全 文 ：3 种芸薹属植物 ＲOH1 基因的克隆及分析
张贺翠，廉小平，柳 菁，李帮秀，周 燕 (西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716)
摘要 ［目的］通过 PCＲ和 ＲT-PCＲ技术从甘蓝、白菜和萝卜中扩增 ＲOH1基因序列，分析该基因的基本特性。［方法］采用生物信息学
的相关方法进行分析。［结果］甘蓝、白菜、萝卜 ＲOH1基因没有内含子，甘蓝 ＲOH1基因编码398个氨基酸，白菜和萝卜 ＲOH1基因均编
码 400个氨基酸，3种植物的 ＲOH1蛋白序列与拟南芥已经公布的 ＲOH1(At1g63930)蛋白氨基酸缺少一段连续的氨基酸序列;ＲOH1属
于 DUF793蛋白超家族，它没有跨膜结构域和信号肽，二级结构主要由 α-螺旋和无规则卷曲构成。同源比对及功能联想分析发现植物
中 ＲOH1非常保守，系统发育分析表明甘蓝、白菜和萝卜的关系最近;结构功能分析发现 ＲOH1可能与 BYPASS蛋白和 AT4G11300蛋白
的功能相似。［结论］为研究 DUF793蛋白超家族功能提供参考。
关键词 ＲOH1基因;基因克隆;DUF793蛋白超家族
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)03 －018 －04
Cloning and Analysis of ＲOH1 from Three Brassica Plants
ZHANG He-cui，LIAN Xiao-ping，LIU Jing et al (College of Agronomy and Biotechnology ，Southwest University ，Chongqing 400716)
Abstract ［Objective］The sequences of ＲOH1 genes were amplified by PCＲ and ＲT － PCＲ from three Brassica plants which are Brassica olera-
cea，Brassica rape and Ｒaphanus sativus． ［Method］Using relevant methods of bioinformatics analyzes． ［Ｒesult］The results indicated that the
gDNA of ＲOH1 was without introns，ＲOH1 gene encodes 398 amino acids in Brassica oleracea when it encodes 400 amino acids in the Brassica
rape and Ｒaphanus sativus． A continuous period of amino acids was deleted from the ＲOH1 in the three plants which were compared to ＲOH1
(At1g63930)in Arabidopsis thaliana;ＲOH1 belonged to DUF793 protein superfamily，and it might not be a transmembrane domain with no a
signal peptide． The secondary structure of ＲOH1 mainly composed of α-helix and random coil constituted． Homologous alignment and function of
the association analysis showed that ＲOH1 was very conservative，and phylogenetic analysis showed that there were closely relationship between
Brassica oleracea，Brassica rape and Ｒaphanus sativus;The structure and function analysis found that ＲOH1 may resemble to BYPASS protein and
AT4G11300 protein ． ［Conclusion］The study provided a reference for the study of function about DUF793 protein super family．
Key words ＲOH1 gene;Gene clone;DUF793 protein super family
