全 文 ：Phylogenetic Relationships among Hystrix , Psathyrostachys and
Leymus (Poaceae:Triticeae)Based on RAPD and ISSR Assays
ZHANG Hai-qin1 , ZHOU Y ong-hong1 , Y ANG Rui-wu2 , DING Chun-bang 2 , ZHANG L i2 , WE I Yu-ming1
(1.T riticeae Research Institute , Sichuan Ag ricultural University , Dujiangyan 611830 , Sichuan , China;
2.College of Biology and Science , Sichuan Agricultural University , Yaan 625014 , Sichuan , China)
Abstract:The phylogenetic relat ionships of 12 taxa from Hystrix and the related species in Psathy-
rostachys and Leymus were analyzed by using RAPD and ISSR assays.H .coreana , H .duthiei ssp.
duthiei and H.duthiei ssp.longearistata were clustered wi th the Psathyrostachys and Leymus
species , while H .patula , the type species of Hystrix , fo rmed a monophyletic branch.The results
w ere in ag reement w ith previously cy tological data , and indicated that:①H .patula was distantly re-
lated to the other species of Hystrix ;②H.coreana , H .duthiei ssp.duthiei and H.duthiei ssp.
longearistata had a close af finity w ith the Psathyrostachys and Leymus specie.The RAPD and ISSR
assays in this study produced similar UPGMA dendrog rams , but the ISSR technique w as superio r to
the RAPD assay in polymo rphism and the stability of PCR react ion.RAPD and ISSR were tw o useful
makers fo r assessing the genetic diversity and phy logenetic relationships in Tiritceae.
Key words:Hystrix ;Psathyrostachys;Leymus;RAPD;ISSR
猬草属与其近缘属物种的 RAPD和 ISSR分析
张海琴1 , 周永红1 , 杨瑞武2 , 丁春邦2 , 张　利2 , 魏育明1
(四川农业大学 1.小麦研究所 , 四川 都江堰　611830;　2.生命科学与理学院 , 四川 雅安　625014)
摘要:对猬草属及其近缘属(新麦草属 、赖草属)物种 11 种 1 变种共 13 份材料进行了 RAPD 和 ISSR分析。聚类分
析结果表明:①新麦草属物种和赖草属物种各自聚类在一起;②猬草属模式种 Hystrix patula 与其他猬草属物种间
存在明显的遗传差异;③Hystrix coreana 、H.duthiei ssp.duthiei 和H .duthiei ssp.longearistata 与含 Ns 基因组的新
麦草属物种及具 NsXm 基因组的赖草属物种聚在一起。以上结果与细胞学结果类似 , 表明 H.patula 与其他猬草
属物种存在较大的遗传变异 ,而 H .coreana 、H.duthiei ssp.duthiei 和H .duthiei ssp.longearistata 与新麦草属及赖
草属物种具有较近的亲缘关系。两种标记得到的 Jaccard 遗传相似系数和遗传聚类图基本一致 , 但 ISSR 引物扩增
的多态性高于 RAPD 标记 ,且 PCR扩增反应优于 RAPD 反应。 RAPD 和 ISSR标记可作为评价小麦族物种遗传多
样性和亲缘关系的分子标记技术。
关键词:猬草属;新麦草属;赖草属;RAPD;ISSR
中图分类号:Q944.46　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2008)01-0005-06
　　猬草属 Hystrix Moench 是禾本科(Poaceae)小
麦族(Triticeae)的一个多年生小属 ,全世界约 10 余
种 , 主要分布于北美和中亚 、西亚[ 1 ,2] 。Moench
(1794)把 Linneus(1753)描述的 E lymus hystrix L.
因为其颖强烈退化甚至缺失的特点而建立了猬草
属 ,其模式种为 H .patula Moench[ 3] 。迄今为止 ,
报道的猬草属物种约 11 个种 , 中国有 3 种[ 1 , 2] 。
Baden et al对猬草属进行了最新修订 ,认为猬草属
第 26 卷　第 1 期
2008 年 3 月 　　　　　　　　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultural University
　　　　　　　　 　Vol.26 No.1
Mar.2008
收稿日期:2007-09-03
基金项目:国家自然科学基金(30270099 , 30470135);　四川省教育厅和科技厅重点项目;　四川农业大学青年基金项目
(01130500)。
通讯作者(Corresponding author)。
DOI :10.16036/j.issn.1000-2650.2008.01.001
有 6 种 3 变种:H.patula , H .cal ifornica (Bol.)
