全 文 ：园　艺　学　报　2009, 36 (10):1473-1478
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2009-04-27;修回日期: 2009-06-24
基金项目:国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A7, 2006BAD13B06);农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
＊通讯作者 Authorforcorrespondence(E-mail:rifei.sun@caas.net.cn)
大白菜与诸葛菜属间杂交及 GISH鉴定
乔海云 , 李　菲 , 张淑江 , 章时蕃 , 孙日飞＊
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘　要:以不同类型的大白菜与诸葛菜进行属间正反杂交 , 运用蕾期重复授粉及胚挽救技术 , 在大白
菜为母本的组合中获得了 31株幼苗 , GISH鉴定表明有 16株具有预期的染色体数 , 2n=22, 为真杂种;在
诸葛菜为母本的组合中没有得到杂种植株。田间调查显示 , 杂种一代植株综合性状介于双亲之间 , 同时花
粉败育。
关键词:大白菜;诸葛菜;属间杂交;GISH
中图分类号:S634.1　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2009) 10-1473-06
IntergenericHybridizationofBrassicacampestrisL.ssp.pekinensis(Lour.)OlssonandOrychophragmusviolaceusandGISHIdentification
QIAOHai-yun, LiFei, ZHANGShu-jiang, ZHANGShi-fan, andSUNRi-fei＊
(InstituteofVegetableandFlowers, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing100081, China)
Abstract:TheintergenerichybridizationsbetweendiferentBrassicacampestrisL.ssp.pekinensis
(Lour.)OlssonandOrychophragmusviolaceuswerecariedout.Bysuccessivebudpolinationandovule
culture, B.campestrisL.ssp.pekinensisandO.violaceuswerecrossedreciprocaly.WhenB.campestris
L.ssp.pekinensiswasusedasmotherplants, thirty-oneplantswereobtained, whileO.violaceuswasused
asmotherplants, noplantswererescued.Sixteenofthethirty-oneplantsshowedcharacteristicsofboth
parents.GISHidentificationrevealedthatsixteenofthethirty-onehybridplantswererealhybridsbecausethey
hadtheanticipativechromosomes(2n=22).Theinvestigationinthefieldshowedthatmanycharacteristics
inbetweenbothparentsandthepolenfertilityofhybridplants(F1)wasaborted.
Keywords:BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis(Lour.)Olsson;Orychophragmusviolaceus(L.)
O.E.Schulz;intergenericcros;GISH
大白菜 [ BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis(Lour.)Olsson, AA, 2n=20] 目前种质资源在很
多方面难以满足多方向育种的需要 。远缘杂交是实现种间基因转移的重要途径。张德双等 (2002)
用不同大白菜株系与甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料进行多代回交转育 , 成功地转育出了不同类型的
大白菜细胞质雄性不育系。温贵聚等 (2008)为丰富大白菜的抗病基因类型 , 特别是培育根肿病抗
