全 文 ：园 艺 学 报 2) 0 (8, 35 ( l ) : 8 1 一 86
今e t a H o币 e u j t u ar e s万n 矛( a
中国兰属植物菌根真菌的 A F L P 多样性分析
李潞滨 胡 陶’ , 杨 凯 2 ` , 唐 征 2 , 庄彩云 ’ , 刘振静 彭镇华
(
’ 中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育实验室 , 北京 100 91 ; 2 北京农学院农业应用新技术北京市重
点实验室 , 北京 1022 06 )
摘 要 : 对 19 株分离自不同地理分布和生态型的中国兰属植物菌根共生丝核菌进行了 AF L P 分析 , 12
对引物组合共扩增出 1 869 条带 , 其中 1 0 16 条具有多态性 , 平均多态性比率达 54 . 4 % 。 A FL P 分析结果采
用 UP G M A 聚类 , 19 株菌的相似系数在 0 . 6 1 一 0 . 89 之间 ; 聚类关系显示兰花地理分布 、 所属种和生态类型
是影响中国兰属植物菌根真菌多样性及其与兰花间专一性关系的关键性因素 地生型的春兰和云南的附生
兰与其共生菌根真菌之间有着较严格的专一性关系。
关键词 : 兰属 ; 菌根真菌 ; A F L;P 多样性
中图分类号 : 5 682 . 3 1 文献标识码 : A 文章编号 : 05 13 一3 53 X ( 20 08 ) 0 1一0 8 1一 6
A F L P D i v e r s i t y i n t h e M y c o
r r h i z a l F u n g i o f 仰m b诚u m P l a n t s
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A b s t r a c t : A m p l i if e d fr a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ( A F LP ) w
a s u s e d *0 s t u d y th e d iv e r s i ty o f 19 er p er
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.
A h i gh d e g r e e o f d i v e r s i t y w a s fo u n d a m o n g
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1 8 6 9 b a n d s w e r e g
o t b y u s i n g 12 p a i r s o f A FLP p r im e r s
, a n d a m o n g th e m
1 0 16 b a n d s w e r e p o l ym o印h i sm , th e m e a n p e r e e n t a g e o f p o l y m o印h i s m w a s 5 4 . 4% , w h ie h i n d i e a t e d t h a t
A FL P w a s a g r e a t ly e if e i e n t m e t h o d t o s t u d y t li e d i v e r s i t y o f m y e o r h i z a e o f C h i n e s e o r e h id s (叹” 刀 6id i u m ) .
Th e A FL P r e s u lt s w e r e a n a ly z e d fo r s im i la r i t y a n l o n g s tr a i n s v i a u n w e i gh te d p a i r
一
g or u p m e a n s e l u s t e r a n al y s is
,
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e o r h i z a l s t r a i n s s h o w e d 3 e ur e i a l af e t o r s
,
th e d i s t r ib u t e d e n v i r o 一i n l e n t s
, o cr h id s s p e e i e s a n d e e o l o g i e r yP e o f
o cr h id s
,
w h i e h a fl 诀e t e d th e d i v e r s i ty o f C h i n e s e o cr h id s ( 价m b id i u m ) s y m b i o t i e m y e o r h i z a e a n d th e
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一
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A n d t he t e r e s r r i a l o cr h id s b e l o n g to yC m bid i
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.
