全 文 ：现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress inModern Biomedicine Vol.14 NO.14 MAY.2014
开唇兰属植物的种间蛋白质组差异 *
李雅潇 1 高 川 2△ 张 军 3
(1武警后勤学院药物化学教研室天津市职业与环境危害防制重点实验室 天津 300162；
2北京药物化学研究所 北京 102205；3 解放军 306医院 北京 100101)
摘要 目的：通过差异蛋白峰的比较和指纹图谱的对照，分析开唇兰属五种金线莲的种间蛋白质组差异,初步探索了这种差异在
品种鉴定中的应用并推断出品种之间的亲疏关系。方法：采用 SELDI-TOF-MS方法研究了开唇兰属五种金线莲的种间蛋白质组
差异。结果：通过 SELDI-TOF-MS方法对开唇兰属五种金线莲种间蛋白质组谱图进行的分析结果表明，属内种间存在蛋白质组差
异和特征蛋白质峰，据此建立了属内五种植物的蛋白质组指纹图谱，并依据蛋白质组的差异推测了属内五种金线莲的亲疏关系。
结论：依据 SELDI-TOF-MS鉴定结果，找到了开唇兰属五个物种间的蛋白差异，并基于差异蛋白数据分析了品种遗传变异性，结
果表明地域和气候会对品种的变异产生一定的影响。
关键词：金线莲；SELDI；蛋白质组；指纹图谱
中图分类号：Q945.79 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2014）14-2661-06
Proteomic Difference of Anoectochilus Interspecies*
LI Ya-xiao1, GAO Chuan2△, ZHANG Jun3
(1 Medical Collage of Chinese Peoples Armed Police Force, Tianjin, 300162, China;
2 Research Institute of Pharmaceutical Chemistry, Beijing, 102205, China; 3 The 306th Hospital of PLA, Beijing, 100101, China)
ABSTRACT Objective: To study the proteomic difference of Anoectochilus interspecies by the mean of comparing the differences
of proteomic finger printings, and to explore preliminary the application of the proteomic differences in species identification. Methods:
The proteomic difference of Anoectochilus interspecies are studied by means of surface enhanced laser desorption ionization time of
flight mass spectrography. Result: Results showed that there are proteomic differences and specific proteins peaks among Anoectochilus
interspecies. Moreover, proteomic finger printings of five Anoectochilus species are established for identifying species, and genetic
relationships of five species within Anoectochilus have been deduced according to the proteomic differences among five species.
Conclusion: According to the result of SELDI-TOF-MS, the proteomic differences of Anoectochilus interspecis were discovered. The
analysis based on the proteomic differences shows the effect on the interspecies variation by location and climate.
Key words: Anoectochilus; SELDI; Proteome; Finger printings