性种质 , 获得了大白菜与黑芥的种间杂种并进行了鉴定。目前在芸薹属作物中已经通过种间杂交创造
了许多新的种质资源 (金海霞等 , 2006)。
诸葛菜 [ Orychophragmusviolaceus(L.)O.E.Schulz, OO, 2n=24] 是十字花科诸葛菜属的一
种野生植物 , 主要作为观赏栽培。研究表明 , 诸葛菜具有许多优良性状 , 如种子油分好 , 具有高含量
的不饱和脂肪酸和低含量的芥酸 (罗鹏 等 , 1993);营养成分丰富 , 蛋白质含量高 (李新华 等 ,
1997);适应性强 , 耐寒 , 耐阴 (肖龙和罗鹏 , 1994)。目前有关研究多侧重于利用诸葛菜来改良芸
DOI :10.16420/j.issn.0513-353x.2009.10.013
园　　艺　　学　　报 36卷
薹属植物中油菜的油分品质 (李再云 , 1992;王爱云 等 , 2006, 2008), 而大白菜与诸葛菜的属间杂
交研究尚未见报道 。
为改良大白菜的遗传背景 , 获得大白菜新的种质资源 , 本研究中进行了大白菜与诸葛菜的属间杂
交 , 初步探讨大白菜与诸葛菜属间杂交的亲和性 。
1　材料与方法
1.1　材料
大白菜和诸葛菜均来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜育种课题组。
大白菜包括 089、 091、 107、 403、 383、 083和 041七个纯系材料 , 其中 089、 091、 107、 403和
383是通过小孢子培养而得到的纯系材料 , 083和 041是选育的高代自交系。 089、 091和 107来源于
中晚熟品种 `中白 82 ;403来源于较早熟品种 `鲁白 8号 ;383来源于极早熟品种 `小杂 50 ;
083来源于地方品种 `石特一号 ;041来源于早熟青麻叶类型 `津绿 55 。
诸葛菜包括 564、 565、 566三个材料 , 来源于野外搜集 , 其中 564开浅紫色花 , 565开白色花 ,
566开深紫色花 , 其他植物学性状一致。
1.2　方法
1.2.1　属间杂交和胚挽救　
试验材料于 2005年冬季播种于中国农业科学院蔬菜花卉研究所阳畦 , 经低温春化处理 , 于 2006
年春季定植于塑料大棚 , 常规栽培管理 。以 7个大白菜材料为母本 , 3个诸葛菜材料为父本 , 配置 7
个杂交组合 , 分别是 383×564、 083×564、 089 ×564、 403 ×565、 091×566、 041×566、 107×566。
同时以 3个诸葛菜材料为母本 , 7个大白菜材料为父本随机配置杂交组合进行反交 。在盛花期采用人
工剥蕾去雄重复授粉。取父本新鲜花粉 , 涂抹在母本去雄蕊的花蕾柱头上 , 每天早晚重复授粉两次 ,
连续涂抹 3d。分别取授粉后 7、 10和 15d的子房 , 用 75%的乙醇消毒 1min, 然后用 7%的次氯酸钠
灭菌 15min, 用无菌水冲洗 3次 。剥取子房中的胚珠接种到 B5培养基上 。接种胚珠在 (25±2)℃,
光照 10h·d-1 , 光照强度 2 000 lx条件下培养 20 ～ 30d。成活胚珠形成的幼苗经分化和生根后定植
于玻璃温室 , 常规管理 。
1.2.2　F1植株形态学观察及 F1花粉育性观察　
观察 、记录 F1杂种植株生长发育的不同阶段的形态学变化。采用醋酸洋红染色法 , 观察花粉粒
的着色情况 , 判断花粉的育性。
1.2.3　基因组原位杂交 (GISH)方法　
DNA的提取及探针标记:采用 CTAB(Doyle＆ Doyle, 1990)法提取大白菜和诸葛菜的基因组
DNA;使用 DIG-NickTranslationMix(Roche)试剂盒提供的试剂和程序 , 采用缺口平移法将诸葛菜
DNA进行 dig-11-dUTP标记 , 用作探针。
细胞学及原位杂交:取杂种 F1的根尖 , 用对二氯苯处理 2 ～ 3h, 然后用卡诺固定液 (无水乙醇∶
冰醋酸 =3∶1)固定 , 采用去壁低渗火焰干燥法制片 , 观察有丝分裂。将有丝分裂中期分裂相较多的
制片放到 -20 ℃冰箱中保存备用 。
GISH程序主要参照 Leitch等 (1994)的方法进行 。将准备好的染色体制片于 65 ℃的烘箱中烘
45 min, 然后每张制片加 100 μL70%的甲酰胺 , 盖上盖玻片 , 放入 85℃的烘箱 2 min, 迅速拿出去
掉盖玻片 , 立即用 70%、 90%和 100%的冷乙醇依次脱水 5 min, 最后制片自然晾干 。将 20 μL预变
性的杂交混合液 (含诸葛菜 DNA探针 100 ng)加到每一张制片上 , 然后在 85℃下共变性 2 min, 最
后将制片置于杂交盒内 , 于 37 ℃培养箱中杂交过夜 。经 2×SSC和 1×PBS洗脱后 , 每张制片加 100