基金项目 中央高校基本业务费专项经费(XDJK2013C121)
作者简介 张贺翠(1985 － )，女，河南滑县人，助理实验师，硕士，从事
生物化学与分子生物学方面的研究。
收稿日期 2014-11-25
囊泡分泌和转运过程是真核细胞生命活动的基本事件
之一，是神经信号传导和内分泌激素释放的基础，细胞内大
多数重要的信号蛋白或者膜蛋白需要借助囊泡的转运和分
泌来实现［1］。囊泡转运和分泌过程中，由多亚基组成的 7类
复合物被证明在真核细胞的内膜转运和囊泡拴系过程中发
挥重要作用。其中研究最为活跃和进展最快的是 Exocyst，它
是由 SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70 和
EXO84 8亚单位构成［2］。
Elias等［3］首先从水稻和拟南芥中发现了 EXO70A1，它
是 EXO70家族中的一员。Li 等［4］研究显示 EXO70A1 介导
的膜泡运输参与了导管细胞次生壁的形成，EXO70A1 突变
导致导管运输功能障碍，进而影响拟南芥的生长和育性，
SEC8则和 Exo70、SEC6 形成一个稳定的亚复合体。Ivan
等［5］在拟南芥中发现 EXO70A1 和 SEC8 同时与另一种蛋白
ＲOH1相互作用，ＲOH1突变引起种子中果胶沉积的消失;拟
南芥 ＲOH1(At1g63930)基因没有内含子，编码 415 个氨基
酸，属于一种未知功能的 DUF793 蛋白家族成员之一，
DUF793 家族在拟南芥中至少含有 11 个成员，分别为
At1g01550，At1g18740，At1g22030，At1g43630，At1g74450，
At1g77855，At2g46080，At4g01360，At4g11300，At4g23530;据预
测 ＲOH1与 BYPASS1(At1g01550)基因的结构具有高度相似
性，BYPASS1 与根冠的运输有关，因此 ＲOH1 蛋白可能参与
囊泡转运［6］。但目前对甘蓝、白菜和萝卜 ＲOH1蛋白编码序
列及其蛋白质结构的研究尚未见报道。
笔者以高度自交不亲和甘蓝 E1、白菜和萝卜为材料，利
用 PCＲ 和 ＲT-PCＲ 的方法，首次对甘蓝、白菜和萝卜的
ＲOH1蛋白编码序列进行了克隆与序列分析，进一步了解该
编码序列的结构与功能，并探究 ＲOH1序列及其编码的蛋白
质在甘蓝、和拟南芥中存在的结构和功能差异。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试材料为高度自交不亲和甘蓝 E1、白菜和
萝卜。
1． 2 方法 利用植物基因组 DNA 提取试剂盒(Tiangen，北
京)提取甘蓝叶片 gDNA。各个时期柱头和其他组织 ＲNA的
提取参照 ＲNAprep Pure 植物总 ＲNA 提取试剂盒(Tiangen，
北京)操作说明进行。使各种材料 ＲNA 量相同，以等体积
Oligo dTprimers和 random6 mers 混合物为引物，参照 Prime-
script反转录试剂盒(TakaＲa，日本)操作说明合成 cDNA 第
一条链。反转录完成后，－20 ℃保存备用。
以甘蓝、白菜和萝卜的 gDNA 和 cDNA 为模板扩增
ＲOH1基因，ＲOH1上游引物:CGCAAGTAATCAAGGCTCG，下
游引物:GAAACTTTCCCGGCTTGCTC，反应参数:94 ℃ 4 min;
94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环;72 ℃ 10 min终
止。扩增产物经 1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测后，以 DNA
胶回收试剂盒纯化回收。产物回收后与 T载体连接，将重组
克隆载体导入大肠杆菌感受态 DH5α中，挑取阳性克隆送北
京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1． 3 数据分析 序列分析和系统分析分别采用 VecoterNTI、
MEGA6，在线分析软件分别使用 NCBI、COILS、TMHMM2． 0、
责任编辑 李占东 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(3):18 － 21，46
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.03.007
SignalP、GeneMANIA等。
2 结果与分析
2． 1 ＲOH1基因克隆及进化分析 以甘蓝 E1、白菜、萝卜为
