全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Ag r. Sci. ), 2005, 21(4):369～ 373
兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分析
谢　伟 1 , 　乐超银 1 , 　林　直2 , 　程　凡 3 , 　何正权1 , 　姚　伟 1
(1. 三峡大学生物技术研究中心 ,湖北 宜昌 443002;2.三峡大学图书馆 ,湖北 宜昌 443002;3.三峡大学化学与生命科学
学院 , 湖北 宜昌 443002)
收稿日期:2005-04-01
基金项目:宜昌市科技发展计划项目(A04401-8)
作者简介:谢　伟 (1981-), 男 ,湖北武汉人 ,硕士研究生, 主要从事
分子药理学研究。
通讯作者:乐超银 , (E-m ail) fengyuzhexw@ yahoo. com. cn;(Tel)0717-
6397188;(Fax)0717-6397188
　　摘要:　用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术 , 对兰属 7个种的 9个品种进行遗传多样性和亲缘关系分析。从
60个随机引物中 , 筛选出 6个对 9个供试兰花品种均能产生多态性谱带的引物 。在这 6个引物所检测的 64个位
点中 , 61个位点为多态性位点 , 占总位点数的 95. 3%。聚类分析结果表明 , 不同兰花品种之间存在明显的遗传差
异 , 而且根据 RAPD标记进行的兰花品种聚类结果与传统的形态学分类结果基本一致 , 只是莲瓣兰与建兰组的分
类地位有一些差异。
关键词:　兰属;RAPD分析;相似性系数;聚类分析
中图分类号:　S682. 31　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2005)04-0369-05
Genetic Relationship Analysis ofCymbidium CultivarsU sing RAPD
XIE We i
1 , 　YUE Chao-y in1 , 　LIN Zhi2 , 　CHENG Fan3 , 　HE Zheng-quan1 , 　YAO Wei1
(1.B iotechnology R esearch Center, Th ree Gorg e Un iversity, Y ichang 443002, Ch ina; 2.L ibrary , Three Gorge Un iversity , Y ichang 443002, Ch ina;
3.Chem istry and Life Science Co llege, Three Gorge Un iversity , Y ichang 443002, China)
　　Abstract:　N ine cu ltivars from 7Cymbidium species we re used to ana ly se the gene tic po lymo rph ism and re lationships
among the cu ltiva rs by RAPD techuique. S ix RAPD prim ers, which we re se lec ted from 60 random prim ers, produced 64
bands, o f which 61(95.3%) bands w ere po lym orphic. The resu lt of c luste r ana ly sis showed tha t there we re obv ious diffe r-
ence s am ong d iffe rent cu ltiva rs, and that the clustering re su lt wa s in ag reem entw ith tha t obta ined accord ing tom o rphologi-
ca l classification but tha t the re w ere som e differences in the taxonom ic sta tus o fC. lianpan and C. ensifolium be tw een the
two c lassifica tion m e thods.
