全 文 ：书第３５卷第６期　　　　　　　　　 西 南 大 学 学 报 （自然科学版）　　　　　　　　　　　２０１３年６月
Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｊｕｎ．　２０１３
文章编号：１６７３－９８６８（２０１３）０６－００１５－０７
２３种中国兜兰属植物亲缘关系的ＩＳＳＲ分析①
陈　业，　石建明，　沈文华，　江　辉，　关　萍
贵州大学 生命科学学院，贵阳５５００２５
摘要：利用ＩＳＳＲ分子标记技术对２３种中国兜兰属植物进行种间亲缘关系研究．研究发现：从５０条引物中筛选出
６条引物进行扩增，共扩增出１３６条带，其中多态性条带１３６条，占总条带数的１００％，平均每条引物扩增出的
ＤＮＡ条带数为２２．７条；根据ＩＳＳＲ扩增结果，采用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ２．１０ｅ分析软件进行遗传相似性系数分析，发现２３
种兜兰的遗传相似性系数在０．１４５　５～０．７８０　５之间，平均遗传相似性系数为０．３８３　９；ＵＰＧＭＡ聚类分析发现，在
相似性系数为０．２９２时，２３种兜兰被划分为３个类群，即兜兰亚属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）、宽瓣亚属（Ｂｒａｃｈｙｐｅｔａｌｕｍ）
和小萼亚属（Ｐａｒｖｉｓｅｐａｌｕｍ），与形态学系统分类结果完全一致．
关　键　词：兜兰属；ＩＳＳＲ；聚类分析；亲缘关系
中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ
兜兰又叫“女士拖鞋兰”、“仙履兰”等，是兰科兜兰属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）植物的统称，国家一级保护
植物，有“植物大熊猫”之称，是兰科植物中最具特色的一个类群，也是最奇特的观赏兰花［１－２］，具有极
高的观赏价值和经济价值．全世界约有兜兰属植物６６种，近年来发表１０余个新种，总数增加到８０余
种［３］，据刘仲健等［４］报道原产中国的兜兰种类已达２７种．长期以来，人们对兜兰过度追逐而进行的毁灭
性采挖，使不少种类已经到了灭绝的边缘［５］．各种兜兰由于不同地域的相互引种栽培，出现了许多同物
异名和同名异物的现象，品种名和品种分类十分混乱．因此，对现有兜兰品种准确的鉴定和分析十分重
要．将ＩＳＳＲ分子标记技术应用于兜兰属植物的亲缘关系研究，可为兜兰的分类提供分子水平的证据，
并能克服许多弊端，对其保护策略和措施的制定具有重要的意义．目前对兜兰属植物的研究主要集中于
系统演化、生态地理、形态学、细胞生物学和传粉生物学等方面［６］，有关分子生物学方面的研究报道较
少．Ａｎｔｏｎｙ　Ｖ　Ｃｏｘ等［７］应用核ｒＤＮＡ的ＩＴＳ核苷酸序列数据对中国兜兰属１５个原生种进行划分；孙彩
云等［８］应用ＲＡＰＤ和同工酶分子标记技术分析中国兜兰种间亲缘关系．而利用ＩＳＳＲ进行兜兰属植物亲
缘关系分析的研究未见报道．
ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ，简单序列重复间区）分子标记是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［９］于１９９４年提出
的一种ＤＮＡ分子标记技术，其引物设计比ＳＳＲ技术简单，又可揭示比ＲＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＳＳＲ更高的多态性，
具有ＤＮＡ用量少、操作简单、快速灵敏、实验成本低等优点，并呈孟德尔式遗传［１０］，目前已广泛用于植物
品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性分析、生物进化及分子生态学等方面的研究［１１－１５］．本试验采
① 收稿日期：２０１２－１０－０９
基金项目：贵州省自然科学基金资助项目（黔科合Ｊ字（２００８）２２６７号）．
作者简介：陈　业（１９８５－），男，贵州毕节人，硕士研究生，主要从事发育分子生物学方面的研究．
通信作者：关　萍，博士，教授．
DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2013.06.028
用ＩＳＳＲ分子标记技术，从分子水平探讨了２３种中国兜兰属植物的亲缘关系，旨在为兜兰资源的合理保护
利用和新品种的培育提供科学依据，并为兜兰指纹图谱的构建、分类鉴定和品种鉴别奠定理论基础．
１　材料与方法
１．１　材　料
将收集到的２３种中国兜兰属植物种植于贵州大学植物标本园，供试材料名称及来源见表１．
表１　研究材料及来源
编号 物种 拉丁文名 标本来源 凭证标本
１ 带叶兜兰 Ｐ．ｈｉｒｓｕｔｉｓｓｉｍｕｍ 贵州望谟 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＺ２０１１０９２７
２ 杏黄兜兰 Ｐ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ 云南碧江 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＺ２０１２０２２９