Kuntze , H.duthiei (Stapf)Bor ssp.duthiei , H .
duthiei (Stapf) Bor ssp.longearistata (Hack.)
Baden , Fred.and Seberg , H .duthiei (Stapf)Bo r
ssp.japonica (Hack.)Baden , Fred.and Seberg , H .
komarov ii (Roshev .)Ohw i , H .coreana (Honda)
Ohw i和 H .sibirica (Trautv.)Kuntze[ 2] 。它们生
长在相对比较湿润的环境中 ,如山谷林下 ,溪边 ,海
滩边等地(Baden et al.,1997)。除 H .cali fornica 为
八倍体(2n=8x=56)外 ,其余猬草属物种都为四倍
体(2n=4x=28)[ 4] 。
猬草属植物的一个显著形态特征是颖强烈退化
成针状或缺失。正是以此形态特征为依据 ,一些学
者将猬草属独立成属[ 1 ,2 ,5] 。然而 ,细胞学分析表明
它们却具有不同的染色体组组成 。Church报道 H .
patula 与加拿大披碱草复合群物种具有较近的亲
缘关系[ 6] 。因此 ,Dewey 和 Löve 认为 H .patula 含
有S tH基因组 ,将猬草属物种合并到披碱草属 Ely-
mus中[ 4 , 7 , 8] 。但 Jessen 和 Wang 通过染色体组分
析以及基因组特异 RAPD 标记表明 Elymus core-
anus(H .coreana)和 E .cali fornicus(H .cal iforni-
ca)具有赖草属 Leymus Hochst.的NsXm 染色体组 ,
并将 E .coreanus 组合到 Leymus 中[ 9] 。Zhang 等 、
Zhang 和Zhou通过染色体配对分析和基因组原位
杂交(GISH)分析表明:模式种 H.patula 具有与其
他猬草属物种不同的基因组组成 ,即:H.patula 含
S tH基因组 , H .duthiei ssp.duthiei 和 H .duthiei
ssp.longearistata 具与赖草属 Leymus一致的 NsXm
基因组[ 10-12] 。Ellenskog -Staam et al的 GISH 和
Southern杂交结果也表明 H .patula 含 StH 基因
组 , 但 它们 认为 H.coreana 、 H .duthiei ssp.
duthiei 、H.duthiei ssp.longearistata 具有 Ns1Ns2
基因组[ 13] 。
综上 ,关于猬草属的界限以及它们与其近缘属
物种的亲缘关系 ,尤其是与赖草属的关系如何 ,尚存
在争议 。本研究利用两种在分子系统学研究中普遍
应 用 的 Random amplified polymo rphic DNA
(RAPD)和 Inter-simple sequence repeat(ISSR)分子
标记技术 ,研究猬草属物种与其近缘属(新麦草属
Psathyrostachys Nevski和赖草属)物种的系统学关
系 ,为猬草属系统地位研究提供分子水平的证据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
本实验选用猬草属 3 种 1亚种 、新麦草属 3种
4份材料 、赖草属 5 种共 11 种 1 亚种 13份材料。
由于 Psathyrostachys juncea 地理分布很广 ,因此本
实验选用了 2份来自不同地区的材料 。供试材料的
种名 、染色体数 、基因组 、来源及编号见表 1。PI 编
号的材料由美国国家植物种质资源库提供;长芒猬
草 H .duthiei ssp.longearistata 由日本京都大学 S.
Sakamoto 博士采集并提供;其他编号的材料来自四
川农业大学小麦研究所 。所有材料均栽种于四川农
业大学小麦研究所多年生种质圃 。凭证标本藏于四
川农业大学小麦研究所标本室(SAUTI)。
表 1　供试材料
Table 1　The research ma terials
序号
No. 种名Species 染色体数Chromosome
number(2n)
基因组
Genome
来源
Origin
编号
Accession
No.
