子叶胚生长至 4～ 5
mm 时 , 将其转入固体培养基(MS 培养基 + 20 g L 蔗糖 +
7.5 g L 琼脂糖 +0.2 mg L NAA + 0.2 mg L 6-BA), 24℃条件
下培养 ,每日 16 h光照 , 8 h 黑暗 , 3 ～ 4 周后出现苗的分化 , 然
后转入不含激素的MS 培养基让苗进一步发育 , 再转入生根
培养基(MS 培养基 + 20 g L蔗糖 +0.5 mg L NAA +8 g L
琼脂糖)诱导根的形成。
1.3　单倍体植株的染色体加倍
再生植株移到温室中 , 开花前将植株从花盆中拨出 , 用
自来水洗去根际土壤 , 然后浸在秋水仙素溶液中(3.4 g L)
1.5 h[12] , 用自来水冲洗 3 h , 再将植株栽于花盆 ,开花 、自交
结实。
1.4　荧光原位杂交
取来自小孢子培养再生植株的幼根和秋水仙素处理后
自交结实种子萌发所得的根尖 ,经 2 mmol L的 8-羟基喹啉预
处理 4 h , 用乙醇-冰醋酸(3∶1)固定液固定 。制片前先用蒸溜
水冲洗 2～ 3 次 , 用酶液[ 2%(W V)纤维素酶 , 20%(V V)果
胶酶] 处理 2 h (37℃), 制片方法和探针的制备同文献[ 10] ,
选用荧光素 12-d-UTP 并通过缺口平移法试剂盒(Catalogue
No.976776 , Roche , 德国)进行标记。 标记好的探针和染色
体一起在 80℃条件下变性 4 min , 然后于湿盒内 37℃杂交过
夜。杂交后经 2×SSC 和 0.4×SSC 在 42℃条件下冲洗。 玻
片加 10 μL PI(Propidium iodide , 内含抗褪色剂)。在 Olympus
BX51 荧光显微镜下使用不同的滤光片分别观察红色的染色
体和黄色的探针杂交信号 , 并用 CCD摄像及 Image-Pro Plus
Version 5.0软件进行图像的合并和处理。
2　结果与分析
2.1　单体异附加系的农艺性状观察
　　从回交后代中经鉴定的 3 个单体异附加系(BC2-1-1 ,
BC2-1-2和 BC2-1-3)植株生长健壮 , 比甘蓝型油菜高 , 但株型
似白芥 , 3株之间的外形也有差异。 BC2-1-1 叶片呈深绿色 ,
无蜡粉。BC2-1-2植株的茎粗壮 , 在幼茎和叶的背面和边缘
长有毛状体。 BC2-1-3 的株型特别紧凑。 3 个植株的花粉育
性为 82%～ 90%。通过和甘蓝型油菜回交可以结实 , 角果似
白芥 , 均具有较长的喙 , 每个角果含 5 ～ 7 个种子 , 种子比甘
蓝型油菜大 , BC2-1-1 和 BC2-1-2 种子为褐色 , BC2-1-3 的种子
为棕黄色 ,似白芥。
2.2　小孢子培养再生成植株
在供试的 3个单体异附加系材料中 , 每个选摘 30 个合
适的花蕾 , 分离到的小孢子多数为圆球形 , 大小比较均一。
在培养初期小孢子悬浮于蔗糖浓度为 13 %的 NLN液体培养
基中 ,不见光的条件下培养 5 d(33℃), 在这期间 , 小孢子明
显的膨大。5 d后转入 25℃不见光生长 , 7 d 后发现有部分小
孢子开始分裂(图 1-A)。在接下来的 2 周内 , 小孢子继续分
裂形成多细胞团 , 3 周后细胞团进一步长大形成球形胚 ,但多
数小孢子没有进一步发育(图 1-B)。然后将材料转移到弱光
下 ,并轻微摇动 , 大约 6 周左右用肉眼可以观察到大小和形
状不一的胚状体(图 1-C), 90个花蕾共诱导出 68 个胚状体。
诱导出的胚状体转到固体培养基上生长 3～ 4 周后出芽并长
成幼苗(图 1-D),继续培养共独立再生出 15 株植株。
图 1 小孢子培养及其 GISH分析
Fig.1 Microspore cul ture and GISH analysis
A:小孢子分裂;B:球形胚;C:胚状体;D:再生苗;
E:单倍体植株(2n=20 , 1条来自白芥的染色体有黄色杂交信号);
F:加倍后的二体(2n=40 , 2条染色体具有黄色杂交信号)。
标尺为 2μm。
A:Division of microspores;B:Globular embryo;C:Embryoids;
D:Regenerated plantlets;
E:Haploids(2n=20 , 19 chromosomes f rom B.napus in red and
single chromosome from S.alba in yellow);
F:Doubled haploid plant(2n=40 , 38 chromosomes from B.napus
in red and two chromosomes from S.alba in yellow).Bar=2μm.