μLAnti-Dig-Rhoda, 盖上封口膜 , 继续在保温皿里 37 ℃反应 1 h。取出制片 , 揭掉封口膜 , 经 1×
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　10期 乔海云等:大白菜与诸葛菜属间杂交及 GISH鉴定　
PBS洗脱后 , 每张制片加 13μLDAPI染液 , 抗淬灭剂封片 , 于 ZEISS荧光显微镜下观察。
2　结果与分析
2.1　不同取材时期对杂种胚生长的影响
不同发育时期的胚珠在 B5培养基上培养 20 ～ 30d后 , 成活胚珠数有明显差别 。由表 1可知 , 取
授粉后 10 d的胚珠进行离体培养时 , 成活胚珠数较高;授粉后 7d, 仅有 2个成活胚珠 , 这可能是由
于胚珠过小 , 依赖母体太强 , 而难以离体培养;授粉后 15 d仅有 1个胚珠成活 , 这是由于随着受精
后天数的延长 , 杂种胚已逐渐败育所致 。
因此 , 从取材时间上看 , 授粉后 10 d是胚珠培养的适宜时期 。
表 1　不同取材时期的胚珠在 B5培养基上的成活胚珠数
Table1　NumberofsurvivalovulesonB5mediumfromdifferentdevelopingphases
授粉后天数 /d
Daysafterpolination
胚珠数
Numberofovules
成活胚珠数
Numberofsurvivalovules
成活率 /%
Survivalrate
7 3 050 2 0.06
10 3 200 28 0.88
15 3 134 1 0.03
2.2　大白菜与诸葛菜杂交 F1植株的获得
大白菜与诸葛菜属间杂交 , 共杂交 2 870朵花 , 其中胚珠培养 1 279朵 , 田间直接授粉 1 591朵 。
试验结果显示:大白菜与诸葛菜田间直接授粉杂交 , 无法获得种子 。利用胚珠培养 , 以大白菜为母本
杂交获得 31株幼苗 , 经鉴定 16株为真杂种 , 真杂种获得率 51.6%;以诸葛菜为母本杂交 , 则没有
获得杂交种。上述结果表明 , 大白菜与诸葛菜正反交亲和性不同 , 以大白菜为母本的亲和性较高 , 同
时 , 不同的杂交组合获得真杂种的概率不同 (表 2), 获得杂种的数量以 091×566最多 , 说明该组合
亲和性最高 , 育种中应优先选择亲和性高的亲本 。
表 2　大白菜与诸葛菜的杂交亲和性
Table2　Crossing-compatibilitybetweenB.campestrisL.ssp.pekinensisandO.violaceus
杂交组合
Crosscombination
胚珠培养 Ovuleculture
胚珠培养数
Numberofovules
形成幼苗数
Numberofplants
杂种株数
Numberofrealhybrids
杂种获得频率 /%
Rateofobtaininghybrids
383×564 189 1 1 100
083×564 193 1 0 0
403×565 175 3 2 67
089×564 298 2 2 100
091×566 347 21 9 43
041×566 216 1 0 0
107×566 225 2 2 100
诸葛菜 ×大白菜O.violaceus× 3 097 0 0 0
B.campestrisL.ssp.pekinensis
2.3　大白菜 ×诸葛菜杂种 F1的形态特征及育性分析
杂种 F1形态总体介于大白菜 (图 1, a)与诸葛菜 (图 1, b)两亲本之间 , 植株营养生长旺盛 ,
株形开展 , 不包心 , 植株基生叶基部有纵向排列的 1 ～ 5对翅状小叶 (图 1, c), 而茎生叶没有 。叶
表面及叶柄有刺毛 , 叶缘有波褶。生殖生长期分枝十分旺盛 , 浅黄色花 , 比母本大白菜花色浅 , 单枝
花序上的花蕾数目及花蕾大小介于双亲之间 。
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园　　艺　　学　　报 36卷
图 1　大白菜 ×诸葛菜F1植株形态及基因组组成的 GISH鉴定
a.大白菜 383;b.诸葛菜 564;c.杂交种 383×564;d.GISH鉴定。
Fig.1　MorphologicalcharacterofintergeneriehybridplantsbetweenB.campestrisL.ssp.pekinensis383and
O.violaceus564andhybrid383×564andGISHidentificationofgenom
a.B.campestrisL.ssp.pekinensis383;b.O.violaceus564;c.Hybrid383×564;
d.GISHidentificationofgenomiccomponentsofthehybrid.