３ 硬叶兜兰 Ｐ．ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ 贵州荔波 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０４１６
４ 紫毛兜兰 Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１２０４１８
５ 紫纹兜兰 Ｐ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｍ 云南六库 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０４１０
６ 文山兜兰 Ｐ．ｗｅｎｓｈａｎｅｎｓｅ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０９３１
７ 长瓣兜兰 Ｐ．ｄｉａｎｔｈｕｍ 贵州兴义 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＺ２０１１１１０６
８ 巨瓣兜兰 Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ 广西河池 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＸ２０１１０７１５
９ 麻栗坡兜兰 Ｐ．ｍａｌｉｐｏｅｎｓｅ 广西隆林 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＸ２０１１１２２６
１０ 亨利兜兰 Ｐ．ｈｅｎｒｙａｎｕｍ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１２０３１１
１１ 同色兜兰 Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ 贵州兴义 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＧＺ２０１１０８１４
１２ 天伦兜兰 Ｐ．ｔｒａｎｌｉｅｎｉａｎｕｍ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０８０３
１３ 飘带兜兰 Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０４０５
１４ 格力兜兰 Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０６０９
１５ 白花兜兰 Ｐ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ 云南马关 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０５０１
１６ 彩云兜兰 Ｐ．ｗａｒｄｉｉ 云南麻栗坡 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０６１２
１７ 海伦兜兰 Ｐ．ｈｅｌｅｎａｅ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１１１０４
１８ 红旗兜兰 Ｐ．ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈｉｉ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０６２２
１９ 小叶兜兰 Ｐ．ｂａｒｂｉｇｅｒｕｍ 云南麻栗坡 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０６０８
２０ 汉氏兜兰 Ｐ．ｈａｎｇｉａｎｕｍ 云南文山 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１１０１７
２１ 德氏兜兰 Ｐ．ｄｅｌｅｎａｔｉｉ 云南富宁 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０９２４
２２ 根茎兜兰 Ｐ．ａｒｅｅａｎｕｍ 云南思茅 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１２０３１９
２３ 白旗兜兰 Ｐ．ｓｐｉｃｅｒｉａｎｕｍ 云南思茅 陈业（Ｙ．Ｃｈｅｎ）ＹＮ２０１１０５３５
１．２　基因组ＤＮＡ的提取及检测
参照改进的ＣＴＡＢ法［１６］提取总基因组ＤＮＡ．用０．８％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度
和纯度，ＴＥ缓冲液稀释所提取的ＤＮＡ至４０ｎｇ／μＬ，放入—２０℃冰箱保存备用．
１．３　引物筛选及ＰＣＲ扩增
采用的引物系列参照加拿大哥伦比亚大学ＵＢＣ公司公布的第９套ＩＳＳＲ引物序列，由南京金斯瑞生物
科技有限公司合成．随机选取３份不同兜兰品种的ＤＮＡ样品混匀，从５０条ＩＳＳＲ引物中筛选出扩增条带
