全 文 ：ISSR标记研究云南产牛奶菜属几种
药用植物的亲缘关系
管志斌，张丽霞，宋美芳，李海涛，张忠廉*
(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)
［摘要］ 目的:分析常用傣药“傣百解”原植物等 9 种云南产牛奶菜属植物种间亲缘关系。方法:应用 ISSR 分子标记技
术。结果:从 60 个 ISSR引物中筛选出 25 个引物用于试验，共扩增出 391 个条带，每个引物检测到的位点为 8 ～ 21，平均每个
引物扩增出 15. 6 个位点;种间遗传相似系数(GS)在 0. 667 5 ～ 0. 821 0;9 种牛奶菜属植物间，傣百解 Marsdenia auricularis sp.
nov. ined. 为通光散 M. tenacissima的近缘种，云南牛奶菜 M. balansae与海枫屯 M. officinalis间的亲缘关系最近。结论:ISSR
结果支持傣百解为牛奶菜属植物，且与通光散近缘，牛奶菜属多种民族药和民间药值得深入研究。
［关键词］ 牛奶菜;傣百解;ISSR;亲缘关系
［稿件编号］ 20120416007
［基金项目］ 中央级公益性科研院所基本科研业务专项(YZYN-10-
02) ;西双版纳州三项经费专项(201107)
［通信作者］ * 张忠廉，Tel:15924692393，E-mail: zzl0605 @
163. com
［作者简介］ 管志斌，助理研究员，研究方向为热带药用植物资源
及植物保护，E-mail:zbguan@ yahoo. com. cn
牛奶菜属 Marsdenia R. Br. ，中国分布有 22 种 5
变种，分布于华东、华中及西南各省区，其中云南省
境内分布有 16 种，2 变种［1］。该属植物傣百解
M. auricularis sp. nov. ined. 、通光散 M. tenacissi-
ma、蓝叶藤 M. tinctoria、大叶牛奶菜 M. koi、海枫屯
M. officinalis 等为傣药或民间常用药，大多具有清
热解毒、止咳平喘、祛风化湿、强壮筋骨等疗效［2-3］，
其中常用傣药“傣百解”，傣名“雅解先打”，傣医药
临床应用普遍，为国药准字品种“雅解片”、“百解胶
囊”等的主要组方药材，该药具有清热解毒，消肿止
痛等功效，用于咽喉肿痛、口舌生疮、疔疖癍疹、肺热
咳嗽、胃脘痛，肺、气管、食道、胃癌变，小便热痛等，
还可用于清除因饮食不洁、用药不当而致的各种不
良反应［3-4］;但该药材及原植物基础研究缺乏，本论
文通过研究傣百解原植物 M. auricularis 及其他 8 种
产于云南的牛奶菜属植物的亲缘关系，确定出傣百
解的近缘物种，并为“傣百解”等傣药的进一步研究
奠定基础，为傣药的鉴别和资源利用提供理论依据。
1 材料
实验所用的 10份材料于野外采集后经本所李海
涛副研究员鉴定，收集当年生新鲜嫩叶，经硅胶快速
干燥后带回实验室内 － 20 ℃低温保存，以备实验所
需。具体材料编号、拉丁名及缩写代码情况见表 1。
表 1 10 份供试材料序号及缩写代码表
Table 1 Ten materials used for test
序号 缩写 种名 拉丁名
1 DY 大叶牛奶菜 Marsdenia koi
2 LG 裂冠牛奶菜 M. incisa
3 TGS 通光散 M. tenacissima
4 QH 球花牛奶菜 M. globifera
5 YN 云南牛奶菜 M. balansae
6 DBJ1 傣百解 M. auricularis
7 LYT 蓝叶藤 M. tinctoria
8 DBJ2 傣百解 M. auricularis
9 YT 圆头牛奶菜 M. tsaiana
10 HFT 海枫屯 M. officinalis
DNA提取试剂盒，Tiangen(DP305) ;ISSR引物，
上海生工生物技术有限公司合成;rTaq DNA聚合酶
(大连宝生物工程有限公司，DR001B)包括:TaKaRa
TaqDNA聚合酶(5 U·μL －1) ，10 × Buffer(Mg2 +
free) ，dNTP mixture(各 2. 5 mmol·L －1) ，MgCl2(25
mmol·L －1) ;Marker，北京鼎国生物技术有限公司
(B031) ;其他试剂均为分析纯。
扩增仪(biometra professional standard) ，电泳仪
(Biometra公司) ，凝胶成像系统(Uvitec公司)
2 方法
2. 1 基因组 DNA的提取 供试材料经灭菌水清洗
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后晒干，将嫩叶剪成碎块状后经液氮充分研磨，按照
DNA快速提取试剂盒所提供方法提取基因组 DNA。
所提 DNA样品经 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，经适