经醋酸洋红染色 , 可以看出杂种 F1花粉败育 , 花粉粒形状不规则且着色不均匀 (图 2)。田间调
查也表明 , 杂种 F1的花药干瘪 , 无花粉散出 。
图 2　花粉粒着色情况
Fig. 2　ThepigmentationofF1 polengrainsfromB.campestrisL.ssp.pekinensis×O.violaceus
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　10期 乔海云等:大白菜与诸葛菜属间杂交及 GISH鉴定　
2.4　F1植株的基因组原位杂交 (GISH)分析
为分析杂种的染色体组成 , 将诸葛菜总 DNA纯化后 , 直接标记成探针 , 与杂种 F1根尖染色体进
行 GISH分析。如图 1, d所示 , 杂种体细胞具有 22条染色体 , 其中 10条大白菜染色体上没有信号
(显示为蓝色), 而 12条诸葛菜染色体上布满了探针信号 (显示为粉红色), 表明探针 DNA与这些染
色体在 DNA序列上完全吻合 。由此看来 , 杂种 F1的染色体由来自两个亲本的染色体组组成 (A+O=
22)。以此鉴定了胚挽救获得的 31株幼苗 , 其中 16株幼苗的体细胞具有 22条染色体 , 为真杂种;另
外 15株幼苗的体细胞具有 20条染色体 , 为假杂种 。
3　讨论
高等植物远缘杂交普遍存在杂交不结实 , 结实率和结籽率低 , 杂种胚不发育等现象。采用常规方
法进行亲缘关系较远的种 、 属间杂交 , 不易成功 。胚胎挽救方法能有效地克服远缘杂交中的不亲和现
象 (梁青 等 , 2006), 王爱云等 (2006)用子房离体培养的方法提高了属间杂交种产生的频率 。本
试验表明 , 胚珠培养方法亦明显提高了大白菜与诸葛菜属间杂种产生的频率 , 而其中取材的时间也很
关键 , 取授粉后 10 d左右的胚珠培养成活率较高 。总之 , 大白菜与诸葛菜杂交 , 其亲和性较低且表
现不一致 。在授粉的 2 870个花蕾中 , 仅获得 31株再生植株。以大白菜为母本的亲和性远大于以诸
葛菜为母本的亲和性。大白菜不同基因型间亲和性也有一定的差异。吴江生和孟金陵 (1992)在甘
蓝型油菜与芥菜型油菜的远缘杂交中也发现了类似的现象 , 母本基因型分别控制受精指数高低和结实
性强弱。
基因组原位杂交 (GISH)技术在远缘杂种中外源染色质的鉴定方面是一个强有力的工具
(Schwarzacheretal., 1989;Heslop-Harisonetal., 1990;Bennetetal., 1992)。与分子鉴定比较 ,
GISH鉴定更直观 、准确 , 不仅能鉴定出外源染色体是否进入到杂交种中 , 还能鉴定出具体进入几条
染色体。在本试验中 , GISH很好的鉴定了得到的 31个杂交种中的真假杂种 , 真杂种 F1均具有预期
的染色体数 , 含有一套大白菜染色体组和一套诸葛菜染色体组 , 减数分裂时来自大白菜和诸葛菜两个
物种的非同源染色体不能正常配对 , 就不能形成有活力的配子 , 因此杂种表现为不育 。
我们的下一步工作拟通过基因组原位杂交进一步验证杂种染色体的组成及减数分裂时染色体的分
离情况 , 并对大白菜 ×诸葛菜杂种进行持续回交 , 结合开展抗病性鉴定 , 选育出大白菜抗病育种的
“桥梁材料 ”。
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