清晰、多态性高、重复性好的引物进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增．反应产物以１００ｂｐ的 Ｍａｒｋｅｒ做为分子量标准．
经过优化比较，获得兜兰属植物最佳ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应体系为：总体积２５μＬ，１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
２．５μＬ，Ｍｇ
２＋浓度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ浓度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ，引物浓度０．６μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量
１．０Ｕ（均购自天根生化（北京）有限公司），模板ＤＮＡ用量４０ｎｇ．反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃
变性３０ｓ；在相应的退火温度退火４５ｓ；７２℃延伸２ｍｉｎ；共４０个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存．
ＰＣＲ产物用２．０％的琼脂糖凝胶电泳检测．凝胶中含有０．０５％的溴化乙锭，电极缓冲液为１×ＴＡＥ，
电压不超过５Ｖ／ｃｍ，在Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝胶成像系统上观察并拍照保存．
６１ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷
１．４　引物退火温度的确定
根据筛选出的引物序列的理论退火温度，设定退火梯度为（Ｔｍ±５）℃，利用Ｂｉｏ－Ｒａｄ梯度ＰＣＲ扩增
仪对筛选出的引物退火温度进行优化筛选，仪器自动生成１～８个梯度，最终确定最佳退火温度．
１．５　数据统计及分析
ＩＳＳＲ为显性标记，电泳图谱中的每一条带被视为一个分子标记．同一引物扩增产物中电泳迁移率一致
的条带被认为具有同源性．根据扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，对ＩＳＳＲ电泳胶图进行人工读带，以１００ｂｐ
ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ为分子量标准，对同一位置上ＤＮＡ带的有无进行统计，有带（包括弱带）赋值为“１”，无带赋值
为“０”，形成０，１矩阵．采用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１０ｅ软件的Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ｄａｔａ进行矩阵分析，ＳＡＨＮ　Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ进
行相似性系数计算，并通过非加权配对算术平均法（ｔｈｅ　ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｐａｒｅ－ｇｒｏｕｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ　ａｖ－
ｅｒａｇｅｓ，ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，构建系统树．
２　结果与分析
２．１　各种间ＩＳＳＲ多态性
从５０条ＩＳＳＲ引物中筛选出扩增条带清晰、多态性高、重复性好的６条引物对２３种中国兜兰属植物
进行ＩＳＳＲ分析（表２）．由表２知，６条引物中，（ＴＣ）ｎ一条，（ＧＡＣＡ）ｎ一条，（ＧＡ）ｎ２条，（ＡＧ）ｎ２条，说
明兜兰基因组中存在着大量的（ＧＡ）、（ＡＧ）二核苷酸重复序列．６条引物共扩增出１３６条ＤＮＡ条带，其中
多态性条带１３６条，占总条带数的１００％，每个引物扩增出的ＤＮＡ条带数在１７～２５之间，平均２２．７条，
扩增条带数最多的引物为ＵＢＣ－８３４，达２５条，扩增条带数最少的引物为ＵＢＣ－８４０，达１７条．扩增的ＤＮＡ
片段大小主要集中的２００～１　５００ｂｐ之间（图１）．从图１可以看出，选择其中任何一条引物就可以将２３种
兜兰基本分开．以上数据表明，兜兰种间在分子水平上的多态性是比较丰富的，利用ＩＳＳＲ分子标记能够进
行兜兰属植物的种质资源鉴定和亲缘关系的分析．
表２　用于ＩＳＳＲ分析的６条引物及其扩增产物
引物 序列 退火温度／℃ 扩增条带数 多态性条带 多态性百分率／％
ＵＢＣ－８２４ （ＴＣ）８ＣＧ　 ４９．１　 ２４　 ２４　 １００
ＵＢＣ－８３４ （ＡＧ）８ＹＴ　 ５４．２　 ２５　 ２５　 １００
ＵＢＣ－８３５ （ＡＧ）８ＹＣ　 ５６．２　 ２４　 ２４　 １００
ＵＢＣ－８４０ （ＧＡ）８ＹＴ　 ５７．３　 １７　 １７　 １００
ＵＢＣ－８４２ （ＧＡ）８ＹＧ　 ５８　 ２３　 ２３　 １００
ＵＢＣ－８７３ （ＧＡＣＡ）４ ５１　 ２３　 ２３　 １００