K e y w o dr s
: 即几 bid i u m ; m y e o hr i z a l fu n g i ; AF L P ; d i v e r s i t y
兰科 ( O r hc id ac ea e ) 是被子植物最大科之一 , 全世界约有 70 属 20 00 多种及大量的变种 , 是
重要的观赏花卉和药用植物 , 依其所属生态类型可分为地生兰 、 附生兰和腐生兰 3 类 (罗毅波 等 ,
2 0 0 3 )
。
收稿日期 : 2X() 7 一 0 8 一 15 ; 修回 日期 : 20 0 7 一 0 9 一 2 9
基金项 目 : ` 9 48 ’ 项目 ( 2 0 4并 一26 ; 2 0 5 4 一37 )
通讯作者 A t , tho r fo r o o er s p o n d e n e e ( E 一 ,。 a i l : y a n g k a s8 9 7 8@ 12 6 . 〔。 , 11
2 8园 艺 学 报3 5卷
自然生长状态下 兰科植物必须依赖于真菌建立 共生关系才能完成正 常生命活动( 吴应祥 ,
19 3 )
。 自 184 0 年 iL nk 首先发现兰科植物根内有内生真菌 ( R e s劝ek , 1847 ) 以来 , 国内外研究者通
过探讨兰科菌根真菌与兰科植物间的关系 ( Tay lor et al . , 2 004 ; 颜容 , 2 005 ) , 已逐渐认识到兰科菌
根 ( or c hi d m y o r hi z ae ) 对于兰科植物正常生长发育的重要意义 。 现已普遍认同可与兰科植物形成共
生菌根结构的内生真菌以无性半知菌范畴的广义丝核菌属真菌为主 , 但用形态学方法对广义丝核菌属
真菌作进一步细化分属和鉴定有较大的局限性 。 近年国外文献中有越来越多关于分子标记技术运用于
兰科菌根真菌鉴定方面的报道 ( M a e r a l . , 2 0 0 3 ; P e r e i r a e t a l . , 2 00 5 a , 2 0 0 5 1) ) , 诸多分子标记技术的
成功应用表明了在兰科植物菌根真菌研究中广泛采用分子生物学技术手段的可行性和必然趋势 , 然而
对于我国特有并广泛分布的地生兰 属植物的共生菌根真菌却缺乏 此方面的研究报道 ( 李潞滨 ,
19 9 8 )
。
本研究中利用 A FI 尹 技术对 19 株分离自 7 种不同地理分布和生态型的中国兰属植物共生丝核菌
进行了多样性分析 , 在 A FL P 聚类分析基础上对中国兰属植物与菌根真菌间的专一性进行了初步探
讨 , 并尝试将 A FL P 技术应用于兰属植物菌根真菌的研究 , 以期为更广泛深人地采用分子生物学技术
手段推动此方面的研究打下基础 。
1 材料与方法
1
.
1 供试菌体材料
中国兰属植物共生菌根真菌菌株共 19 株 , 于 20 05 年由中国林业科学研究院林业研究所国家林业
局林木培育实验室李潞滨 、 胡陶分离自 7 种兰属植物 , 经形态学鉴定属于广义兰科共生丝核菌 ( Or -
c
ih( l Rh七co ot in a) 的瘤菌根菌 (助 ul o hr 七a) 。 分离兰花材料 、 产地及分离菌株编号见表 1。
表 1 A FL P 分析供试兰属植物及菌根真菌
1
’
a b le 1 I i s t o f cy m b诚 u m m y e o r r h i z a e fo r A F L P a n a ly si s
编号 态类型
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分离菌株
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墨桃 一 C阴6 M` , t a o 一 C印 6
墨桃 一 C印9 M o t a o 一 C以 )9
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湖 l 一 C G0 8 I{ L, l一 C ( ; 0 8
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0 3 一 0 2
0 3 一 0 2
0 4 一 2 6
0 5 一 16
0 5 一 16
0 5 一 17
0 5 一 16
0 8 一 19
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地生 兰 r卜 l(T 、 lr 川 ` )t( · ilI d
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附生 兰 A〔I ; l a , 、 。 ,1 1 《 , r。 ·!1 101
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附 ’上兰 A`I n a s 。二e r、 一` , r《注l id
附生 协 A山 l a 、 (` e rl t t〕 r〔` 11 10 1
附生兰 Ao l ,l a 。。 e ,1 1 ( ) r( 咔l id
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多花兰 C . 刀` , r汤u n袱,, n ,
多花兰 C . ljt )rI 加耐 “ nI
产地
P ()r f {一l (一 119 a r e 比
四川江津 J i a , ,剐 i n , 5 1。、 .川 :川
四川下11津 J l : l ,飞周川 , 5 1` : 11 : 、川
四川江津 J l a n幻 in , 5 1(」1 ,川 , 1
四川 7 1一津 J i a , 1从! i ,1 , 5 1( 11 t ,: l r ,
四川手l一津 Ji a : 1幻111 , 5 1。、 }1 ,, a : 1
四川爹I:津 J l a n幻 , n , 5 1《 ,11 L」a : 1
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湖北 罗 I[] I」 , , . , l ,;川 , H L; l ,。· i
湖北英一l一、 i , 1。 、 h a ,1 , 卜一L: r) 。 .