1 Psathyrostachys f ragilis 14 Ns 　　伊朗 I ran P I 343191
2 P.juncea 14 Ns 　　俄罗斯 Russia P I 75737
3 P.juncea 14 Ns 　　阿富汗 Afghanistan P I 222050
4 P.huashanica 14 Nsh 　　陕西 Shaanxi ZY 3157
5 Hystri x duthiei ssp.duthiei 28 NsXm 　　四川 Sichuan ZY 2004
6 H .duthiei ssp.longearistata 28 NsXm 　　日本 Japan ZY 2005
7 H .coreana 28 NsXm 　　俄罗斯 Russia P I 531578
8 H .patula 28 StH 　　美国 USA PI 531615
9 Leymus cinereus 28 NsXm 　　美国 USA PI 478831
10 L.racemosus 28 NsXm 　　爱沙尼亚 Esthonia P I 531811
11 L.multicaulis 28 NsXm 　　新疆 Xinjiang Y 094
12 L.secalinus 28 NsXm 　　新疆 Xinjiang Y 040
13 L.tainshanicus 28 NsXm 　　新疆 Xinjiang Y 2036
6　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷
1.2　研究方法
1.2.1　基因组总 DNA 的提取和浓度测定
每份材料取幼嫩叶片 3 ～ 5 g 用于 DNA提取 ,
总 DNA 的提取参照 Sharp等[ 14]的氯-酚方法。重
蒸水中溶解后 ,用 Phamacia公司 LKB ultroscpec 紫
外分光光度计以 OD 260测定 DNA 浓度 ,用 OD 260/
OD280比值检测核酸纯度。4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2　RAPD和 ISSR扩增
将样品 DNA 稀释为 10 ng/mL 左右作为反应
浓度 ,在 MJ Research Inc.PTC-200型热循环仪进
行 PCR扩增。25μL 反应体系包括 10×PCR buf fer
(10 mmol/L Tris-Cl pH 8.3 , 1.5 mmol/L MgCl2 ,
50mmol/L KCl , 0.001% gelatin)2.5μL , Mg2+ 1.5
μL ,5.0 mmol/ L dN TP 0.5μL ,随机引物 1μL , Taq
DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL ,模板 DNA 2 μL(约
20 ng)和重蒸水 17.3μL。温度循环为 94 ℃预变性
3min;94 ℃变性 1min , 36 ℃退火 1min , 72 ℃延伸 2
min ,循环 46次;72 ℃延伸 7 min。RAPD扩增引物
选用上海生物工程公司十聚体核酸随机引物 , ISSR
扩增引物由 Invit rogen公司合成。
1.2.3　扩增产物检测
RAPD 扩增产物用含 0.5 μg/mL 溴化乙啶
(EB)的 1.5%琼脂糖的凝胶电泳进行分离 ,在紫外
检测仪上观察照相 、记录 。ISSR扩增产物采用聚丙
烯酰胺凝胶电泳分离 ,用银染的方法进行读带 。
将25μL 扩增产物在 PCR仪中 95 ℃变性 5min
后立即放入冰浴中 ,冷却 。加入 5 μL 上样缓冲液
(98%甲酰胺 , 10mmol/L EDTA pH 8.0 ,0.025%溴
酚蓝 ,0.025%二甲苯青)待用 。
取100 mL 6%(W/V)聚丙烯酰胺变性胶[ 150
mL/L 40%丙烯酰胺(T∶C=19∶1), 100 mL/L 10×
TBE ,420 g/ L 尿素] ,并向其中加 40 μL TEMED ,
500μL(10%W/V)过硫酸铵摇匀后灌胶。
胶凝固后进行预电泳 。设定电压为 2500 V ,电
流为 50 mA ,功率为 110 W ,至变性胶温度达 49 ℃
时停止预电泳。用吸管吹洗点样孔 ,加样 3 ～ 5 μL ,
电泳(2200V ,50 mA ,100W)2 ～ 4 h(视 SSR分子量
的大小及差异带的分辨程度调整时间)。
电泳结束后将胶放在 2.3 L 10%醋酸溶液中脱
色 ,轻摇 30 min至指示剂无色。然后用蒸馏水洗 2
次 ,每次 10 min ,其间轻摇。
将胶转移到 2.3 L 染色液中(染色液含:2.3 g
AgNO3 ,4 mL 甲醛),在黑暗中避光染色 30 min ,其
间轻轻摇动。
将染色后的胶放在显影液里轻摇至 DNA条带
显出。显影液配方为:2 L 蒸馏水中加入 75 g
