全 文 ：　[收稿日期] 2009 07 18
　[基金项目] 湖北省自然科学基金项目(2007ABA386);湖北省荆州市科技发展计划项目(20081P033)
　[第一作者简介] 刘乐承(1964 ),男 ,湖北洪湖人 ,农学博士 ,教授 ,主要从事园艺植物育种的教学与研究.
doi:10.3969/ j.issn.1673 1409(S).2009.03.018
芸薹属作物游离小孢子培养研究进展
　　刘乐承 ,付明星 ,林小芳　(长江大学园艺园林学院 ,湖北 荆州 , 434025)
[ 摘要]综述了芸薹属(Brassica)作物游离小孢子培养的研究进展 , 主要涉及到影响培养的主要因素和培养
技术在育种中的应用 2 个方面。
[ 关键词] 芸薹属(Brassica);游离小孢子培养;育种
[ 中图分类号] Q813.1 [ 文献标识码] A　　[文章编号] 1673 1409(2009)03 S056 04
芸薹属(B rassica)是十字花科植物 300多个属中最重要的一个属 ,主要包括白菜类 、甘蓝类和芥菜类
3大类蔬菜 ,种质资源非常丰富 ,是我国栽培面积最大的蔬菜作物[ 1] 。近年来 ,随着我国蔬菜产业的发展 ,
芸薹属作物育种面临许多新的问题和挑战。小孢子是高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要
的阶段。游离小孢子培养(Iso lated microspore culture)是指不经任何形式的花药预培养 ,直接从花蕾或
花药中获取游离状态的新鲜小孢子群体进行培养的方法。芸薹属作物游离小孢子培养始于 1982年 ,
Lichter[ 2] 首次对甘蓝型油菜(B.napus)游离小孢子培养并形成植株做了报道 。此后 ,游离小孢子培养技
术先后在芸薹属作物中的结球甘蓝 、大白菜 、花椰菜 、小白菜 、黑芥 、叶芥 、青花菜等十余种蔬菜中取得了一
定进展[ 3 ～ 5] 。该技术具有基因型纯合速度快 、分离较简单 、基因型固定 、可作为外源基因的良好受体等优
点。因此 ,游离小孢子培养研究对芸薹属作物的基础研究与应用研究均具有十分重要的意义 。
1　游离小孢子培养的影响因素研究
1.1　外植体对小孢子胚状体发生的影响
(1)基因型的影响　Vyvadilo va等[ 6] 对几种甘蓝类蔬菜的研究发现 ,基因型和小孢子发育阶段是影响
小孢子出胚率的主要因素 。刘凡等[ 7] 则发现结球白菜比不结球白菜 、结球白菜中的叠抱类型比合抱类型 、
早熟类型比晚熟类型具有更强的胚胎发生能力。严准等[ 8] 在同样条件下对 4种甘蓝材料进行游离小孢子
培养 ,只有苤蓝有胚状体产生 ,青花菜仅诱导出了大量愈伤组织 ,青苤蓝和结球甘蓝既无胚状体又无愈伤
组织产生 。王涛涛[ 1] 也只在 73.3%的大白菜 、76.9%的紫菜薹和 50%的甘蓝中分别获得了小孢子胚状
体。而桑玉芳[ 9] 的研究结果表明 19个甘蓝基因型小孢子培养的诱导率差异显著 ,其中 3个无法获得胚状
体。因此 ,胚状体的诱导与供体材料的基因型密切相关 。此外 ,供体材料的不同基因型之间产胚率也存在
较大差异 ,如曹鸣庆等[ 10]研究发现 ,产胚率最高的大白菜的平均产胚率可达 350个/蕾 ,而大多数基因型
的大白菜平均产胚率在 2个/蕾以下。
(2)植株生理状态的影响　Duijs等[ 11]对供体植株的生长环境对小胞子培养的影响进行了研究 ,认为