材料，利用 PCＲ及 ＲT-PCＲ扩增产物 ＲOH1，连接 PMD19 － T
载体，送华大基因组测序，结果表明，ＲOH1 的全长 gDNA 序
列与 cDNA序列完全一致，均为 1 197 bp;萝卜和白菜的全长
gDNA序列与 cDNA序列长度均为 1 203 bp，完全等同于 1%
(W/V)琼脂糖凝胶电泳的结果(图 1)。
经测序和比对发现(图 2)，甘蓝中 ＲOH1 编码区序列和
gDNA序列都是由 1 197 bp构成，表明甘蓝中 ＲOH1 没有内
含子，编码 398个氨基酸;萝卜和白菜的核苷酸序列长度均
注:M． Marker，1．甘蓝 gDNA，2．甘蓝 gDNA，3．白菜 gDNA，4．白
菜 gDNA，5．萝卜 gDNA，6．萝卜 cDNA。
图 1 ＲOH1的 cDNA 和 gDNA的 PCＲ产物电泳图谱
注:Bo．甘蓝;Br．白菜;At．拟南芥;Ｒs．萝卜。
图 2 ＲOH1蛋白氨基酸的序列比对
为 1 203 bp，编码 400 个氨基酸。通过 NCBI 下载拟南芥
ＲOH1 基因序列(序列号:At1g63930) ，经 blast 及 VecoterNTI
与已公布的拟南芥 ＲOH1 氨基酸序列比对发现，4 条序列的
相似性达到 87． 6%，说明 ＲOH1基因的保守型很强。甘蓝中
ＲOH1与拟南芥中 ＲOH1 的相似性达到 92%，白菜中 ＲOH1
与拟南芥中 ＲOH1的相似性达到 89． 5%，萝卜中 ＲOH1与拟
南芥中 ＲOH1的相似性达到 90． 2%;甘蓝中 ＲOH1氨基酸序
列比拟南芥中的 ＲOH1 氨基酸序列少 17 个氨基酸残基，其
中甘蓝第56、57位点氨基酸比拟南芥中ＲOH1多2个氨基酸
残基，甘蓝第 299位点氨基酸比拟南芥中 ＲOH1 氨基酸序列
少 1个氨基酸残基，甘蓝中 ＲOH1比拟南芥中少一段连续的
16个氨基酸序列，对应于拟南芥序列第 191 ～ 208 位点氨基
酸残基，序列为 GGGGGNKTTEＲSWSFGＲ。白菜和萝卜第 56
～58位点氨基酸比拟南芥 ＲOH1多 3个氨基酸残基，同样在
对应于拟南芥第 192 ～208位点氨基酸处少一段连续的氨基
酸序列，序列为 GGGGGGNKTTEＲSWSFGＲ。结构域预测发
现，萝卜、甘蓝、白菜和拟南芥中的 ＲOH1 基因与 DUF793 蛋
白质超家族的结构一致性很高(图 3)。
图 3 ＲOH1蛋白结构域预测
进化树可以描述来自于同一祖先的不同植物在进化过
程中的关系，通过构建物种进化树，可以了解某种物种在进
化过程中的地位。依据氨基酸序列构建的分子进化树能较
真实地反映不同物种之间的系统分类学关系和自然演化进
9143 卷 3 期 张贺翠等 种芸薹属植物 ＲOH1 基因的克隆及分析
程，对明确判断物种间的亲缘关系具有一定的参考价值。利
用 MEGE6软件对 DUF793蛋白超家族的多个物种构建进化
树，由图 4可知，在 DUF793家族进化树中，甘蓝、白菜和萝卜
注:Bo． 甘蓝;Br． 白菜;At． 拟南芥;Ｒs． 萝卜;At4g11300 等见
表 1。
图 4 多个物种 DUF793蛋白超家族氨基酸进化树分析
ＲOH1蛋白聚在一起，和油菜、拟南芥聚在一支，说明甘蓝、白
菜和萝卜 ＲOH1蛋白可能与 AT4G11300具有相似的功能。
2． 2 ＲOH1卷曲螺旋及跨膜结构域分析 对 ＲOH1 二级结
构预测发现(表 2)，甘蓝、白菜和萝卜中 ＲOH1 的二级结构
可能存在 α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链，其中 α-螺旋
占整条序列二级结构的比例最高，其次是无规则卷曲，β-转
角和延伸链占的比例非常小，由此可知，ＲOH1的二级结构主
要由 α-螺旋和无规则卷曲构成。
蛋白质卷曲螺旋是一种超二级结构，通常由2 ～7个 α －
螺旋互相缠绕形成麻花状结构，其中 2 个或 4 个 α －螺旋互
相缠绕最为常见，含卷曲螺旋结构的蛋白质是纤维状蛋白质
的主要结构模式，在植物生命体中具有重要意义。通过在线
分析工具 COILS 对甘蓝、白菜和萝卜 ＲOH1 进行预测，结果
见图 5。由图 5 可知，3 个物种的 ＲOH1 在对应于甘蓝氨基
酸 350 ～380处均存在卷曲螺旋结构。
用 TMHMM2． 0预测甘蓝、白菜和萝卜 ＲOH1蛋白无明显
跨膜区(图 6)，蛋白全部位于膜外。用 SignalP分析 ＲOH1的
信号肽，通过不断截短的方式最后发现 ＲOH1没有信号肽。
2． 3 ＲOH1信号路经分析 GeneMANIA可以发现信号途径
或蛋白复合体的新成员，可作为蛋白筛选结果的补充。使用
该工具对 ＲOH1进行检索，结果见图 7。由图 7可知，拟南芥