Na2CO3 ,用前加入 5 mL 37%的甲醛和 500μL 硫代
硫酸钠(10 mg/mL),于显影之前先配好 ,置 4 ℃冰
箱预冷 ,备用 。条带显出后转移到 10%醋酸定影 5
min。然后用自来水冲洗胶上剩余的醋酸 ,晾干 ,照
相保存条带 。
1.2.4　数据统计与分析
每个样品的扩增带按“有”或“无”记录 。“有”赋
值为 1 ,“无”赋值为 0 。在 N TSYS 软件中 ,计算样
品间的 Jaccard遗传相似系数 ,按非加数算术平均数
聚类方法(UPGMA)计算类间遗传距离 ,建立样品
间聚类图[ 15] 。
2　结果与分析
2.1　RAPD和 ISSR的多态性
在 40个随机 RAPD引物中 ,有 20 个引物能扩
增清晰条带并呈现多态性(表 2),占 50.0%。共产
生 142条谱带 ,其中 135条带为多态性带 ,占总扩增
带的 95.07%;平均每个引物扩增 7.10 条带谱 ,变
幅为 2 ～ 12。对于 ISS R分析 ,我们共选用 35个 IS-
SR引物进行 PCR扩增 ,12 个引物能扩增清晰条带
并呈现多态性 ,占34.3%(表3)。共产生223条谱
表 2　RAPD 引物及扩增多态性
Table 2　RAPD primers and their amplified polymorphism
引物
P rimer
序列
Sequence
总扩增带
To tal band
多态性带
Polymorphic band
S1 GTTTCGCTCC 6 6
S2 TGATCCCTGG 6 6
S4 GGACTGGTGA 9 9
S5 TGCGCCCT TC 5 4
S7 GGTGACGCAG 11 11
S8 GTCCACACGG 10 10
S10 CTGCTGGGAC 8 8
S18 CCACAGCAGT 8 8
S20 GGACCCTTAC 11 11
S22 TGCCGAGCTG 6 5
S27 GAAACGGGTG 6 6
S29 GGGTAACGCC 6 5
S30 GTGATCGCAG 12 12
S33 CAGCACCCAC 5 3
S34 TCTGTGCTGG 2 2
S35 TTCCGAACCC 4 4
S36 AGCCAGCGAA 6 6
S37 GACCGCTTGT 8 7
S38 AGGTGACCGT 10 9
S39 CAAACGTCGG 3 3
Total 20 142 135
7第 1 期　　　　　　　　　　　张海琴(等):猬草属与其近缘属物种的 RAPD和 ISS R分析　　　　　　　　　　　　
表 3　ISS R引物及扩增多态性
Table 3　ISSR primers and their amplified polymorphism
引物
P rimer
序列
Sequence
总扩增带
Total band
多态性带
Polymorphic band
ISSR6 HVH(CA)7T 18 16
ISSR10 (CA)8RG 11 11
ISSR13 (AC)8YG 30 29
ISSR807 (AG)8T 30 29
ISSR810 (GA)8T 17 16
ISSR811 (GA)8C 17 15
ISSR815 (CT)8G 23 23
ISSR827 (AC)8G 14 14
ISSR834 (AG)8YT 22 22
ISSR841 (GA)8YC 10 9
ISSR845 (CT)8RG 19 19
ISSR855 (AC)8YT 12 12
To tal 　　12 223 215
　　R=A/ T , Y =G/ C , H=A/ T/ C , V=A/ G/ C。
带 , 其中 215 条带为多态性带 , 占总扩增带的
96.4%;平均每个引物扩增 17.92条多态性带 ,变幅
为 9 ～ 29。以上结果表明猬草属 、新麦草属及赖草
属 3个属的物种之间存在较大的遗传变异 。
2.2　猬草属 、新麦草属和赖草属的属间 RAPD和
ISSR遗传变异
RAPD和 ISSR的 Jaccard遗传相似系数变化都
较大 ,变化幅度分别在 0.462 ～ 0.860 和 0.374 ～
0.894之间(表 4 ,表 5)。从表 4和表 5 看 ,新麦草
属和赖草属的相似系数变幅为 0.573 ～ 0.713 和
0.569 ～ 0.659;猬草属与赖草属的相似系数变幅为
0.552 ～ 0.755和 0.447 ～ 0.675;而新麦草属与猬草
属的相似系数变幅在 0.462 ～ 0.748 和 0.374 ～
0.659之间 。根据遗传相似系数 ,在 UPGMA 下分
别建立 RAPD 和 ISSR 遗传聚类图(图 1 , 图 2)。
RAPD和 ISS R的遗传聚类图基本一致 ,其中:新麦
草属和赖草属归为一组;H.duthiei ssp.duthiei 与