高大健壮的植株出胚率较高 、出胚比较稳定。另外 ,小孢子培养还受供体植株生长环境 ,如温度 、光照等的
影响 。方淑桂等[ 12] 认为大白菜供体植株生长在 10 ～ 25 ℃气温条件下较适宜 ,最高气温超过 28 ℃时小孢
子胚状体诱导率大大降低 。官春云[ 13] 在油菜小孢子培养中发现 ,来自生长室的供体植株 ,小孢子成胚的
百分率高 。
为了获得活力较高的小抱子 ,供体植株的栽培季节也很重要 。曹鸣庆等[ 10] 认为大白菜的开花季节为
·56· 长江大学学报(自然科学版)　2009年 9月 第 6卷第 3期:农学Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit)　Sep.2009 , Vo l.6 No.3:Agri Sci
4 ～ 5月 ,此时温度一般较高 ,为了提高小孢子胚胎发生率应把供体植株花期安排在冬季和早春。花椰菜
的花药培养也是冬 、春季效果好于夏 、秋季[ 14] 。为供体植株创造适宜的生长条件 ,使其不受逆境影响 ,是
提高小孢子培养出胚率的重要保证 。
(3)小孢子发育阶段的影响　小孢子发育阶段分为单核期 、双核期和三核期 ,单核期又可分为单核早
期 、单核中期和单核靠边期。胚胎发生的激发启动大致发生在单核中期至单核靠边这一短暂的发育过程
中。小孢子发育时期与花蕾形态指标 ,如花蕾长度 、花药长度 、花瓣长/花药长等密切相关。曹鸣庆等[ 10]
发现 ,CC11基因型大白菜花蕾长 2.0 ～ 2.5 mm 时 ,小孢子处于单核中期至单核靠边期 ,小孢子胚产量最
高。李岩等[ 15] 也报道小白菜单核中期至单核靠边期的小孢子易于诱导胚胎发生 。张德双等[ 16] 、桑玉芳[ 9]
分别发现绿花菜 、甘蓝的小孢子胚诱导率以单核靠边期到双核早期阶段最高 。王涛涛[ 1] 发现在添加一定
量的活性炭时和设定一定花粉密度时 ,选择单核靠边期比率为 50 ～ 70%的小孢子 ,有利于大白菜和紫菜
薹的小孢子发生 ,而在选择含 10 ～ 30%的双核期小孢子有利于甘蓝的小孢子发生 。因此 ,在培养中要根
据不同品种依据不同的形态指标来获取最适宜诱导的小孢子群体。
1.2　培养方法和条件的影响
(1)花粉预处理的影响　对试验材料进行预处理 ,通过外界的胁迫作用使小孢子发生一系列的生理生
化变化 ,促使小孢子完成脱分化启动 ,从而改变小孢子的发育途径 ,提高培养效率。预处理操作包括离心 、
低温 、高温 、射线 、甘露醇预处理和预培养等方式 ,目的在于改变细胞的生理状态 、分裂方式和发育途径 。
自从 Keller和 Armstrong[ 17] 在甘蓝型油菜花粉培养中 ,首次用高温处理提高花粉胚的诱导频率获得成功
以后 ,该方法被广泛用于芸薹属植物的游离小孢子培养[ 1] 。甘蓝小孢子在 30 ～ 35 ℃下预处理 24 ～ 48 h ,
可以明显提高胚状体诱导效率 。周伟军等[ 18]对油菜游离小孢子分别进行32 ℃和 30 ℃热激暗培养3 d和
7 d ,胚胎发生好 、产胚率高 。但是 ,桑玉芳[ 9] 在甘蓝小孢子培养前对花蕾进行 0 ～ 4 ℃48 h的低温预处
理 ,在培养初期给予小孢子 33 ℃24 h 的高温暗培养 ,可以获得较好的诱导效果。张小玲等[ 19] 以强度300
mT 的均匀磁场处理花椰菜花药 30 min ,取得了较好效果。在游离小孢子培养中前期的预处理是非常必