2.3　再生植株和自交后代的 GISH分析
对生长健壮的 15株植株 , 诱导生根 ,并同时取其新长出
的根尖进行GISH分析。其中 , 11 株具有 19 条染色体 , 在 19
条染色体中均没有发现来自白芥染色体的杂交信号 , 有 4 株
含有20条染色体 , 经GISH 鉴定证明 19条染色体来自甘蓝型
油菜 , 染色体被 PI 染成红色 , 而有一条是来自白芥的染色
体 ,有黄色的杂交信号(图 1-E)。 经秋水仙素处理后植株进
行套袋自交 ,所结的种子进行 GISH 分析 , 其中带有 20 条染
色体的单倍体出现了染色体的加倍 , 即带有 2条来自白芥的
染色体(图 1-F)。
3　讨论
甘蓝型油菜具有丰产性 ,而白芥具有耐旱 、抗病 、黄籽和
抗裂荚等优良特性 , 通过甘蓝型油菜和白芥属间杂种的获
得[ 4] , 不断和甘蓝型油菜回交 , 获得大量附加不同数目白芥
1765　第 11期 张永泰等:通过甘蓝型油菜和白芥属间杂种后代的小孢子培养获得二体异附加系 　　　
的染色体 ,通过回交后代(BC1 和 BC2)减数分裂的 GISH 分析
也证明了甘蓝型油菜和白芥染色体出现交叉和互换及基因
组的重组[ 10] ,为进一步利用白芥的优良特性提供了可能。该
文对附加有 1 条白芥染色体的单体异附加系(2n=39)进行
小孢子培养 ,由于单体异附加系的减数分裂会形成 19Ⅱ+1
Ⅰ ,这一个单价体在减数分裂的后期就会随机地分向细胞的
两极 ,产生两种不同的配子 , 分别是 n=19 和 n =20 , 在我们
的研究中也证实了这一点。虽然从理论上讲两者的比例应
该是1∶1 , 但由于目前单体异附加材料有限 , 所得的小孢子培
养再生的植株规模不大 , 另一方面 , 起源于 n =19 的配子在
培养过程中的成活率估计会高些 ,这在以前的研究中也有类
似的发现[ 13] 。但所得的植株 , 特别是 2n =20 的植株通过染
色体的加倍处理就会获得纯合的二体 , 这对重要基因的保存
以及重要性状的染色体定位均具有重要的意义。
研究表明 ,通过小孢子培养来快速纯合甘蓝型油菜-白
芥的单体异附加系是完全可行的 ,而且这比利用自交或回交
方法进行筛选分离要快得多 ,也为进一步保存和创造种质资
源提供了一条新的途径。目前关于这方面的报道很少。 我
们正在采用不断回交措施 , 以期获得全套甘蓝型油菜-白芥
的单体异附加系 ,至于已导入的白芥这一条染色体的功能如
何 ,我们正采用以分子标记和特定基因原位杂交(FISH)方法
进行确认。
References
[ 1] Liu H-L(刘后利).Origin and evolution of some Brassicas.Acta Agron
Sin(作物学报), 1984 , 109(1):9 18(in Chinese with English
abstract)
[ 2] Liu S-Y(刘胜毅). Illustration of Prevention and Cure of Rapeseed
Diseases(油菜病虫害防治彩图说).Beijing:China Agriculture
Press , 1998(in Chinese)
[ 3] Downey R K.Rapeseed and mustard.In:Fehr W R ed.Principles of
Cultivar Development.New York:Macmillan Publishing Company , 1987.
pp 437 486
[ 4] Wang Y P , Sonntag K , Rudloff E , Chen J M. Intergeneric somatic
hybridization between Brassica napus and Sinapis alba. Integrative J
Plant Biol , 2005 , 47(1):84 91
[ 5] Bodnaryk R P , Lamb R J.Mechanisms of resistance to the flea beet le ,
Phyllotreta cruciferae(Goeze), in yellow mustard seedlings , S inapisalba
L.Can J Plant Sci , 1991, 71:13 20
[ 6] Lelivelt C L C, Leunissen E H M , Frederiks H J , Helsper J P F G ,
Krens , F A.Transfer of resistance to the beet cyst nematode(Heterodera
schachtii Schm.)from Sinapis alba L.(white mustard)to the Brassica
napus L.gene pool by sexual and somatic hybridization. Theor Appl
Genet , 1993, 85:688 696
[ 7] Brown J , Brown A P , Davis J B , Erickson D.Intergeneric hybridization
between Sinapis alba and Brassica napus.Euphytica , 1997 , 93:163
168
[ 8] Hansen L N , Earle E D.Somatic hybrids between Brassica oleracea L.
and Sinapis alba L.with resistance to Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.
Theor Appl Genet , 1997, 94:1078 1085
[ 9] Gong Z-H(巩振辉), HeY-K(何玉科), Wang M(王鸣).Studies on
the resistance of intergeneric hybrids cabbage × white mustard to
Alternaria leaf spot.Acta Hort Sin (园艺学报), 1994, 21(4):401
403
[ 10] Wang Y P , Zhao X X , Sonntag K , Wehling P , Snowdon R J.Behaviour
of Sinapis alba addition chromosomes in a Brassica napus background
revealed by genomic in situ hybridisation.Chromosome Res , 2005 , 13:
819 826
[ 11] Lichter R.Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica
napus.Z Pflanzen Physiol , 1982, 105:427 434
[ 12] Lionneton E , Beuret W, Delaitre C , Ochatt S , Rancillac M.Improved
microspore culture and doubled-haploid plant regeneration in the brown
condiment mustard(Brassica juncea).Plant Cell Rep , 2001 , 20:126
130
[ 13] Zhou Y-M(周永明), Scarth R.Microspore culture of hybrids between
Brassica napus and B.campestris.Acta Bot Sin(植物学报), 1995 ,
37(11):848 855
1766 　　　　作　　物　　学　　报 第 32 卷