全 文 ：中国蔬菜　2009 (4):12-16
CHINAVEGETABLES
收稿日期: 2008-11-16;接受日期: 2008-12-22
基金项目:北京市农林科学院青年基金资助项目
作者简介:张德双 , 博士 , 副研究员 , 专业方向:大白菜遗传育种 、 分子生物学研究 , E-mail:zhangdeshuang@nercv.org
芸薹属异源六倍体的叶片突变体的获得
张德双　张凤兰　余阳俊　赵岫云　于拴仓　徐家炳
(北京市农林科学院蔬菜研究中心 , 北京 100097)
摘　要:对芸薹属异源六倍体 CGMCC№ 2553进行游离小孢子培养 , 获得各时期的胚;经继代培养获得
DH再生植株;低温处理 15 ～ 20 d后定植到日光温室中 , 或者直接定植到日光温室中自然低温处理 30 ～ 40 d。
结果表明 , CGMCC№ 2553具有胚胎发生能力 , 2006年获得 172株 DH再生植株 , 2007年获得 230株 , 2008
年驯化 275株;定植到日光温室中的 DH再生植株有些会转变为叶片突变体 , 2006 ～ 2007年共获得 8株叶片
皱缩突变体 , 最高获得率为 2.29%;目前已获得 2份突变体的自交种子;叶片突变体主要表现:生长初期叶
片表面皱缩呈瘤状 , 随着生长的进行 , 一些皱缩的叶片转变为正常 , 有的则依然皱缩。进一步研究发现 , 在
同一 DH再生植株上常常会萌发出皱缩和野生型的 2个或多个分枝 , 由于皱缩和野生型除了叶片皱缩性状不同
外 , 其他性状完全相同 , 因此叶片突变体和野生型是研究叶片皱缩性状的理想材料 , 有利于进一步研究皱缩
基因的遗传 , 定位 、 克隆叶片皱缩相关基因。
关键词:芸薹属异源六倍体 CGMCC№ 2553;游离小孢子培养;DH再生植株;叶片突变体;皱缩;基因
中图分类号:S634.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6346 (2009)04-0012 -05
AcquirementofLeafMutantsfromBrassicaAlosextupleSpecies
ZHANGDe-shuang, ZHANGFeng-lan, YUYang-jun, ZHAOXiu-yun, YUShuan-cang, XUJia-bing
(VegetableResearchCenter, BeijingAcademyofAgricultureandForestryScience, Beijing100097, China)
Abstract:CGMCC№ 2553 werecultivatedviaisolatedmicrosporecultureandembryoidsofdiferent
stageswereobtained.DHregenerationplantswereobtainedbysubculture.AfterDHplantsweresetatlow
temperaturetreatmentsituationfor15-20days, theywouldgrowingreenhouseortheyweredirectlygrew
ingreenhousewithnaturalylowertemperaturefor30-40 days.Resultsshowed172 DHplantsin2006,
230 DHplantsin2007wereobtained, 275plantshadbeendomesticatedin2008.SomeDHregeneration
plantscouldtransformintoleafmutants.From2006 to2007, 8 wrinklednessleafmutantsweregoten.
Thehighestrateofgetingmutantswas2.29 %.2 mutantplantshadgotenseeds.Theleafmutantsmain-
lyshowedwrinklednessinthesurfaceofprecedingleavesatearlystage.Thenthewrinkleleavescould
transfertonormalonesandsomealsokeepthewrinklednesslaterwiththeirgrowth.Furtherstudiesshowed
someDHplantscouldgeneratetwoormorethantwostemsinwhichwrinklednessmutantandwildtypeoften
burgeonedatthesameparent.Themutantshadthesamecharacteristicsaswildtypesexceptfortheleaf
wrinkledness, thereforetheywerethebetermaterialsforstudyingthewrinklednesscharacteristic.The
findingisusefulinstudying, locatingandcloningthewrinklednessgene(s)linkedtoleafmutantsof
BrasicaalosextupleCGMCC№ 2553 DHlinesinthefuture.