平均 ５４．３　 ２２．７　 ２２．７　 １００
总计 ６　 １３６　 １３６　 １００
　　注：Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）．
２．２　各种间的遗传相似性分析
利用６条ＩＳＳＲ引物产生的标记信息，经ＮＴＳＹＳ－ｐｃ２．１０ｅ分析软件计算２３种兜兰种间的遗传相似性
系数（表３），结果表明，２３种兜兰的遗传相似性系数在０．１４５　５～０．７８０　５之间，平均遗传相似性系数为
０．３８３　９．从表３可以看出白花兜兰（Ｐ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）和巨瓣兜兰（Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ）的遗传相似系数最小，为
０．１４５　５，说明两者的亲缘关系最远，遗传差异相对较大，它们的形态特征差别也比较大；亨利兜兰（Ｐ．
ｈｅｎｒｙａｎｕｍ）和天伦兜兰（Ｐ．ｔｒａｎｌｉｅｎｉａｎｕｍ）之间的遗传相似系数最大为０．７８０　５，说明这两者间的亲缘关
系最近，遗传差异相对较小；巨瓣兜兰（Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ）和同色兜兰（Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ）、紫毛兜兰（Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ）
和格力兜兰（Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ）、长瓣兜兰（Ｐ．ｄｉａｎｔｈｕｍ）和飘带兜兰（Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ）之间的遗传相似性系数
分别为０．５９０　２，０．６３８　９和０．６４５　２，说明其相互之间亲缘关系比较近．
７１第６期　　　　　　　 　陈　业，等：２３种中国兜兰属植物亲缘关系的ＩＳＳＲ分析
Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ：１－２３处理编号同表１．
图１　引物ＵＢＣ－８２４，ＵＢＣ－８３４，ＵＢＣ－８３５，ＵＢＣ－８４０，ＵＢＣ－８４２，ＵＢＣ－８７３对不同兜兰的ＩＳＳＲ扩增结果
２．３　各种间的聚类分析
为了确定各供试材料之间的遗传关系，通过ＩＳＳＲ遗传距离矩阵按 ＵＰＧＭＡ进行聚类分析，构建树状
聚类图（图２）．从图２可以看出，相似性系数为０．２９２时，所有供试种被分为３个类群．第一个类群包括１４
个种：带叶兜兰（Ｐ．ｈｉｒｓｕｔｉｓｓｉｍｕｍ）、紫毛兜兰（Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ）、格力兜兰（Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ）、亨利兜兰
（Ｐ．ｈｅｎｒｙａｎｕｍ）、天伦兜兰（Ｐ．ｔｒａｎｌｉｅｎｉａｎｕｍ）、小叶兜兰（Ｐ．ｂａｒｂｉｇｅｒｕｍ）、海伦兜兰（Ｐ．ｈｅｌｅｎａｅ）、红
旗兜兰（Ｐ．ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈｉｉ）、白旗兜兰（Ｐ．ｓｐｉｃｅｒｉａｎｕｍ）、根茎兜兰（Ｐ．ａｒｅｅａｎｕｍ）、长瓣兜兰（Ｐ．ｄｉａｎ－
ｔｈｕｍ）、飘带兜兰（Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ）、紫纹兜兰（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｍ）、彩云兜兰（Ｐ．ｗａｒｄｉｉ）；第二个类群包括３个
种：文山兜兰（Ｐ．ｗｅｎｓｈａｎｅｎｓｅ）、巨瓣兜兰（Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ）、同色兜兰（Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ）；第三大类包括６个
种：杏黄兜兰（Ｐ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）、硬叶兜兰（Ｐ．ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ）、德氏兜兰（Ｐ．ｄｅｌｅｎａｔｉｉ）麻栗坡兜兰（Ｐ．
ｍａｌｉｐｏｅｎｓｅ）、白花兜兰（Ｐ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、汉氏兜兰（Ｐ．ｈａｎｇｉａｎｕｍ）．表明几个大类之间的遗传差异比较大．
从聚类图也可以看出，亨利兜兰（Ｐ．ｈｅｎｒｙａｎｕｍ）和天伦兜兰（Ｐ．ｔｒａｎｌｉｅｎｉａｎｕｍ）、长瓣兜兰（Ｐ．ｄｉａｎ－