要的 ,它不仅提高了小孢子胚产率 ,也会影响小孢子再生植株的二倍体株率 。
(2)培养基及附加物质的影响　培养基是诱导胚胎发生的基础 ,用于小孢子培养的培养基成分因植
物材料的不同而差异较大 ,但其组成应尽可能确保维持小抱子活力 ,提供小孢子胚胎发生所必需的有机 、
无机成分 ,以达到高的胚诱导频率。一般在小孢子胚状体的诱导培养中 ,所采用的基本培养基为 NLN 培
养基。与 MS 、B5等培养基相比 ,N LN 的主要特点是大量元素含量较低。余凤群和刘后利[ 20] 比较发现甘
蓝型油菜小孢子在 MS 、B5 培养基上未发现胚状体 ,在 1/2 MS 、1/2 B5 培养基上形成少量胚状体 ,在
NLN 上形成大量胚状体 。
培养基的外源激素是小孢子培养中必不可少的成分 ,但关于外源激素对小孢子胚胎发生和植株再生
的影响还未取得一致的认识。如 2001年许艳辉等[ 21] 报道 , 0.2 mg/L 的 6-BA 对大白菜小孢子胚胎发生
有一定的促进作用 ,而桑玉芳[ 9] 发现激素在甘蓝小孢子培养中具有重要的影响 ,但是不同的基因型对激素
的反应不同。
大量试验研究表明培养基中添加适量活性炭(AC , Activ ated cha rcoal)能明显促进小孢子的胚胎发
生。杨清等[ 22] 在冬花椰菜小孢子培养时 ,培养基中加入 0.5 g/L 的 AC 能提高发生率。Halkjaer 等[ 23] 认
为pH 在6.0附加AC 可促进胚产量 。王涛涛[ 1] 发现在添加一定量的AC 时有利于大白菜 、紫菜薹和甘蓝
的小孢子发生。桑玉芳[ 9] 也发现在培养基中添加 AC ,甘蓝基因型胚产量所占比例在总体上有大幅度的
提高 。在培养初期 ,培养基中添加秋水仙素可以促进细胞分裂 ,有助于小孢子发育成胚 , 如顾宏辉等[ 24]
用 0.8 mg/L 秋水仙碱直接处理分离小孢子液也能明显增加胚状体产量。
(3)花粉密度的影响　不同密度的小孢子对培养基中营养的竞争 ,以及自身在发育过程中不同物质的
代谢都对小孢子的发育有很大的影响。李岩等[ 15]发现大白菜小孢子培养时采用 1×105个/mL 的密度比
较适宜;Dias等[ 25] 研究表明甘蓝类小孢子密度以 2×104 ～ 4×104个/mL 最适;而王涛涛[ 1] 发现在一定的
小孢子发育阶段和添加适量的活性炭时 ,将密度设为 1.5 ～ 2 个花蕾/mL ,有利于大白菜和紫菜薹的小孢
子发生 ,而将密度设为 1.5个花蕾/mL 有利于甘蓝的小孢子发生 。
·57·第 6 卷 第 3 期:农学 刘乐承等:芸薹属作物游离小孢子培养研究进展 　
2　游离小孢子培养技术在育种中的应用研究
2.1　双单倍体育种
在育种中 ,由小孢子产生的双单倍体(DH ,Double haploid)后代是纯系群体 ,可直接应用于芸薹属作
物育种。隐形基因在 DH 群体中出现的频率(1/2n)是常规育种中 F2 群体(1/22n)的 2n 倍(n 为基因对
数),能有效提高隐性基因的选择效率 。DH 系还具有同单粒后代相似的农艺形状和综合特性 。Plamer
等[ 26]对绿花菜的 DH 群体及其杂交种的观察和研究表明 ,大多数 DH 系虽然形态 、产量不及亲本 ,但 DH
杂交种各项性状明显好于亲本和 DH 系。
芸薹属作物双单倍体品种已陆续育成 。耿建峰等[ 27] 利用小孢子培养产生的两个自交不亲和系配制
出具有早熟耐热 、品种好 、抗病性强等优良性状的花椰菜 DH 杂交种`豫雪 60 ;随后他们还选育出早熟高