K ey words:　Cym bidium;RAPD analy sis; sim ilarity coe fficient; cluste r analy sis
　　兰花是中国常见的家庭盆栽花卉和园艺花卉 。
中国人传统上所说的兰花 , 大都是指兰科兰属
(Cymbid ium )中的地生兰类植物 , 主要是指春兰
[Cymbid ium goeringii (Rchb. .f ) Rchb. .f ] 、蕙兰
(Cymbid ium faberi Ro lfe)、建兰 [ Cymbidium ensifoli-
um (L. )SW. ] 、墨兰 [Cymbidium sinense(Jackson ex
Andr. )W illd. ]和寒兰 (Cymbidium kanran Mak ino)
等 5大类[ 1, 2] 。中国兰花有着极高的观赏价值和经
济价值 ,一直深受人们的喜爱。由于各种变种以及
自然杂交种的存在 ,仅凭植株的形态特征进行兰花
种质鉴定较为困难 ,这对兰花品种的整理和研究产
生了不利影响 。有关利用现代分子标记技术研究兰
属植物分类及种质资源研究的报道较少。 RAPD分
子标记技术是 W illams等 [ 3]在 1990年发展起来的
一种新型遗传标记 。尽管 RAPD技术诞生时间比较
短 ,但由于其独到的检测 DNA多态性的方式以及快
速 、简便的特点 ,该技术已经广泛地用于农作物 、果
树及园艺植物的分析研究 。在小麦 、水稻 、玉米 、大
豆 、葡萄 、苹果 、花生等多种植物上 ,大多研究结果表
明 , RAPD的分类结果与经典形态分类结果具有良
好的一致性[ 4] 。
本研究选取春兰 、春剑 、蕙兰 、建兰 、墨兰 、寒兰
369
和莲瓣兰等 9个兰花品种作为试验材料 , 利用
RAPD技术从分子水平上研究我国传统兰花品种的
遗传变异和亲缘关系 ,以期为兰花育种 、品种鉴定及
其品种权保护提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　试验材料
　　供试的 9个兰花品种均来自湖北宜昌兰花种植
园 ,品种名称及编号见表 1,供提取总 DNA的试材
均为各兰花品种植株幼叶。 PCR扩增均采用 Ope r-
on公司生产的 BA系列 10 bp随机引物 , Taq酶由美
国 Promega公司生产 。
1.2　方法
1.2.1　兰花总 DNA提取　采用 CTAB法 [ 5]分别提
取 9个兰花品种的总 DNA ,用 24∶1的氯仿-异戊醇
抽提 1 ～ 2次 ,用异丙醇沉淀 ,最后溶于 0.1 ×TE
中 。经调整浓度后用于 PCR扩增。
表 1　供试兰花品种及编号
Table 1　Codes for 9Cymb id iums
编号
C ode
品种名 Cu ltivars 种名 Species
1 豆瓣 Douban 春兰 C. goering ii (Rchb. F. )
Rchb. F.
2 朵香 Duoxiang 蕙兰 C. faberi Rolfe
3 野生蕙兰 C. faberi Rolfe 春剑 C. long ibractea tum
4 通海春剑 C. longibractea tum
var. tonghaien se
建兰 C. ensifo lium (L. )SW.
5 小桃红 Xiaotaohong -
6 野 生 建 兰 C. en sifolium
(L. )SW.
-
7 野生寒兰 C. kan ranM ak ino 寒兰 C. kanran M ak ino
8 白墨 Baimo 墨兰 C. sinense(Jackson exAn-
dr. )W illd
9 小雪素 X iaoxuesu 莲 瓣 兰 C. lianpan Tang
etW ang
1.2.2　PCR扩增 　扩增反应在 M J公司生产的
PTC-220型 PCR仪上进行 , 25 μl的 PCR反应体系
中包含 0.2mmo l /L dNTP、 2.6 mmo l /L M gC l2 、 2U
Taq酶 、200 ng模板 DNA。反应程序为首先 94 ℃预
变性 5 m in, 然后进行 40个循环 (每个循环包括
94 ℃变性 1 m in、 36 ℃退火 1 m in、 72 ℃延伸
2 m in),最后 72℃延伸 6 m in。反应结束后 ,在反
应体系中加入 10μl上样缓冲液 (含 40%蔗糖和
0.25%溴酚蓝 ), 在 1.5%琼脂糖凝胶中电泳
(5 V /cm),溴化乙锭染色 ,在紫外灯下观测结果 ,在
B io-RAD公司生产的凝胶成像分析系统中进行照
相 ,并记录电泳结果 。
1.2.3　数据分析　应用 V ilber lourmat公司的凝胶
成像系统 B ioID ++图像分析软件对 9个兰花品种
DNA样品 PCR扩增条带总数与多态性条带数目进
行统计。首先对图像条带进行自动扫描 ,再手检去