ｔｈｕｍ）和飘带兜兰（Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ）、紫毛兜兰（Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ）和格力兜兰（Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ）、巨瓣兜兰（Ｐ．
ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ）和同色兜兰（Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ）之间的亲缘关系比较近，形态特征差异也比较小．
８１ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷
表３　２３种中国兜兰属植物的遗传相似系数
序号 １　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　 １０　 １１　 １２　 １３　 １４　 １５　 １６　 １７　 １８　 １９　 ２０　 ２１　 ２２　 ２３
１　Ｐ．ｈｉｒｓｕｔｉｓｓｉｍｕｍ １．０００　０
２　Ｐ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ　０．２１４　３　１．０００　０
３　Ｐ．ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ　０．２５０　０　０．５００　０　１．０００　０
４　Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ　 ０．３３３　３　０．２４１　４　０．２７２　７　１．０００　０
５　Ｐ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｍ　０．３７０　４　０．２０６　９　０．２１２　１　０．３９２　９　１．０００　０
６　Ｐ．ｗｅｎｓｈａｎｅｎｓｅ　０．３１０　３　０．３５４　９　０．２２８　６　０．３００　０　０．２３３　３　１．０００　０
７　Ｐ．ｄｉａｎｔｈｕｍ　 ０．２１０　５　０．２２９　５　０．２６０　９　０．３３９　０　０．３３９　０　０．３８１　０　１．００００
８　Ｐ．ｍａｌｉｐｏｅｎｓｅ　 ０．１６６　６　０．３１２　５　０．３８８　９　０．２５８　１　０．１９３　５　０．２４２　４　０．３６９　２　１．０００　０
９　Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ　 ０．２５０　０　０．２３３　３　０．２３５　３　０．２４１　４　０．１７２　４　０．５１６　１　０．２９５　１　０．３４３　８　１．０００　０
１０　Ｐ．ｈｅｎｒｙａｎｕｍ　０．３６３　６　０．３１４　３　０．２３０　８　０．３８２　４　０．３２３　５　０．３３３　３　０．３９４　４　０．４３２　４　０．３７１　４　１．０００　０
１１　Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ　 ０．２８０　７　０．３６０　７　０．１７３　９　０．２７１　２　０．２３７　３　０．５０７　９　０．２５８　１　０．２７６　９　０．５９０　２　０．３６６　２　１．０００　０
１２　Ｐ．ｔｒａｎｌｉｅｎｉａｎｕｍ０．３８２　４　０．３３３　３　０．１７５　０　０．３７１　４　０．４００　０　０．３２４　３　０．３５６　１　０．３４２　１　０．２５０　０　０．７８０　５　０．３２８　８　１．０００　０
１３　Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ　 ０．２１０　５　０．２２９　５　０．３１８　８　０．３０５　１　０．３３９　０　０．２２２　２　０．６４５　２　０．３０７　７　０．２６２　３　０．２８１　７　０．１６１　３　０．３８３　６　１．０００　０
１４　Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ０．３１４３　０．２１６２　０．２６８　３　０．６３８　９　０．３０５　６　０．２６３　２　０．４２６　７　０．２８２　１　０．２７０　３　０．５００　０　０．２９３　３　０．５３４　９　０．４８０　０　１．０００　０
１５　Ｐ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ　 ０．２３５　３　０．３２７　３　０．３１７　５　０．２６４　２　０．２６４　２　０．２４５　６　０．２５０　０　０．３３９　０　０．１４５　５　０．３３８　５　０．２１４　３　０．２６８　７　０．２８５　７　０．２３１　９　１．０００　０
１６　Ｐ．ｗａｒｄｉｉ　 ０．２７５　９　０．１６１　３　０．１７１　４　０．２６６　６　０．４００　０　０．３１２　５　０．３４９　２　０．２７２　７　０．３２２　６　０．３８８　９　０．３８１　０　０．４０５　４　０．２２２　２　０．３１５　８　０．２１０　５　１．０００　０
１７　Ｐ．ｈｅｌｅｎａｅ　 ０．３４２　１　０．２２５　０　０．２７２　７　０．３８４　６　０．３３３　３　０．３９０　２　０．３７０　４　０．３５７　１　０．３２５　０　０．５７７　８　０．３７０　４　０．６３０　４　０．３７０　４　０．５７４　５　０．２９３　３　０．３９０　２　１．０００　０