Chinese Library Classification(CLC): Q945.79 Document code: A
Article ID: 1673-6273（2014）14-2661-06
*基金项目：武警后勤学院青年基金（WYQ201106）
作者简介：李雅潇（1983-），女，硕士，讲师，主要从事药物化学和蛋白质组学研究，
E-mail：liyaxiaopalmer@163.com
△通讯作者：高川，E-mail：g.ch.chuan@263.net
(收稿日期：2013-12-14 接受日期：2014-01-10)
doi: 10.13241/j.cnki.pmb.2014.14.013
前言
开唇兰属（Anoectochilus）是兰科（Orchidaceae）鸟巢兰簇
（Trib.Neottieae）斑叶兰亚簇（subteib.Goodyerinae）下 27个属之
一。该属植物约有 40余种，分布于亚洲热带地区至大洋洲。我
国有 20种，2个变种，产于西南部至南部。该属植物作药用的
主要有：台湾金线莲（A.formosanus）、恒春金线莲（A.koshunens-
is）和福建金线莲（A.roxburghii）[1-3]，民间素有“药王”、“金草”之
美誉[4]，主要用于治疗高血压、糖尿病、心脏病、肺炎、急慢性肝
炎、肾炎等疾病。
长期以来，形态学特征一直是系统发育研究的主要数据来
源。但由于野生金线莲分布较窄，天然蕴藏量极为稀少[3,5]，野外
采集时往往与花期失之交臂从而导致无法用传统鉴定方法来
进行种间的鉴定。随着植物分子系统学的发展，核糖体 DNA的
ITS（Internal Transcribed Spacer）序列已成为被子植物系统与进
化研究中的重要分子标记，广泛应用于被子植物属内、近缘属
间及科内的系统发育研究[6]。与此同时，基于双向电泳技术的蛋
白质组研究也应用于近缘属、种间的遗传进化和分类。如通过
分析栽培小麦与野生品种的蛋白差异确定栽培种的起源[7]、通过
对不同小麦品种间[8]或多点种植的小麦群体间[9]的蛋白差异研
究品种间的遗传差异。除小麦外，用 2-D分离的蛋白标记鉴定
品种(或亚种)[10,11]在其他物种如水稻[12]、甘蔗[13]、辣椒[14]上均有报
道。
生物技术可以快速鉴定感兴趣的蛋白标记，以此建立品种
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鉴定的新方法。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（Surface
Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spect-
rography, SELDI-TOF-MS）技术是一项全新的蛋白质组学研究
方法，具有简单快速、灵敏、高通量等优点，是蛋白质双向电泳
的补充，已用于检测在特定疾病中特殊表达的蛋白标志物而诊
断疾病[15]。
本实验采用 SELDI-TOF-MS技术比对了经 ITS序列鉴定
属于开唇兰属（Anoectochilus）的台湾金线莲（Anoectochilus
formosanus）、福建金线莲（Anoectochilus roxburghii）、文山、云
南金线莲 1和云南金线莲 2五种已命名和未系统命名的金线
莲的蛋白质组间差异，并由此建立了蛋白质组指纹图谱，初步
探索了其在品种鉴定中的应用以及品种之间的亲疏关系。实验
结果表明，这种基于蛋白质组学的鉴定方法对于物种的种间鉴
定具有较强的特异性，可作为传统鉴定方法的有力补充。由鉴
定结果得出的品种间亲疏关系，也可推论印证了气候差异和自
然选择对品种的分化和变异的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
实验材料：台湾、福建、文山、云南 1、云南 2的组织培养苗
共五种，文中分别记为 TW、FJ、WS、YN1和 YN2。
主要试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、三氯乙酸（TCA）、二硫
苏糖醇（DTT）、尿素、3-[3-胆酰胺基丙基 -二甲氨基]丙磺酸盐
（CHAPS）试剂为美国 Gibco公司产品；2-D Quant Kit蛋白定量
试剂盒为瑞典 Amersham产品；丙醇、乙醇等为市售分析纯。
主要仪器：MasterCycleer gradient AG 22331 PCR仪，德国
Eppendorf公司；蛋白飞行质谱仪(（PBS IIc），即表面增强激光
解吸电离飞行时间质谱仪（SELDI-TOF）、化学修饰 CM10芯