中发现 ＲOH1与 EXO70 家族的 EXO70A1 和 EXO70E2 相互
作用，数据库中还存在 18种与 ＲOH1蛋白共沉淀、共表达和
具有相同结构域的蛋白。数据库中有 8 种蛋白与 ＲOH1 具
有相同的结构域，这些蛋白均属于DUF793蛋白超家族，大多
数为功能研究较少的蛋白，其中 AT2G46080 和 AT1G22030
编码类 BYPASS 蛋白。AT1G43630、AT1G74450、AT1G01550
与形态发育有关;AT4G23530、AT2G46080、AT1G18740是与
表 1 多个物种的信息
序列号 物种 序列号 物种
XP_007222897． 1 Prunus persica BAF29255． 1 Oryza sativa Japonica Group
XP_004173411． 1 Cucumis sativus Q9LMM6． 1 Arabidopsis thaliana
CBI34385． 3 Vitis vinifera AEE29757． 1 Arabidopsis thaliana
XP_006305065． 1 Capsella rubella At1g77855 Arabidopsis thaliana
XP_006434464． 1 Citrus clementina AT4G23530 Arabidopsis thaliana
KDO86277． 1 Citrus sinensis At4g11300 Arabidopsis thaliana
XP_006413544． 1 Eutrema salsugineum AEE82015． 1 Arabidopsis thaliana
NP_001240854． 1 Glycine max AT2G46080 Arabidopsis thaliana
NP_001144572． 1 Zea mays AT1G74450 Arabidopsis thaliana
AET04440． 1 Medicago truncatula AT1G43630 Arabidopsis thaliana
XP_007160104． 1 Phaseolus vulgaris AT1G22030 Arabidopsis thaliana
XP_008365274． 1 Malus domestica AtＲOH1 Arabidopsis thaliana
EES19085． 1 Sorghum bicolor
表 2 3种不同植物 ＲOH1蛋白二级结构预测结果 %
名称 α-螺旋 延伸链 β-转角 无规则卷曲
BoＲOH1 54． 52 9． 30 4． 77 31． 41
BrＲOH1 60． 75 3． 50 1． 75 34． 00
ＲsＲOH1 60． 00 4． 00 2． 00 34． 00
囊泡运输有关的蛋白;AT1G22030、AT4G11300 是与 Exocyst
有关的蛋白;AT1G74450、AT1G01550是与根系形态发育有关
的蛋白。与进化树分析结果一致。
3 讨论
甘蓝 ＲOH1基因编码 398 个氨基酸，白菜和萝卜 ＲOH1
基因编码 400个氨基酸，均比拟南芥 ＲOH1 少一段连续的氨
基酸序列，可能是物种进化中自然选择造成的，因此这 3 种
植物 ＲOH1在进化上较接近，在 DUF793 进化树中聚在一支
而与拟南芥较远。在对甘蓝、白菜和萝卜 ＲOH1蛋白的二级
结构预测中，发现 3种植物 ＲOH1都没有跨膜结构，ＲOH1可
能主要由 α －螺旋和无规则卷曲构成，存在卷曲螺旋超二级
02 安徽农业科学 2015年
注:绿、蓝、黄线分别表示不同尺寸窗口的预测。
图 5 ＲOH1卷曲螺旋预测 图 6 ＲOH1跨膜结构预测
图 7 ＲOH1蛋白的功能联想数据分析
结构［7］，预测有一定的准确度且 ＲOH1蛋白的氨基酸序列的
疏水性不是很强，可能预测不出来。信号肽是新合成多肽链
中用于指导蛋白质跨膜转移的 N －末端的氨基酸序列，一般
由 16 ～26 个氨基酸组成，包括一个带正电荷的 N －末端，一
个中间疏水序列和一个较长的带负电荷的 C －末端，通过不
断截短的方式预测发现 ＲOH1蛋白没有信号肽。
ＲOH1是 Ivan等利用酵母双杂交、定点突变等技术从拟
南芥中筛选出来的蛋白，它与 Exocyst复合体中的 EXO70A1、
EXO70E2和 SEC8相互作用，通过与 EXO70家族基因之间的
共调控表明 ＲOH1 和 Exocyst 复合体之间存在某种联系;据
Ivan推测 ＲOH1的突变可以引起种皮果胶的沉积，破坏了种
皮的正常功能，因此 ＲOH1 可能是分泌的负调节因子。
ＲOH1属于 DUF793蛋白超家族，通过 GeneMANIA 预测发现