湖北英 一l一Y i , 19引l a 。 . H、』一》全:
河南确山 Qu e月 l a , 1 , H 。 ,、 a ,1
河南确 11] Qt: 。 、 一l a , 1 , r l。 :l a ,1
河南确 一l一Q,: 。 、 11、 , r: , 卜I。 , 1:川
石南保山 B a 。、 、于l a n , Y l : ,1 : l a 。
云 南保 x ll B a ` , ; h a fl , Y 、 : ,川 a n
云南保 一lj B:川、 I: : I n , 、 、 , , 1 , l a ,1
云一有腾冲 T。 : 19 、 110 ,19 , 丫 ,川 rl a n
云南腾冲 T。 ,1 ; 。」10 ,19 , 丫 ,. n ,l a n
云南腾冲 T e l l g e l l o n g , Y ,」: 1 : l a n
1
.
2 菌根真菌 D N A 的提取
取约 0 . 2 9 菌丝体或刮取分离菌株的一个 PD A 斜面 , 加 人 1 m L 裂解缓冲液 ( rT i s 一H CI 10 0
l期 李潞滨等 :中国兰属植物菌根真菌的A F I尹多样性分析 3 8
m m o l
·
L
一 ’ , pH 5
.
0 ; EDT A 5 0 m m o l
·
L
一 ` , p H 8
.
0 ; N a C I 1
.
4 nr o l
·
L
一 ’ : SD S Z% ) 充分研磨 , 6 5 ℃
水浴 一 h , 12 0 0 0 : · m i n 一 ’离心 5 m i n ; 取上清液加入等体积苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 ( 2 5 : 24 : l ) , 轻摇 5
im
n , 12 0 0
:
·
im n
一 ’离心 10 m in ; 收集上清液 , 2 倍以上无水乙醇沉淀 D N A , 70 % 乙醇洗涤后晾干 ;
D N A溶于 T E ( T r i s 一 H e l 10 m m o l · L 一 ’ , E DT A 1 m m o l · L 一 ’ , pH 8 . 0 ) 。 分光光度计检测 D N A 浓度 ,
一
20 ℃保存 , 备用 。
1
.
3 A F L P 凝胶电泳
AF L P 分析参照 V o , 等 ( 1995 ) 的方法 , 采用 cE 0 R I 和 Ms 。 I 两种限制性内切酶 , 37 ℃酶切 3 h ,
16 ℃连接 1 . 5 一 3 h 。 选择性扩增时 D N A 模板稀释 20 倍 。 A F LP 预扩增采用 E o / M o 引物组合 , 选择
性扩增采用 ( E + 3 ) (/ M + 3) 引物组合 , 其中 E 和 M 分别表示 cE o R I 和 sM o l 引物的共同序列 , E
的共同序列为 5 ’ 一G A C TG C G TA C CA AT C一 3 ` , M 的共同序列为 5 ` 一 GAT G AG T C C T G A GT A A 一3 ` , 引
物序列和组合见表 2 。
选择扩增产物 5% 聚丙烯酞胺变性胶电泳 , 95 W 恒功率电泳约 Z h , 电泳结束后 , 银染检测 , 干
胶后拍照 。
1
.
4 数据处理
采用生物学统计软件 N T SY ScP 2 . 10 e 进行分析 。 以 “ 0 ” 和 “ 1 ” 的方式记录电泳结果图版中条
带位置 , 有条带赋值 “ l ” , 无条带赋值 “ 0 ” , 数据录人 N T ed it 1. 2 后获得数据文件 , 以 Jac ca 记 遗传
相似系数为基础 , 采用 U PG M A 对数据进行聚类分析 ( 王世伟 等 , 20 03 ) 。 多态性比率 ( % ) 二
(多态性 A FL P条带数 / 总 A FL P条带数 ) x 10 。
2 结果与分析
2
.