产 、抗先期抽薹的春甘蓝 DH 杂交新品种`豫生 1号 。吴江生等[ 28] 成功育成了我国第一个双低 DH 甘蓝
型油菜品种`华双 3号 。
此外 ,小孢子培养技术也应用于常规杂交育种和远缘杂交育种中 。石淑稳等[ 29] 分别从甘蓝型油菜与
诸葛菜(Orychophragmus v lolaceus)的属间杂种进行小孢子培养获得小孢子再生植株 ,周永明等[ 30] 在甘
蓝型油菜与白菜型油菜 、甘蓝型油菜与芥菜型油菜的种间杂交中获得了小孢子胚和再生植株 ,为芸薹属植
物远缘杂交和种间育种创造种质资源开辟了新途径。
2.2　突变育种
小孢子具有单倍体和单细胞特性 ,且群体大 ,是理想的突变材料 。目前应用于芸薹属作物小孢子培养
突变体的方法有 2类 ,一类是化学方法 ,如叠氮化钠(NaN 3)、亚硝基尿烷(ENU)和甲基磺酸乙酯(EMS),
另一类是物理方法 ,如 χ射线 、γ射线和 UV 紫外线 。UV 是被最广泛应用的突变剂。Ahmad等[ 31] 通过
UV 处理甘蓝型油菜小孢子 ,表明小孢子对 UV极为敏感 ,并筛选出对油菜黑斑病抗性强的再生植株。曹
鸣庆等[ 10]将大白菜黑斑病毒素加入培养基 ,诱导得到的小孢子胚中筛选出了对黑斑病表现一定抗性的大
白菜小孢子植株 。Barro 等[ 32] 用 EMS 诱变埃塞俄比亚油菜(B.carinata)小孢子 ,再生植株的种子芥酸
含量差异很大。
2.3　基因工程育种
外源基因导入游离小孢子并加倍后 ,可以最大限度的降低转基因植株的嵌合性和杂合性 ,通过小孢子
胚能快速 、有效地筛选出含有转基因的胚状体 ,较大地提高基因的转化效率[ 33 ～ 36] 。Dormann等[ 37] 建立了
白菜型和甘蓝型油菜分离小孢子根癌农杆菌介导转化系统和无损筛选系统 。陈军等[ 36] 以甘蓝型油菜小
孢子为受体 ,利用激光束穿刺法导入芜菁花叶病毒外壳蛋白基因 ,最终获得 1 株转化植株 。刘凡等[ 38] 利
用大白菜小孢子胚状体获得抗草胺膦除草剂转基因植株 。随着游离小孢子培养技术的日益成熟 ,必将推
动基因工程的发展。
3　问题与展望
游离小孢子培养技术发展十分迅速 ,但在理论和应用上仍存在许多问题。其核心问题是小孢子脱分
化的启动和胚胎的发育未能完全明了;离体条件下小孢子的发育不同步和多种发育途径并存 ,使人们难以
用先进的现代生物学技术去深入研究小孢子的某些生化过程;虽然芸薹属植物的小孢子培养再生植株普
遍具有一定的自然加倍率 ,这对植物的育种工作非常有利 ,但小孢子植株的加倍机理仍不明确。此外 ,现
有的研究多局限于培育技术方法方面 ,在育种中的应用也较少 ,而芸薹属作物的生育期以及诱导率不高也
限制了该项技术的广泛应用。今后应加强理论和技术研究 ,深入探讨小孢子发育的调控机理 ,建立程序化
的培作 ,为作物育种改良提供快捷有效的手段 。
[参考文献]
[ 1]王涛涛.芸苔属蔬菜小孢子培养及自交不亲和性的分子鉴定[ D] .武汉:华中农业大学 , 2006.
·58· 　 长江大学学报(自然科学版) 2009年 9 月
[ 2] Lichter R.Induct ion of haploid p lan ts f rom isolated pollen of Brassica napus[ J] .Z Pf lanzenphysiologiel , 1982 , 105:427～ 434.