１８　Ｐ．ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈｉｉ０．２５４　５　０．３３９　０　０．２６８　７　０．２８０　７　０．２４５　６　０．２２９５　０．２００　０　０．２５４　０　０．３０５　１　０．４３４　８　０．４００　０　０．５０７　０　０．３００　０　０．３２８　８　０．２９６　３　０．２６２　３　０．５０６　３　１．０００　０
１９　Ｐ．ｂａｒｂｉｇｅｒｕｍ　０．３３８　５　０．４０５　８　０．２８５　７　０．４１７　９　０．２９８　５　０．３３８　０　０．３４２　９　０．３５６　２　０．２６０　９　０．６０７　６　０．３４２　９　０．６６６　７　０．４２８　６　０．５３０　１　０．３４３　８　０．３０９　９　０．６０６　７　０．４４１　２　１．０００　０
２０　Ｐ．ｈａｎｇｉａｎｕｍ　０．３１３　７　０．２５４　５　０．３１７　５　０．２６４　２　０．２２６　４　０．２８０　７　０．２１４　３　０．３７２　９　０．２５４　５　０．３６９　２　０．２１４　３　０．３５８　２　０．２１４　３　０．２６０　９　０．４４０　０　０．２１０　５　０．３４６　７　０．３７０　４　０．３４３　８　１．００００
２１　Ｐ．ｄｅｌｅｎａｔｉｉ　 ０．２０９　０　０．３３８　０　０．３７９　７　０．２６０　９　０．２３１　９　０．３２８　８　０．１９４　４　０．２９３　３　０．２５３　５　０．２４６　９　０．２７７　８　０．２４１　０　０．２２２　２　０．２５８　８　０．３０３　０　０．１９１　８　０．３９５　６　０．３４２　９　０．２７５　０　０．２７２　７　１．０００　０
２２　Ｐ．ａｒｅｅａｎｕｍ　 ０．４１１　８　０．３０５　６　０．３２５　０　０．３７１　４　０．２２８　６　０．２９７　３　０．３２８　８　０．２３６　８　０．２７７　８　０．４１４　６　０．２７４　０　０．４５２　４　０．３０１　４　０．４８８　４　０．２６８　７　０．３７８　４　０．４３４　８　０．３６６　２　０．４６９　１　０．１７９　１　０．２８９　２　１．０００　０
２３　Ｐ．ｓｐｉｃｅｒｉａｎｕｍ　０．２７６　９　０．３１８　８　０．３８９　６　０．３８８　１　０．２９８　５　０．３３８　０　０．３４２　９　０．３５６　２　０．２８９　９　０．４０５　１　０．３１４　３　０．４９３　８　０．３４２　９　０．４３３　７　０．３７５　０　０．３６６　２　０．４７１　９　０．４４１　２　０．４６１　５　０．２５０　０　０．４２５　０　０．４４４　４　１．０００　０
图２　根据ＩＳＳＲ结果构建的２３种兜兰亲缘关系树状图
３　讨　论
Ｃｒｉｂｂ［１７］把兜兰属划分为３个亚属，分别为宽瓣亚属（Ｂｒａｃｈｙｐｅｔａｌｕｍ）、小萼亚属（Ｐａｒｖｉｓｅｐａｌｕｍ）和兜
兰亚属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）；兜兰亚属又分为多花型亚组（Ｃｏｒｙｏｐｅｄｉｌｕｍ）、长瓣兜兰组（Ｐａｒｄａｌｏｐｅｔａｌｕｍ）、
续花型亚组（Ｃｏｃｈｌｏｐｅｔａｌｕｍ）、兜兰组（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）和毛梗兜兰组（Ｂａｒｂａｔａ）５个组．陈心启［１８］根据叶
９１第６期　　　　　　　 　陈　业，等：２３种中国兜兰属植物亲缘关系的ＩＳＳＲ分析
上表面是否有网格斑把中国兜兰属植物１８个原生种划分为２个亚属，即兜兰亚属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）和宽瓣
亚属（Ｂｒａｃｈｙｐｅｔａｌｕｍ）．Ａｎｔｏｎｙ　Ｖ　Ｃｏｘ等［７］应用核ｒＤＮＡ的ＩＴＳ核苷酸序列对中国兜兰属１５个原生种进
行划分，其结果与Ｃｒｉｂｂ的传统分类基本一致．孙彩云等［８］对中国兜兰种间亲缘关系的研究显示，ＲＡＰＤ
和同工酶２种手段对种间亲缘关系的划分与传统分类大致吻合，同工酶比ＲＡＰＤ的结果更接近传统分类，
据据ＲＡＰＤ与同工酶的研究结果，认为兜兰亚属需进一步分组，彩云兜兰、卷萼兜兰、紫纹兜兰及其变种
云南虎皮应自成一个组，白花兜兰和同色兜兰的真正分类学位置应如何确定尚需进一步研究．
从分子水平来说，遗传距离的变幅越大，说明其遗传分化越大；遗传多样性高，表明遗传背景复杂，该
物种存在的历史长远［１９］．本研究筛选出的６条ＩＳＳＲ引物扩增条带多态性较高，重复性和稳定性较好，共
扩增出１３６条ＤＮＡ条带，其中多态性条带１３６条，多态性比率达１００％，表现出不同种间丰富的多态性，
说明各供试材料之间存在较大的遗传差异；分析各种引物的谱带发现，仅用一种引物就能将２３种兜兰完全
区分出来，表明种间遗传背景相对较远．遗传相似性系数在０．１４５　５～０．７８０　５之间，平均遗传相似性系数
为０．３８３　９，反映了遗传差异的实质，说明ＩＳＳＲ分子标记能有效揭示兜兰属植物种间的遗传差异，可以用