除因凝胶亮点 、加样孔 、条带粘连等引起的计算机误
检。扩增条带按有或无分别记录为 1或 0。每条扩
增带以所用引物名称及片段大小命名 ,如 S1-500表
示引物 S1扩增出的长度为 500 bp的扩增带 ,片段
大小用 DNA M arker粗略推算。每一试验均重复 2
次 ,对于多态位点 ,仅在重复试验中能稳定出现的差
异带用于数据分析 。根据 N ei[ 6]和刑荣莲等 [ 7]的方
法计算兰花品种间的简单遗传相似系系数 ,即 F =
2×N xy /(Nx +N y),其中 , N x、Ny 分别为两个品种各
自的扩增条带总数;N xy为两个品种共有的扩增条带
数。采用 NTSYS PC软件 ,计算遗传距离 。按照吴
燕民等的方法 [ 8]构建树状图。
2　结 果
2.1　兰属 9个品种 DNA多态性
　　用 60个 10 bp随机引物 , 对春剑的总 DNA样品
进行扩增 ,得到 18个具有多态性并且扩增谱带数多
且清楚的引物 ,其中 6个引物对供试的 9个兰花品
种都能产生多态性扩增谱带 (图 1 ～图 6)。这 6个
引物对 9个兰花 DNA样品共扩增出 64条带 ,每个
引物扩增条带数为 8 ～ 16条 ,平均为 10条 。在这
64条谱带中具有品种间多态性的扩增带有 61条 ,
占总扩增带数的 95.3%(表 2),扩增片段长度大都
表 2　不同引物扩增 9个兰花品种 DNA样品的片段数
Tab le 2　DNA fragm ents ampl ified w ith d ifferent prim ers in 9 Cym-
bid ium cultivars
引　物
Prim er
序　列(5′→ 3′)
Sequ ence(5′→ 3′)
扩增片段数
No. of
am p lified b ands
多态性片段数
No. of
polym orph ic b ands
B-06 TGCTCTGCCC 9 8
B-12 CCTTGACGCA 9 9
B-17 AGGGAACGAG 16 14
A-07 GAAACGGGTG 9 9
A-15 TTCCGAACCC 12 12
A-20 GTTGCGATCC 9 9
370 江 苏 农 业 学 报 　2005年 第 21 卷 第 4期
1:豆瓣;2:朵香;3:野生蕙兰;4:通海春剑;5:小桃红;6:野生
建兰;7:野生寒兰;8:白墨;9:小雪素。
1:Douban;2:Duox iang;3:C. faberi Rolgte;4:C. long ibracteatum
var. tongha ien se;5:X iaotaohong;6:C. en sifolium (L. ) SW. ;7:C.
kan ranM ak ino;8:Baimo;9:X iaoxuesu.
图 1　引物 B-06对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 1　RAPD po lymorphism ofCymb id ium cultivars using prim-
er B-06
图注见图 1注。 For notes, see Fig. 1.
图 2　引物 B-12对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 2　RAPD po lymorphism ofCymb id ium cultivars using prim-
er B-12
在 100 bp ～ 2 000 bp之间 。 RAPD试验结果显示 ,兰
属内的 9个品种表现了丰富的 DNA多态性 。由此
可见 ,利用上述 6个引物均可从分子水平上检测出
兰属不同品种间的遗传差异 ,也表明 RAPD是进行
兰花品种分类研究的一种较为理想的方法 。
2.2　兰属 9个品种 DNA指纹的聚类分析
　　从相似系数聚阵 (表 3)和聚类树状图 (图 7)可
以看出 ,供试兰花品种可明显地划分为两类。第 1
类包括春兰 、春剑和蕙兰 ,其中春兰中的豆瓣和朵香
在 0.79聚为一类 ,春兰和春剑在 0.72处聚为一类;
图注见图 1注。 For notes, see F ig. 1.
图 3　引物 B-17对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 3　RAPD polym orphism o fCymb id ium cultivarsus ing prim-
er B-17
图注见图 1注。 For notes, see F ig. 1.
图 4　引物 A-07对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 4　RAPD polym orphism o fCymb id ium cultivarsus ing prim-
er A-07
图注见图 1注。 For notes, see F ig. 1.