当稀释后 － 20 ℃保存备用。
2. 2 PCR反应 ISSR反应体系(20 μL) :Mg2 + 1. 5
mmol·L －1，dNTP 0. 2 mmol·L －1，引物 0. 2 μmol·
L －1，Taq DNA聚合酶 1 U，PCR buffer 2 μL 和模板
DNA 20 ～ 50 ng，加 dd H2O至 20 μL。
PCR扩增程序:94 ℃预变性 4 min;30 个循环:
94 ℃变性 45 s，50 ～ 55 ℃(因引物序列不同退火温
度不同)退火 45 s，72 ℃延伸 2 min;循环结束后 72
℃延伸 10 min。各取 PCR 反应液 5. 0 μL，加 1. 0
μL缓冲液，在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，电压 100 V，
电泳 90 min，经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像仪
上观察并照相记录。
2. 3 引物筛选 ISSR引物序列按照加拿大哥伦比
亚大学生物技术实验室的引物序列设计，由上海生
工生物技术有限公司合成，共 60 个引物。从 60 个
ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多样性好、重复
性高的 ISSR引物用于样品的遗传多样性分析，每个
选定的引物重复扩增 2 次。每条引物退火温度在
50 ～ 55 ℃进行单独摸索，使之达到最佳扩增效果。
2. 4 数据统计 利用所筛选出的引物扩增所有样
品，实验结果均需扩增和电泳 2 次。针对某一同源
带(同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带)有条
带的记为“1”，无条带的记为“0”，生成 0，1 二态性
数据矩阵。统计多态性位点百分率(PPB) ;根据
Nei’s遗传距离(gene distance，GD)及遗传相似系数
(gene similarity，GS) ，采用 NTSYS-pc 2. 1 分析软件
的 UPGMA(unweighted pair group method with arith-
meticmean)法进行系统聚类分析，构建系统聚类图。
3 结果与分析
3. 1 引物筛选及扩增结果 对 60 个 ISSR 引物进
行筛选，共筛选出 25 个扩增条带较多、谱带清晰、多
态性较好的引物用于 ISSR-PCR 分析，具体引物名
称、序列及其 PCR反应体系的退火温度见表 2，用筛
选出的引物对 10 份供试材料进行 PCR 扩增，并对
扩增片段进行统计分析。结果显示，25 个引物共扩
增出 391 个位点，且每个位点均为多态性位点，即多
态性位点百分率达 100%。由此可知牛奶菜属植物
间丰富的遗传多样性;所扩增位点，其碱基数均在
100 ～ 2 500 bp，每个引物检测到的位点为 8 ～ 21，平
均每个引物扩增出 15. 6 个位点。引物 UBC841 的
扩增图谱，见图 1。
表 2 筛选出的 25 个 ISSR引物序列及其退火温度
Table 2 Twenty-five ISSR primer sequence and their annealing temperature
No. 引物序列 退火温度 /℃ No. 引物序列 退火温度 /℃ No. 引物序列 退火温度 /℃
UBC807 (AG)8 T 52 UBC808 (AG)8 C 54 UBC809 (AG)8G 54
UBC812 (GA)8A 52 UBC814 (CT)8A 52 UBC815 (CT)8G 54
UBC817 (CA)8A 52 UBC818 (CA)8G 54 UBC820 (GT)8 C 54
UBC823 (TC)8 C 54 UBC827 (AC)8G 54 UBC830 (TG)8G 54
UBC834 (AG)8YT 53 UBC835 (AG)8YC 55 UBC840 (GA)8YT 53
UBC841 (AG)8YC 55 UBC842 (GA)8YG 55 UBC844 (CT)8RC 55
UBC848 (CA)8RG 55 UBC849 (GT)8YA 53 UBC851 (GT)8YG 55
UBC855 (AC)8YT 53 UBC856 (AC)8YA 53 UBC859 (TG)8RG 55
UBC860 (TG)8RA 53
3. 2 亲缘关系分析 利用 NTSYS-pc 2. 1 分析软
件的 UPGMA法对 10 份供试材料进行亲缘关系分
析，构建聚类图，所得结果见图 2。利用 NTSYS 软
件计算出 10 份牛奶菜属材料间遗传相似系数
(GS) ，得到供试材料相似性矩阵，9 种植物种间相
似系数范围为 0. 667 5 ～ 0. 821 0。由聚类图可知，