片，美国 Ciphergen公司；Centrifuge 5810r高速台式冷冻离心
机，德国 Eppendorf公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司
产品。
1.2 方法
1.2.1 植物总蛋白的提取和定量 组织培养的五种金线莲生长
约 8-10 cm时，取出洗净根部附带的固体培养基，称重约 1-2 g，
在预冷的研钵中加入液氮，研磨成粉末。按 Damerval[16]提供的
方法提取蛋白质样品。具体为：按样品重量加入 4倍体积的样
品提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，内含 2%聚乙烯吡咯烷
酮，10 %甘油，10 mmol/LEDTA-Na2，5% DTT），置冰上半小时
后，12000×g离心 30分钟，取上清，在上清中加入 8-10倍体积含
10% TCA和 5 % DTT的冷丙酮，-20℃放置至少 2 h后，于 4
℃、12000×g离心 1 h，弃上清。沉淀用含 1% DTT和 1 mmol/L
PMSF的冷丙酮重悬，4℃、12000×g离心 30 min，重复此步骤
1次；-20℃挥干沉淀中残留的丙酮，即为 SELDI检测所需蛋白
质粉。
FJ: Anoectochilus roxburghii; TW: Anoectochilus formosanus;
WS: Anoectochilus Xizang; YN1:Anoectochilus Yunnan1 YN2:Anoectochilus Yunnan2
图 1 五种金线莲的蛋白质组峰形图
Fig.1 Proteomic Chromatogram of different species of Anoectochilus roxburghii
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称取 10 mg蛋白粉，溶于 500 μL蛋白裂解液中（9.5 mol/L
尿素、2 % CHAPS、1% DTT），于 4℃、12000×g离心 30 min，
取上清重复此步骤 1次，上清即为 SELDI检测样品。以已知精
确浓度的BSA为标准，按 2-DQuantKit试剂盒提供的方法定量。
1.2.2 上样与洗脱 将蛋白芯片装入处理器中，每孔加入 200
μL结合缓冲液，室温振荡洗涤 2次，每次 5 min，甩干。每孔分
别加入 100 μL样品混合液，振荡孵育 1 h，甩去样品，用 200 μL
洗脱缓冲液（100 mmol/L NaAc，pH 4.0）室温振荡洗涤 2次，每
次 5 min，甩干；再用去离子水洗涤一次，立即甩干。拆开处理
器，取出芯片，晾干后即可上机测量。
1.2.3 数据采集和分析 采用蛋白飞行质谱仪对结合在弱阳离
子WCX2芯片上的蛋白进行读取分析，设定最高检测分子量
为 50 kD，优化范围为 2 kD~20 kD，激光强度 205，检测敏感度
为 8。考虑到基质峰的存在，将 2 kD以下的峰滤去，以免基质
峰对结果造成干扰。图谱标准化的参数设定：强度范围 5~75，
质荷比范围 1000~50000，并以 6825 Da蛋白峰进行校正对齐。
采用 Ciphergen Proteinchip 3.1 分析软件自动采集数据；
Biomarker Wizard软件分析实验前后蛋白质图谱差异；SPSS11.
5软件对数据进行统计学处理。
2 结果
从台湾、福建、文山、云南 1、云南 2五种金线莲组织培养
苗中各自提取蛋白，分别通过上述 SELDI-MS-TOF方法测得
各样品的蛋白质组峰形图，每份蛋白样品重复三次，测定结果
如图 1。
3 讨论
3.1 差异蛋白峰比较
本文采取简单、快捷、高灵敏的蛋白质组研究新方法 SEL-
DI-MS-TOF技术研究开唇兰属不同种植物的蛋白质组，每样
品重复三次。从图 1中可见，所有金线莲均存在许多共有峰，对
应的蛋白质应该是所有金线莲共表达的，可以说它们是金线莲
生长发育所必需。但有些峰的强度在不同种金线莲中有差别，
或有些峰为某种或某几种金线莲所特有，提示可能正是这些蛋
白质表达的不同造成了同属的种间差异。
有文献报道相近品种的蛋白质组存在差异蛋白点，这些差
异蛋白点体现着样品之间的遗传变异性，如 Bahrman N等[3]通
过分析不同野生品种和小麦栽培种共有蛋白质点的数量计算
出每对基因型间的相似指数，发现 T. speltoides是与栽培小麦
B基因组最相近的野生品种；Barreneche T等[17]对两个非常相
近的欧洲偃麦品种 Quercus petraea和 Quercus robur之间总蛋
白点的分析，证实上述两个品种之间的遗传差异性较低。Zivy
M等 [8] 用 2-D分析 18个小麦异源多倍体株系的蛋白质表达