[ 3] Miyasaka Y ,M atsumoto E , Fujim ori M.S tu dies on anther and pol len cul tu re in B assica vegetable crops[ J] .Japan Breeding , 1989 , 39:102
～ 103.
[ 4] 张凤兰 ,钉贯靖久 ,吉川宏昭.环境条件对大白菜小抱子培养的影响[ J] .华北农学报 , 1994 , 9(1):95～ 100.
[ 5]王　蒂 ,冉毅东 ,王汉宁 ,等.不同培养基对甘蓝型油菜花药和花粉培养的效应比较[ J] .中国油料 , 1996 , 18(2):1～ 3.
[ 6] Vy vadilova M , Klima M , Kucera V.Analysis of factor s af fecting emb ry ogenesiss in microspore cultures of some cru ciferous vegetables
[ J] .Zahradnictvi , 1998 , 25:4 , 137～ 144.
[ 7]刘　凡 ,莫东发 ,姚　磊 ,等.遗传背景及活性炭对白菜小孢子胚胎发生能力的影响[ J] .农业生物技术学报 , 2001 , 9(3):297～ 300.
[ 8]严　准 ,田志宏 ,孟金陵.甘蓝游离小孢子培养的初步研究[ J] .华中农业大学学报 , 1999 , 18(1):5～ 7.
[ 9]桑玉芳.甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素探讨[ D] .杨凌:西北农林科技大学 , 2007.
[ 10] 曹鸣庆 ,李　岩 ,刘　凡.基因型和供体植株生长环境对大白菜游离小孢子胚胎发生的影响[ J] .华北农学报 , 1993 , 8(4):1～ 6.
[ 11] Duijs J G , Voorrips R E , Vis ser D L , et a l.Microspore culture is su ccessful in most crop types of B rassica oleracea L[ J] .Euphy tica ,
1992 , 60:45～ 55.
[ 12] 方淑桂 ,陈文辉 ,曾小玲 ,等.大白菜游离小孢子培养技术研究初报[ J] .福建农业学报 , 2003 , 18(2):123～ 126.
[ 13] 官春云.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究Ⅰ .供体植株和小孢子密度对小孢子培养的影响[ J] .作物学报 , 1995 ,(21):66～ 67.
[ 14] Rang Q Y.A study of factors affecting anther culture of cau lif lower[ J] .Plant Cell-T issu eand Organ-C ulture.1992, 28(3):289～ 296.
[ 15] 李　岩 ,刘　凡 ,曹鸣庆.通过游离小孢子培养方法获得小白菜三个变种的胚胎和植株[ J] .华北农学报 , 1993 , 8(3):92～ 97.
[ 16] 张德双 ,曹鸣庆 ,秦智伟.影响绿菜花游离小孢子培养的因素[ J] .华北农学报 , 1999 , 14(1):68～ 72.
[ 17] Keller W A , Armst rong KC.Emb ryogenesi s and plant regenerat ion in Brassica napus anther cultures[ J] .Can J Bot , 1977 , 55:1383～
1388.
[ 18] 周伟军 ,毛碧增 ,顾宏辉 ,等.秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[ J] .作物学报 , 2002 , 28(3):369～ 373.
[ 19] 张小玲 ,吴一琦 ,唐征 ,等.磁场预处理对花椰菜花药培养的影响[ J] .上海农业学报 , 2002 , 18(3):21～ 23.
[ 20] 余风群 ,刘后利.供体材料和培养基成份对甘蓝型油菜小孢子胚状体产量的影响[ J] .华中农业大学学报 , 1995 , 14(4):327～ 332.
[ 21] 许艳辉 ,冯辉 ,张凯.大白菜游离小孢子培养中若干因素对胚状体诱导和植株再生影响[ J] .北方园艺 , 2001 ,(3):6～ 8.