Keywords:BrasicaalosextupleCGMCC№ 2553;Isolatedmicrosporeculture;DHregeneration
2009 (4) 张德双等:芸薹属异源六倍体的叶片突变体的获得
plant;Leafmutant;Wrinkledness;Gene
植物细胞经过组织培养发生变异是一种常见的现象 , 采用这种方法诱导产生突变体也是进
行植物品种改良的手段之一 。游离小孢子培养是以单倍体花粉为培养对象的组织培养技术 , 已
经成熟应用于芸薹属作物中 。国内已成功将大白菜等作物的小孢子培养技术应用于育种实践 ,
并选育出一批大白菜新品种 〔1 -6〕。芸薹属作物具有较高的胚胎发生能力 , 这就为通过组织培养
方式获得突变体提供了可靠的保证 。在游离小孢子培养过程中 , 姊妹染色单体经过重组 、 交换
等多种方式结合 , 同时小孢子的数量巨大 , 因此通过游离小孢子培养技术获得多种类型突变体
是可行的途径 。
小孢子培养获得的 DH再生植株作为育种材料不仅可以快速纯合重要性状 , 缩短常规育种周
期 , 而且作为分子生物学研究的 DH永久作图群体 , 用于构建遗传图谱 , 重要性状的分子标记 ,
定位 、 克隆重要基因等的相关研究 〔7-8〕。
本研究应用游离小孢子培养技术 , 获得了芸薹属异源六倍体 CGMCC№ 2553的 DH再生植株 ,
然后结合一定范围的低温处理 , 最终成功地获得了叶片皱缩突变体 , 这将为研究皱缩基因的遗传
规律 , 定位 、 克隆叶片皱缩基因 , 探讨叶片皱缩性状在育种中作为标记性状的应用提供了可能 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料 CGMCC№ 2553由国外引进 , 为十字花科芸薹属的 3个基本种芸薹 、 黑芥和甘蓝复
合而成的异源六倍体 (AABBCC, n=27), 兼有 A、 B、 C染色体 (图 1)。在 CGMCC№ 2553同
一株上采收的种子个体间差异较大 , 有的植株叶片有缺刻 (缺刻深浅 、 大小不等 ), 有的叶片为
板叶;花色有黄花和白花之分 (花色深浅存在差异);茎部有的紫色 (紫色有深浅 、 部位的区
别), 有的绿色 (绿色有深浅 , 有无光泽 、 蜡粉的区别)。应用常规的方法 , 芸薹属异源六倍体
CGMCC№ 2553可以与大白菜 〔BrasicacampestrisL.ssp.pekinensis(Lour)Olsson, 2n=20, AA〕
直接杂交 , 目前已经获得少量的杂交种。
图 1　芸薹属异源六倍体 CGMCC№ 2553
1.2　试验方法
1.2.1　CGMCC№ 2553的游离小孢子培养　试验于 2005、 2006、 2007年 2 ～ 5月在北京市农林科
学院蔬菜研究中心进行 。参考张德双等 〔9〕的方法获得 CGMCC№ 2553再生植株 。选取大小为
2.0 ～ 3.5 mm的健康花蕾 , 经表面消毒后在研钵中轻轻挤压花蕾 , 用 B5液体培养基悬浮 、游离出
小孢子 。悬浮液经过 3次离心 , 富集小孢子 。将小孢子悬浮在 1/2 NLN液体培养基中进行培养 。
首先在 32.5℃黑暗条件下培养 24 h, 然后在 25 ℃条件下继续培养 14 d, 获得各时期的胚 。将子
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中 国 蔬 菜　CHINAVEGETABLES 2009年 2月 (下)
叶胚直接转接到 B5固体培养基中 , 经过 4 ～ 5次继代培养后获得 DH再生植株 , 将再生植株移栽
到营养钵中 , 覆膜保湿 , 确保移栽成活。
1.2.2　叶片皱缩突变体的获得　在两种栽培模式处理下获得叶片皱缩突变体。 ①将 DH再生植株
在 4 ～ 5℃低温条件下处理 15 ～ 20 d, 然后于 2月中旬定植到日光温室中继续生长 , 抽薹开花 , 结
实;②将 DH再生植株在 1月直接定植到日光温室中 , 自然低温处理 30 ～ 40d, 抽薹开花 , 结实 。
在 DH再生植株生长后期会出现一些叶片皱缩突变体 。
1.2.3　叶片皱缩突变体的染色体数目观察　参照郑宝智等 〔10〕的方法鉴定叶片皱缩突变体染色体
数目 。在盛花期 , 于晴天上午 9:00 ～ 11:00取突变体幼小花序 , 用卡诺氏液 (酒精 ∶冰乙酸 =3
V∶1V)固定 48h以上 , 再转至 70 %乙醇中 , 置于 4℃冰箱中保存备用 。以丙酸 —铁 —水合三氯
乙醛 —苏木精染色 , 常规压片 , 显微镜下观察并照相 , 统计染色体数目 。
2　结果与分析
2.1　CGMCC№ 2553 DH再生植株和叶片皱缩突变体的获得
CGMCC№ 2553具有一定的胚胎发生能力 , 可以经由子叶胚获得再生植株 (图 2、 3)。大部
分子叶胚的叶色表现为绿色 , 个别子叶胚为紫色。考虑到再生植株定植时间为翌年 1 ～ 2月 , 当年
无法得到自交种子 ,因此当年 DH再生植株数量的统计是以翌年定植到温室中的株数来计算的 。