与 ＲOH1有共同结构域的 8 种蛋白质均属于 DUF793 家族，
其中 5种蛋白与分泌和囊泡运输有关;Van 等［8］研究发现
ＲOH1与 BYPASS1(At1g01550)基因的结构具有高度相似
性，BYPASS1与根冠的运输有关;Kang等［9］推测 BYPASS及
其同源基因在不同物种和不同组织中具有不同的生物学功
能;其他研究结果也表明 BYPASS可能广泛参与了各种生理
活动［9 －10］。刘豫东等［11］从甘蓝的柱头内扩增出 BYPASS 基
因，据推测 BYPASS蛋白可能参与了甘蓝的生殖发育过程;
AT2G46080和 AT1G22030 编码类 BYPASS 蛋白与 ＲOH1 蛋
白具有相同的结构域，因此 ＲOH1蛋白也可能与根冠运输和
生殖发育有关。进化分析发现甘蓝、萝卜、白菜 ＲOH1 蛋白
可能与 DUF793蛋白超家族的 AT4G11300蛋白功能相似［12］，
AT4G11300蛋白与 Exocyst相关(raghvendra)，与 Ivan等发现
的 ＲOH1 和 Exocyst 复合体之间存在某种联系这个观点一
致，同时说明 DUF793蛋白家族可能具有抑制分泌的功能。
应用生物信息学的方法对 ＲOH1 的结构和功能进行预
测和分析，有利于利用试验的手段研究植物 ＲOH1 的分子生
物学性质和理化性质，对物种间 ＲOH1家族的亲缘关系和遗
传相似性的分析，对新 ＲOH1基因的发现和研究有较大的帮
助［13］。Ivan 等在拟南芥中发现 ＲOH1 蛋白与 EXO70A1、
EXO70E2和 SEC8 相互作用，甘蓝、白菜、萝卜 ＲOH1蛋白比
拟南芥 ＲOH1蛋白少一段连续的氨基酸序列，因此甘蓝、白
菜、萝卜 ＲOH1 与 Exocyst 复合体亚基是否存在相互作用，
ＲOH1是否与分泌和囊泡运输有关，ＲOH1 是否与生殖发育
(下转第 46页)
1243 卷 3 期 张贺翠等 种芸薹属植物 ＲOH1 基因的克隆及分析
的变化，在植株形态特征上也有一些变化，如叶片增多、茎秆
增多或叶片变小，合理利用这些变化，可以培养出更加优良
的品种。
4． 3 新药物的产生 药用植物诱导的毛状根培养体系内的
酶系统较为复杂，可以发生多种生物反应，如糖基化、葡糖
化、甲基化、羟基化、乙酰化、氢化、氧化还原、水解及异构化
和酯化等。在向培养体系加入不同的底物，经过多种生物反
应最终获得的天然活性化合物或活性更好或产量更高或毒
性更小。目前已经有多种药用植物毛状根培养体系被深入
研究，药用植物毛状根生物转化体系为新的安全可靠药物提
供了可能。
早在 20 世纪 90 年代初，人参毛状根培养体系就被研
究，在人参毛状根培养体系中将毛地黄毒苷配基作为底物，
结果获得了 5种酯化产物以及 6种糖苷化产物［17］。此后，对
于人参毛状根生物转化作用的逐渐深入研究发现，在该体系
中，间羟基苯甲酸通过糖苷化、酯化反应转化产生一种新的
化合物间羟基苯甲酸 β － D －吡喃木糖(1 － 6)－ β － D －吡
喃葡萄糖酯。进入 21 世纪以后，何首乌的研究越来越多。
严春艳等［18］在何首乌毛状根培养体系投入 8 种底物研究发
现，底物中的对苯二酚转化成熊果苷，青蒿素转化获得 2 种
物质，而呋喃橐吾酮转化形成了 2 种新的化合物，证明何首
乌毛状根生物体系中有多种生物酶系统存在。
4． 4 药物蛋白生产 药用植物诱导的毛状根是通过有丝分
裂和细胞分裂稳定遗传，靶基因表达产物大量且稳定均一。
将药用植物毛状根应用于药物蛋白生产，将成为继转基因植
物和微生物发酵法获得药物蛋白之后一种生产药物蛋白的
重要新方法。近些年，已经有很多植物毛状根培养体系可以
成功生产药物蛋白和功能蛋白，如白细胞介素 －12在烟草毛
状根细胞中稳定表达，红花毛状根稳定表达生产胰岛素等。
5 问题及展望
将毛状根培养技术应用于药用植物的研究时间较短，还
存在许多问题。如许多药用植物难诱导出或不能诱导出毛
状根;有些药用植物的毛状根生长缓慢，甚至出现不能正常
生长;药用植物毛状根在各个领域的应用研究还不够成熟，
还不能进行大规模投入生产等。针对于这些问题，还需要不
断深入的探究。随着对药用植物毛状根诱导中发根农杆菌
的作用机理、各种理化因素的影响规律及次生代谢产物合成
机制的深入研究，会挖掘出发根培养技术的巨大潜力，使之
成为解决药用植物众多问题的重要途径。
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78 －81．
(上接第 21页)
有关，这些都是下一步研究的内容，以期为研究DUF793蛋白
超家族功能提供参考。
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64 安徽农业科学 2015 年