图 5　引物 A-15对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 5　RAPD polym orphism o fCymb id ium cultivarsus ing prim-
er A-15.
371谢　伟等:兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分析
第 2类包括建兰 、寒兰 、墨兰和莲瓣兰 ,其中小桃红
与野生建兰在 0.75处聚为一类 , 寒兰和白墨在
0.68处聚为一类 。聚类结果与传统的形态学分类
结果基本一致。
图注见图 1注。 For notes, see Fig. 1.
图 6　引物 A-20对兰花不同品种的扩增结果
F ig. 6　RAPD po lymorphism ofCymb id ium cultivars using prim-
er A-20
图注见图 1注。 For note, see Fig. 1.
图 7　兰属 9个品种的聚类分析图
F ig. 7　D endrogram by cluster analysis for 9 Cymb id ium cu lti-
vars
表 3　9个兰花品种的 RAPD相似系数矩阵
Table 3　M atrix of s im ilarity coefficient am ong 9 Cymb id ium cultivars calcula ted according to RAPD
品种编号 1)
Cu ltivar code1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 1. 00
2 0. 77 1. 00
3 0. 67 0. 67 1. 00
4 0. 71 0. 68 0. 62 1.00
5 0. 69 0. 66 0. 71 0.62 1. 00
6 0. 68 0. 53 0. 57 0.57 0. 75 1. 00
7 0. 60 0. 57 0. 70 0.70 0. 68 0. 63 1. 00
8 0. 61 0. 64 0. 61 0.70 0. 65 0. 60 0. 70 1. 00
9 0. 58 0. 65 0. 49 0.58 0. 69 0. 68 0. 60 0. 68 1. 00
1)见图 1注。 1) see the note of F ig. 1.
3　讨 论
　　兰属植物的分类主要依据形态学特征 。云南莲
瓣兰在形态上接近春剑 ,因而孙彩云等认为莲瓣兰
属于春兰的一个品种 [ 9] ;Zhang等报道的 ITS系统
发育树表明 ,莲瓣兰先与春兰聚合 ,后与沙叶兰 、蕙
兰 、落叶兰聚合 ,再与寒兰 、墨兰 、建兰聚合[ 10] ;陈心
启等也认为莲瓣兰属春兰的一个变种 [ 1] 。而本试
验的结果表明 ,莲瓣兰与春兰 、建兰 、墨兰 、寒兰是平
行关系 ,这与梁红健等的研究结果[ 11]相符。
吴应祥认为春剑和春兰是平行关系 [ 12] ,而陈心
启等认为春剑是春兰的一个变种 [ 1, 2] ,叶庆生等[ 13] 、
文李等[ 14]也利用同工酶技术证明春剑和春兰的关
系较之与蕙兰 、寒兰 、墨兰 、建兰近。本试验结果支
持春剑为春兰的一个变种 ,而与兰属其他品种并不
是并列关系的观点 。
形态学分类学家德国学者 Sh lecher以及英国学
者 Puy和 C ribb将建兰 、寒兰 、墨兰划为建兰组 ,将
春兰 、蕙兰归于春兰组 。吴应祥将春兰 、蕙兰 、寒兰
划为春兰组 ,将建兰 、墨兰划为建兰组 [ 12] 。本试验
结果表明蕙兰与春兰之间的遗传关系较近 ,而建兰 、
寒兰 、墨兰 、莲瓣兰之间的遗传关系较近 ,这与传统
372 江 苏 农 业 学 报 　2005年 第 21 卷 第 4期
形态学分类结果基本一致 。
传统分类主要是以形态特征为依据。 RAPD分
析则是通过多个不同引物给出覆盖整个基因组的多
态性信息 ,因此 ,两种分类系统的分类结果不一定完
全吻合 。本研究结果显示 ,莲瓣兰与建兰组的分类
地位与传统分类结果不尽一致 。
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373谢　伟等:兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分析