所分析的 9 种牛奶菜属植物间，傣百解 2 个样品非
常相似，并与通光散先聚，后分别与球花牛奶菜、
圆头牛奶菜聚在一起，说明其亲缘关系较近;云南
牛奶菜与海风屯间的相似系数最大，达 0. 821 0，
说明其亲缘关系最近，而大叶牛奶菜和球花牛奶
菜与其他物种关系较远。
4 讨论
通过本实验所构建的 9 种牛奶菜属植物亲缘关
系聚类图可知，傣百解和通光散的亲缘关系最近，从
形态学上，傣百解与通光散也十分相似。傣百解原
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图 1 引物 UBC841 的 ISSR-PCR扩增
Fig. 1 Amplification result of ISSR-PCR with primer UBC841
植物经形态学研究与文献记录该物种来源于萝
藦科南山藤属植物苦绳 Dregea sinensis 不符［3-4］，
应该为牛奶菜属的新物种。本论文的结果和形
态学的研究吻合，支持傣百解原植物为通光散的
近缘种。
本研究组的化学成分研究结果表明傣百解和通
光散具有相似的化学成分组成，提示 2 种植物具有
药效相关性，这 2 个物种是较常用民族药和民间药，
今后将开展较为深入的研究。
图 2 以 Neis遗传距离构建的牛奶菜属植物 ISSR 聚类图
(样品简写见表 1)
Fig. 2 ISSR dendrogram of plants in Marsdensia based on Neis
genetic distance
［参考文献］
［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志 . 第 63 卷
［M］. 北京:科学出版社，1977:442.
［2］ 中国药材公司 . 中国中药资源志要［M］. 北京:科学出版社，
1994:98.
［3］ 林艳芳，依专，赵应红．中国傣医药彩色图谱［M］. 昆明:云南
民族出版社，2003:397.
［4］ 云南省食品药品监督管理局 . 云南省中药材标准 . 傣族药 .
第 1 册［M］. 昆明:云南美术出版社，2005:190.
Genetic relationship on several medicinal plants in
Marsdenia from Yunnan in ISSR marker
GUAN Zhibin，ZHANG Lixia，SONG Meifang，LI Haitao，ZHANG Zhonglian*
(Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Jinghong 666100，China)
［Abstract］ Objective:To analyze the genetic relationship of 9 Marsdenia species from Yunnan，especially the traditional Dai
medicine Dai Bai Jie (M. auricularis). Method:Applying the inter-simple sequence repeats (ISSR)markers technology. Result:
Twenty-five primers were screened out of 60 ISSR random primers and produced 391 bands totally，every primer produce 8-21 bands
and the mean number was 15. 6. The range of the GS(genetic similarity)value was 0. 667 5-0. 821 0. In 9 Marsdenia species，M. au-
ricularis is a relative of M. tenacissima. M. balansae and M. officinalis have the closest genetic relationship. Conclusion:It is suppor-
ted by ISSR that the M. auricularis which is sib species of M. tenacissima，and the folk medicine of Marsdenia are worthy deep investi-
gation and study.
［Key words］ Marsdenia;Marsdenia auricularis;ISSR;genetic relationship
doi:10． 4268 /cjcmm20121109
［责任编辑 吕冬梅］
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