于兜兰种间关系的研究，也说明在遗传进化过程中，其基因组ＤＮＡ发生丰富的变异，从而构成丰富的兜
兰资源基因库．从聚类图可以看出，ＩＳＳＲ标记能够准确的将２３种中国兜兰属植物划分为小萼亚属（Ｐａｒ－
ｖｉｓｅｐａｌｕｍ）、宽瓣亚属（Ｂｒａｃｈｙｐｅｔａｌｕｍ）和兜兰亚属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）３个亚属，兜兰亚属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉ－
ｌｕｍ）再划分为长瓣兜兰组（Ｐａｒｄａｌｏｐｅｔａｌｕｍ）、兜兰组（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ）和毛梗兜兰组（Ｂａｒｂａｔａ）３个组，与
Ｃｒｉｂｂ［１７］和陈心启［１８］的形态学传统分类完全一致．同色兜兰（Ｐ．ｃｏｎｃｏｌｏｒ）和巨瓣兜兰（Ｐ．ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ）在遗
传相似性系数为０．５８２处聚为一支，再与文山兜兰（Ｐ．ｗｅｎｓｈａｎｅｎｓｅ）聚于０．５１２处，长瓣兜兰（Ｐ．ｄｉａｎ－
ｔｈｕｍ）和飘带兜兰（Ｐ．ｐａｒｉｓｈｉｉ）遗传相似性系数为０．６４０处聚为一支，紫毛兜兰（Ｐ．ｖｉｌｌｏｓｕｍ）和格力兜兰
（Ｐ．ｇｒａｔｒｉｘｉａｎｕｍ）聚于０．６３３处，说明亲缘关系较近，形态学差异也较小，与刘仲健［２０］等的观点一致，说
明分子证据与形态特征是吻合的．
本试验首次将ＩＳＳＲ标记技术应用于兜兰亲缘关系研究中，结果表明，该技术操作简单、多态性高、稳
定性可靠．６条引物都能独立的将２３种兜兰属植物区分开，可用于该属植物的分类鉴定，为兜兰种质资源
保护及种间亲缘关系分析与遗传多样性分析、兜兰ＤＮＡ指纹图谱的构建及杂交育种等方面的研究提供理
论依据，也为传统的形态学分类提供了分子水平的证据．
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Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　２３
ＰａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍＳｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　Ｗｉｔｈ　ＩＳＳＲ　Ｍａｒｋｅｒｓ
ＣＨＥＮ　Ｙｅ，　ＳＨＩ　Ｊｉａｎ－ｍｉｎｇ，　ＳＨＥＮ　Ｗｅｎ－ｈｕａ，
ＪＩＡＮＧ　Ｈｕｉ，　ＧＵＡＮ　Ｐｉｎｇ
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００２５，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　２３　Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．Ｆｒｏｍ　５０ｐｒｉｍｅｒｓ　６ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｆｏｒ　ａｍ－
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１３６ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ，ａｌ　ｂｅｉｎｇ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＤＮＡ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅａｃｈ　ｐｒｉｍｅｒ　ｗａｓ　２２．７．Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＮＴＳＹＳｐｃ２．１０ｅ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　２３　Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　０．１４５　５ｔｏ　０．７８０　５，ａｖｅｒａｇｉｎｇ
０．３８３　９．ＵＰＧＭＡ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　２３　Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐａｐｈｉｏ－
ｐｅｄｉｌｕｍ，Ｂｒａｃｈｙｐｅｔａｌｕｍａｎｄ　Ｐａｒｖｉｓｅｐａｌｕｍ）ａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　０．２９２，ａ　ｒｅｓｕｌｔ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ；ＩＳＳＲ；ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
责任编辑　胡　杨　　　　
１２第６期　　　　　　　 　陈　业，等：２３种中国兜兰属植物亲缘关系的ＩＳＳＲ分析