1 兰属植物菌根真菌的 A F L P 多样性检测结果及分析
随机选取 12 对 A FL P 引物组合 , 对 19 个菌株材料进行 A F LP 分析 , 所用引物组合及扩增结果见
表 2 , 部分引物组合扩增结果见图 l 。
中国兰属植物菌根真菌的 A FL P 分析共扩增出 1 869 条带 , 其中 1 01 6 条带具有多态性 , 总平均
多态性比率达 54 . 4% ; 每对引物组合平均检出多样性条带为 84 条 , 多态性比率在 4 2 . 4 % 一 69 . 4% 之
间 (表 2 ) , 表明中国兰属植物菌根的共生菌根真菌具有较高的多样性 , 同时也表明 AF LP 技术在检
测兰属植物菌根真菌多样性方面有着较高的效率 。
表 2 A F L P 分析所用引物组合及扩增结果统计
T a b le 2 5妞 ist it cs Of P ir m e r co m b ian t io n s a n d am P l i 6 ed r es u lst o f A F L P a n 日y is s
引物组合
P ir m e r
M
一
A G A / E
一
A〔二A
M
一
CA A/ E
一
C I
,
r
M
一
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一
C 】, 】,
M
一
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一
G C A
M
一
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一
C A G
M
一
CA A / E
一
G C A
M
一
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一
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r
r
M
一
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一
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『
r
M
一
CT A / E
一
CTC
M
一
A G G / E
一
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M
一
CT G / E
一
C T G
M
一
G CG / E
一
C r l
,
总计 T o t a l
总扩增条带
T o t a l a n 一p li fi e d b a 一d
多态性扩增条带
P
o
ly l” o rP h i c ba n 〔 l
4 2
5 5
3 8
6 4
5 4
10 9
9 2
10 7
7 9
】2 3
124
129
1 0 16
多态性比率/ %
R a t i o o f P o ly m o rp h i (
{
ban d s
4 2
.
4
4 4
.
4
4 2
.
7
3 8
.
1
6 3
.
5
6 9
.
4
6 5
.
7
6 3
.
7
6 8
.
1
5 3
.
7
5 1
.
5
5 1
.
0
5 4
.
4
9124868557093
84 园 艺 学 报 飞5 卷
图 1 菌根真菌 A F L P扩增图谱
l一 19
. 分离菌株编号
F ig
.
1 M y e o r rh i z a l uf n g u s A F L P P r o n le s
l一 19
.
C o d咬
·
o f 121、 〔” n l l iz a l {一 19一1 5 .
2
.
2 兰属植物菌根真菌 A FI J, 聚类结果及分析
利用 N TS YS cP 2 . 10e 软件对 A FL P数据进行分析 , 得到兰属植物 19 株菌根真菌菌株间的 A IF J P 聚
类图 (图 2)
相似系数 ( · 0 0 1卜。 , e n t
图 2 兰属植物菌根真菌 A F L P聚类图
F i g
.
2 D e n d r o g r a m o f yC m b诚 u m m y e o r r h i z a e b as e d o n A F I· P d a at
l期 李潞滨等 :中国兰属植物菌根真菌的 A F L P多样性分析
由 A F L P聚类图可见 , 19 株菌的相似系数在 0 . 61 一 0 . 89 之间 ; 菌根真菌的多样性表现为受多方
面因素影响 。 受兰花地理分布和生态类型影响的聚类情况见 A 类点 : A .为河南兰花菌根真菌菌株间
的遗传相似系数 (0 . 7 1 ) ; A Z为四川兰花菌根真菌菌株间的遗传相似系数 (0 . 75 ) ; A , 和 A 4为云南附
生兰菌根真菌菌株间的遗传相似系数 ( 0 . 85 和 0 . 89 ) 。 受兰花所属种影响的聚类情况见 B 类点 : B I
为春兰菌根真菌菌株间的遗传相似系数 (0 . 76 ) , B Z为墨兰菌根真菌菌株间的遗传相似系数 (0 . 83 ) 。
3 讨论
中国兰属植物共生菌根真菌的多样性或其与植物的专一性关系一直是菌根研究中讨论的焦点 。 利
用分子生物学手段 , 全面系统地对不同地理分布 、 不同种和不同生态型中国兰属植物的共生菌根真菌
进行系统学分析 , 将有助于加深对这一复杂问题的了解 。
A FL P技术因具有灵敏度高 、 快速 、 多态性强 、 D N A 的用量少 、 重复性高等诸多优点 , 已被广泛
用于真菌分类鉴定和遗传多样性的研究 ( K ir s ti a n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ; Z h o n g & s t e fe n s o n , 2 00 2 ) 。 采用分
子标记技术研究我国特有的 、 广泛分布的兰属植物的共生菌根真菌的工作却鲜见报导 。 由于兰科菌根
真菌尚未发现子实体产生 , 因而难以获得可作为分类依据的形态学和解剖学的特征 , A F LP 技术可以
检测到和比较出传统形态学方法无法区分的相似菌株种间或种内差别 , 研究不受菌根真菌生长阶段和
形态的限制 , 大大增加了兰科菌根真菌鉴定的准确性和科学性 , 提高了菌根真菌比较鉴定和类群分析
的水平 。
此次研究发现 , 分离自同一地域的不同种兰属植物菌根真菌有明显 的聚类关系 。 分离自河南 、 四
川和云南的兰花菌根真菌表现出聚类关系 , 分别在 A , 、 A Z 、 A : 和 A 4处聚为一类 , 相似系数分别为
0
.