谱，发现 14个蛋白质反映了小麦品种之间核的遗传变异。GO-
rg A等[18]采用第一向等电聚焦 IPG-DALT胶，分析 14个不同
麦芽品质的大麦品种的醇溶蛋白图谱，10个品种显示出独特
的醇溶蛋白谱。Skylas D J等[19]提取成熟小麦胚乳总蛋白，发现
蛋白组图谱中 3个特殊区域包括两套谷蛋白和一个非谷蛋白
区（小热激蛋白）的变化可以比较 4个小麦品种的差异，小热激
蛋白区的差异是一个非常感兴趣的可能靶蛋白区。这些研究说
明种间蛋白质组的差异可以用以建立品种分类的依据。
据此，本文采用 Ciphergen Proteinchip 3.1分析软件自动采
集并统计数据，以获得五种金线莲种间的差异蛋白质数据。以
FJ为标准，五组相比 P<0.05（n=3）的差异蛋白有 102 个，表 1
列出五个实验组的部分蛋白质分子量及对应的峰面积，每组包
含峰面积最大的六个蛋白质点。
表 1 五种金线莲种间差异蛋白分子量及峰面积
Table 1 Molecular weight and peak area of differential expression protein between species
M/Z P Mean-FJ Mean-TW Mean-WS Mean-YN1 Mean-YN2
5849.0110
6130.28
5133.94
10451.80
12081.32
6053.50
10283.81
6115.95
7278.39
7566.28
6077.38
12177.27
6089.22
12133.44
10525.79
0.0132
0.015
0.016
0.019
0.019
0.022
0.022
0.025
0.026
0.031
0.040
0.043
0.045
0.046
0.047
2.1460
64.857
24.066
23.658
18.151
5.974
26.680
19.771
38.853
2.921
6.503
49.342
7.822
26.632
39.891
1.2155
74.436
43.930
38.096
64.982
39.398
37.526
16.577
8.848
2.539
8.727
49.205
7.536
28.940
40.011
15.2133
34.792
15.277
18.277
50.045
10.990
16.598
62.452
3.429
2.882
58.035
80.972
68.321
80.765
10.458
3.9167
31.635
41.236
30.934
16.689
5.693
68.426
49.859
5.271
10.552
18.199
75.462
17.332
49.282
32.264
4.5491
15.385
23.116
19.361
11.188
4.963
30.815
8.709
9.062
30.942
4.946
24.793
4.940
19.069
23.021
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结合图、表，可选择面积较大的峰作为鉴别 Anoectochilus
属内种的特征峰，如 5133、6130、10451、10283、10526、12133、
12177。
3.2 蛋白质组指纹图谱的建立
根据属内各种间存在的蛋白质组的差异，以已命名的 FJ
（A. roxburghii）和 TW（A. formosanus）为标准，参考峰形图和各
种间的差异蛋白数据，选取种间差异明显的靶蛋白峰作为各品
种鉴定的特征峰。
如在 4820 Da 处，FJ 和 TW有双峰，YN1 和 YN2 仅有单
峰，峰高、峰面积无明显差别，WS此处无峰；在 5130处，FJ、
WS、YN1有双峰，峰高和峰面积无差别；而 TW和 YN2仅有单
峰，且峰高和峰面积 TW明显高于 YN2，分别为 1051.5 和
571.6（图 2）。再如在 6000～8000 Da这一段上，有 6052、6350、
6750和 7538四个峰可作为区分不同种金线莲的特征峰，6052
仅 TW和 YN1存在，6350峰在WS和 YN1中高表达，6750仅
在WS和 YN1中有峰，7538峰在 YN2中远远高于其它各种金
线莲（图 3）。在 8000和 11000间也存在 8131、9058和 10430、
10512可作为特征峰，如 8131在 WS和 YN1中高表达，9058
在 FJ和 WS中为双峰，在 TW、YN1、YN2中仅为单峰，在 WS
中 10430峰不存在，但 10512则高表达。尽管尚有其它峰有的
表达量高，有的差异大，但或峰形不好，或峰未分离，则不予考
虑。