图 2　DH再生苗
图 3　DH再生植株
表 1　2006 ～ 2007年 CGMCC№ 2553的
DH再生植株叶片皱缩突变体的获得
处理 突变体数 /定植数
2006年 2007年 合计
① 4～ 5℃处理 15 ～ 20 d 1 /67 1 /55 2 /122
②自然低温处理 30 ～ 40 d 2 /105 4 /175 6 /280
2006年共获得 DH再生植株 172株 , 2007年获得 230株 ,
其中 12株获得了自交种子 。 2008年移栽成活 275株 , 按
1.2.2中 2种获得叶片皱缩突变体的方法重复 1次。另外
还有部分再生植株因为生根慢 、 丛生发育等原因在三角瓶
中继续继代培养 。获得的 DH再生植株中 , 部分单株表现
为紫色茎和紫色叶片 。 DH单株间性状差异较大 , 表现
为:花色有黄色 、 白色和浅黄色;花粉有的多 , 有的少 ,
有的全无;同一朵花的雄蕊有的可育 , 有的不育 ,
6个雄蕊的长短也不同等 。
2006 ～ 2007年采用上述 2种获得叶片皱缩突
变体的方法分别重复 2次 , 获得了 8株 CGMCC№
2553的 DH再生植株叶片皱缩突变体 (表 1)。
2006年 , 处理 ①定植的 67株再生植株中有 1株
为叶片皱缩突变体 , 突变体发生频率为 1.49 %;
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处理 ②定植的 105株再生植株中有 2株为突变体 , 发生频率为 1.90 %。 2007年 , 处理 ①定植
的 55株再生植株中有 1株为叶片皱缩突变体 , 突变体发生频率为 1.82 %;处理 ②定植的 175株
再生植株中有 4株突变体 , 发生频率为 2.29 %。部分叶片突变体的性状表现如图 4所示 , 目前已
有 2株突变体获得了自交种子 。
叶片皱缩突变体主要表现为:在生长前期 , 叶片表面皱缩呈瘤状 , 随着生长的进行 , 一些叶
片变为正常叶 , 有些则依然皱缩 。进一步研究发现 , 在同一 DH再生植株上经常会萌发出皱缩和
野生型 2个或多个分枝 (图 5)。
2.2　叶片皱缩突变体的染色体观察
观察叶片皱缩突变体终变期染色体分布 , 结果如图 6所示 , 染色体数为 n=27。
3　结论
3.1　CGMCC№ 2553游离小孢子培养
芸薹属异源六倍体 CGMCC№ 2553的游离小孢子培养技术规程与青花菜等的培养技术相似 ,
热激处理温度和时间以 32.5 ℃、 1 d为佳 , 蔗糖浓度以 10 %为宜 。因供试材料 CGMCC№ 2553
的花蕾较大 , 取材时选健康花蕾长 2.0 ～ 3.5 mm为宜 。因为没有详细研究影响供试材料胚胎发生
率的各种因素 , 从而也未能优化培养条件 , 所以 CGMCC№ 2553没有获得较高的胚胎发生率。
研究发现 , CGMCC№ 2553单个胚的成苗率较高 。一般 1个胚可以分化出 3株再生苗 , 少数
胚可以分化出更多 , 这种现象在大白菜 、 青花菜等芸薹属作物的游离小孢子培养中很少见 。一胚
多苗的优点首先是提高 DH再生植株的成活率 , 其次有利于获得基因型相同而某些性状不同的突
变型和野生型材料 , 如本研究获得的叶片皱缩突变体 。
由于芸薹属异源六倍体兼有 A、 B、 C染色体的复杂背景 , 因此由其获得的 DH再生植株个体
间性状差异较大 , 在花色深浅 、 花粉的多少 、 同一朵花的雄蕊可育度和长度等性状上存在差异 ,
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这不仅丰富了芸薹属的种质资源 , 而且为研究 A、 B、 C染色体的线性关系提供了试材。
3.2　CGMCC№ 2553 DH再生植株的叶片突变体后续研究
由于在 DH再生植株上并发的两个或更多的分枝出于同一个母体 , 只是在叶片皱缩这个单一
性状上表现差异 , 而其他的遗传背景完全一致 , 因此是很好的野生型和突变型材料 , 这将为研究
叶片皱缩基因的遗传规律 , 为定位 、 克隆和分离叶片皱缩基因 , 并探讨叶片皱缩性状在育种中作
为标记性状的应用等提供了可能 。
本研究还发现 , 由于 CGMCC№ 2553的 DH再生植株具有一胚多苗的优点 , 有的胚分生的再
生苗多达 10株以上 , 这又为通过物理和化学诱变方法获得性状突变体材料提供了更大的机率 , 如
将这些来源相同的材料分成不同组分别进行诱变处理 , 获得性状各异的突变体 , 将为进一步研究
性状突变的遗传规律和定位相关基因奠定基础 。在甘蓝型油菜高油酸种质材料的获得 〔11〕 、 改良甘
蓝型油菜 CMS恢复系的获得 〔12〕和航天搭载雪里蕻获得的 DH再生植株 〔13〕等方面已经有成功的
报道 。
目前获得的 2份叶片皱缩突变体自交种子将为今后开展相关研究奠定基础 。
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