71
、
0
.
75
、
0
.
85 和 0 . 89 , 分离自云南兰花的菌根真菌的相似度 ( A 3 , 0 . 85 ; A 4 , 0 . 89) 高于分离
自河南 ( A . , 0 . 7 1) 和四川 ( A : , 0 . 75) 兰花的菌根真菌相似度 。 同时 , 不同地域同种兰花的菌根
真菌也表现出明显的聚类关系 , 春兰菌根真菌在 B ,处聚为一类 ; 墨兰菌根真菌在 B Z处聚为一类 , 表
明兰花种类与菌根真菌间存在专一性关系 。
分离自附生类型兰花莎草兰和多花兰 、 碧玉兰和台兰分别在 A 3和 A 4处聚类 , 相似系数分别为
0
.
85 和 0 . 89 , 高于地生类型兰花 (春兰 、 墨兰和蕙兰 ) 中的情况 , 是本次研究中相似系数最大的两
类菌根真菌 , 说明附生兰菌根真菌间多样性较低 ; 与地生兰相比 , 附生兰所处生境相对单一 、 对附生
环境要求苛刻是菌根真菌多样性较低的原因之一 , 同时进一步说明菌根真菌与不同生态型兰花之间存
在专一性关系 。
通常认为植物与共生菌根真菌间专一性关系包括 4 个层次的内容 , 即受植物生境影响的专一性
( R
o d r ig u e s & p e t r i n i
,
19 97 )
、 共生植物科 、 属或种层次的专一性 ( p e t r i n i , 198 6 ) 、 植物生活史中的
阶段专一性和共生植物的组织专一性 (范黎和郭顺星 , 19 98 ) 。 目前关于兰科植物与菌根真菌之间专
一性关系的研究报道 , 主要集中在专一性受植物生境影响 ( M e K e n d行e k e t a l . , 2 0 0 2 ; s e lo s s e e t a l , ,
2 0 0 2) 和受共生植物种属影响 ( eP kr ins & M c G e , 19 95 ) 的两个层次上 。 通过本次研究 , 从分子生
物学角度揭示了兰花地理分布 、 所属种和生态类型这三个影响中国兰属植物菌根真菌遗传多样性及其
与兰花间专一性关系的因素 , 获得了与目前的众多研究相吻合的结论 , 同时也表明利用 A F LP 技术从
系统发生学角度开展对兰属植物菌根真菌的研究有着较高的可行性 。
R e fe r e n e e s
C a r r
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,
S u t飞o n B C
.
19 7 7
.
Pre lim i n a口 s zu d i e s o n [ h e 11飞e id e n e e o f n e e d l e e n d o p h y r e s o n s o m e E u or pe a n e o n i fe r s . S yd o w ia , 2 9 : 8 7 一 10 3
Fa n L i
,
G u o S ll u n
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.
19 9 8
.
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.
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)
10郡 , 2 59 ( 4 ) : 2 2 7 一 2 3 0 . ( in C h in e s e )
范 黎 , 郭顺星 . 19 98 . 长科植物菌根真菌的研究进展 . 微生物学通报 , 2 59 ( 4 ) : 227 一 2 30 .