[ 22] 杨　清 ,曹鸣庆.通过花药漂浮培养提高花椰菜小孢子胚胎发生率[ J] .华北农学报 , 1991 , 6(3):65～ 69.
[ 23] Halkjaer M , Ringgaard S , Bohanesc B.Genet ic and exogenous factors affecting the induction of doub le haploid cabbage(B rassica oleracea
var.ca pi tata L.)[ A] .Biotechnological approaches for u ti li zation of gametic cell s[ C] , 2001 , 12:147～ 150.
[ 24] 顾宏辉 ,朱金庆 ,张国庆 ,等.菜苔小孢子培养及再生植株的倍性鉴定[ J] .农业生物技术学报 , 2003 , 11(6):572～ 576.
[ 25] Dias J S.Effect of incub at ion temperature regimes and cul tu re medium on b roccoli microspo re cu lture emb ryogenesis[ J] .Euphy tica ,
2001 , 119:389～ 394.
[ 26] Palmer C E , Keller W A , A rnison P G.Utilizat ion of Brassica hap loids[ A] .Jain S M , Sopory S K , Veilleux R E.In vi t ro H aploid Pro-
duction in H igher Plants Vol.3[ C] .Dordrech t:Kluw er Academic Publish ers ,1996:173～ 192.
[ 27] 耿建峰 ,张晓伟 ,原玉香 ,等.早熟春甘蓝新品种 “豫生 1号”[ J] .河南农业科学 , 2002 ,(3):36～ 37.
[ 28] 吴江生 ,石淑稳 ,周高明.甘蓝型双低油菜新品种华双 3号的选育和研究[ J] .华中农业大学学报 , 1999 , 18(1):41～ 46.
[ 29] 石淑稳 ,周永明 ,王　晨.γ射线和χ射线对甘蓝型油菜小孢子胚状体再生的影响[ J] .中国油料作物学报 , 2004 , 26(2):6～ 9.
[ 30] 周永明 , S carth R.甘蓝型油菜和芥菜型油菜杂种小抱培养获得再生植株[ J] .作物学报 , 1996 , 22(4):399～ 403.
[ 31] Aham d I , Day J P , Macdonald M V , et a l.Haploid culture and UV mutagenesis in rapid-cyclin g Brasssica napus for th e generation of re-
si stan ce to chlorsu lfu ron and A lternar ia brassicion[ J] .Ann Bot , 1991 , 67:521～ 525.
[ 32] Bar ro F , Fernandez-Escobar J , Vega M D , eta l.Modification of glucosin olate and erucic acid contents in doubled haploid lines of Bra ssica
rassica by UV treatmen t of isolated microspore[ J] .Euphyt ica , 2003 , 129(1):1～ 6.
[ 33] 余凤群.芸苔属植物未成熟小孢子培养技术的研究和应用[ J] .中国油料作物学报 , 1994 , 16(4):70～ 73.
[ 34] 顾宏辉 ,胡林军.小孢子培养技术在芸苔属作物育种上的应用进展[ J] .农业生物技术学报 , 2004 , 12(2):219～ 223.
[ 35] 王学军.油菜小孢子再生体系的研究进展[ J] .湖南农业大学学报 , 2003 , 29(4):281～ 284.
[ 36] Dormann M , Dat la N , Hayden A , et al.Non-dest ruct ive screening of h aploid emb ry os for glufosinate ammonium resi stan ce four w eek s af-
t er microspore t ransformation in B rassica[ J] .Acta H orticul Sin , 1998 , 459:191～ 197.
[ 37] 陈　军 ,王兰岚 ,刘澄清 ,等.用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究[ J] .激光生物学报 , 1998 , 7(2):103～ 107.
[ 38] 刘　凡 ,姚　磊 ,李　岩 ,等.利用大白菜小孢子胚状体获得抗除草剂转基因植株[ J] .华北农学报 , 1998 , 13(4):93～ 98.
·59·第 6 卷 第 3 期:农学 刘乐承等:芸薹属作物游离小孢子培养研究进展