图 2 分子量 4500-6000蛋白质峰形图
Fig.2 Molecular weight 4500-6000
图 3 分子量 5000-8000蛋白质峰形图
Fig.3 Molecular weight 4500-6000
综合以上分析，将此五种 Anoectochilus属内种的靶蛋白
峰面积指纹标准图谱试列于表 2。
3.3 蛋白质组差异体现 Anoectochilus属内种的亲疏关系
同属五种金线莲的蛋白质组间无论是差异蛋白总数，还是
相差倍数均不同，表 3。表中数据显示，FJ与 YN1可能为最接
近的两个种，不仅差异蛋白数量少，最大差异倍数也不高；其次
应该为 TW和 YN2及 FJ和WS；以此推断 YN1与WS品种也
较接近，表中数据也反应出这点；而WS与 YN2差异蛋白总数
最多，差异倍数最大，可以认为品种亲疏关系最远。综合考虑以
上四组数据，可以得出五种金线莲的亲疏关系图，见图 4。
在种内的遗传变异性研究中，Bahrman N等[20]用 2-D方法
研究了 7个自然地域的海岸松群体之间的关系，比较不同地域
样品间蛋白位点存在的遗传变异性，发现可区分为 3个主要的
松树群体即大西洋、地中海和北非群体。David J L等[9]研究多
点种植的 11个小麦群体进化的遗传差异，结果发现，在用于研
究群体遗传差异的 48个蛋白点中，15个蛋白显示明显的差异
性；而同一独立进化的群体即使栽培方法不同也显示出相似的
遗传差异性。上述结果表明自然选择对群体进化起主要作用，
且选择响应主要决定于大环境条件。
这五种植物均来源于东南部地区，来自云南的 YN1与广
西的WS、YN2与台湾的 TW相对疏远，可能是由于高原地带
和东南沿海的气候差异造成的；但同是来自云南的 YN1 与
YN2间的差别，则不能用气候来解释了，可能为某种自然选择
造成。因此，可以认为海拔和气候可能会造成品种的分化，但此
两种因素对品种的影响不是绝对的，尚有其它多种因素的共同
作用，造成了品种的分化和变异。
环中数字 1-10表明相互间亲疏关系由近至远
图 4 Anoectochilus属五种植物亲疏关系
Fig.4 Consanguinity of species in Anoectochilus
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表 2 Anoectochilus属各植物蛋白质组指纹谱图
Table 2 Protein expression profilings of Anoectochilus
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（下转第 2660页）
4 结论
依据 SELDI-TOF-MS给出的差异蛋白质数据和峰形图，
选 定 了 分 子 量 4820、5130、6052、6350、6750、8130、9058 和
10512的峰为特征峰，建立了五种 Anoectochilus属内金线莲种
的蛋白质指纹图谱。
依据 SELDI-TOF-MS给出的差异蛋白质数据分析了品种
遗传变异性，地域和气候会对品种的变异产生一定的影响，但
品种的分化是多种因素共同作用的结果。
本文采用 SELDI-TOF -MS 技术作为品种鉴定的初步尝
试。这种基于蛋白质组学的鉴定方法对于物种的种间鉴定具有
较强的特异性，可作为传统鉴定方法的有力补充。由鉴定结果
得出的品种间亲疏关系，也可推论印证了气候差异和自然选择
对品种的分化和变异的影响。
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表 3 Anoectochilus属植物间差异蛋白
Table 3 Differential expression protein between species of Anoectochilus
对比组
（Contrast）
差异蛋白总数
（Totality of differences）
>20倍差异蛋白数
（More than 20 times differences）
5-20倍差异蛋白数
（5- 20 times differences）
最大差异倍数
（The largest differences）
FJ/TW
FJ/WS
FJ/YN1
FJ/YN2
TW/WS
TW/YN1
TW/YN2
WS/YN1
WS/YN2
YN1/YN2
110
138
55
138
170
80
130
98
183
100
2
/
/
2
3
2
/
1
6
1
5
8
10
15
15
9
12
13
27
10
48
18
14
29
38
69
12
34
86
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