H .duthiei ssp.longearistata聚为一组;而H .patu-
表 4　13 份猬草属及其近缘属物种基于 RAPD多态性的 Jaccard遗传相似系数
Table 4　Genetic similarity based on RAPD po lymorphism among 13 accessions of Hystrix and its relatives
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 1.000
2 0.713 1.000
3 0.685 0.860 1.000
4 0.706 0.671 0.699 1.000
5 0.615 0.608 0.608 0.629 1.000
6 0.692 0.629 0.615 0.622 0.755 1.000
7 0.713 0.748 0.692 0.657 0.650 0.657 1.000
8 0.566 0.573 0.462 0.538 0.503 0.524 0.643 1.000
9 0.692 0.699 0.657 0.692 0.699 0.678 0.755 0.608 1.000
10 0.685 0.664 0.678 0.629 0.692 0.671 0.678 0.573 0.769 1.000
11 0.664 0.713 0.685 0.650 0.573 0.636 0.643 0.608 0.720 0.811 1.000
12 0.594 0.587 0.573 0.608 0.573 0.566 0.615 0.552 0.678 0.699 0.706 1.000
13 0.615 0.664 0.636 0.587 0.608 0.587 0.636 0.531 0.713 0.734 0.797 0.657 1.000
注:1 ～ 13 代表物种序号(同表 1 , 下表同)。
　　Note:1 to 13 co rresponds to the material number in table 1.
表 5　13 份猬草属及其近缘属物种基于 ISS R多态性的 Jaccard 遗传相似系数
Table 5　Genetic similarity based on ISSR polymorphism among 13 accessions of Hystri x and its relatives
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 1.000
2 0.634 1.000
3 0.675 0.894 1.000
4 0.715 0.593 0.667 1.000
5 0.569 0.545 0.488 0.561 1.000
6 0.553 0.462 0.472 0.545 0.854 1.000
7 0.626 0.650 0.659 0.585 0.585 0.553 1.000
8 0.480 0.374 0.382 0.407 0.439 0.423 0.463 1.000
9 0.610 0.634 0.675 0.650 0.585 0.642 0.463 0.724 1.000
10 0.685 0.664 0.678 0.629 0.692 0.671 0.678 0.573 0.769 1.000
11 0.602 0.642 0.634 0.593 0.593 0.577 0.650 0.488 0.715 0.846 1.000
12 0.593 0.618 0.659 0.650 0.553 0.602 0.610 0.447 0.659 0.707 0.748 1.000
13 0.569 0.610 0.618 0.642 0.610 0.593 0.618 0.472 0.667 0.846 0.789 0.732 1.000
8　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷
图1　13份猬草属及其近缘属物种的 RAPD遗传距离聚类图
Figure 3　A dendrog ram based on RAPD genetic instance
among 13 accessions of Hystrix and its relatives
图 2　13 份猬草属及其近缘属物种的 ISSR遗传距离聚类图
Figure 4　A dendrog ram based on ISS R genetic instance
among 13 accessions of Hystrix and its relatives
la 单独聚为一支。RAPD和 ISSR聚类图的区别在
于 L .cinereus聚类位置不同 。在 RAPD聚类图中 ,
L .cinereus与 H.coreana 聚在一起 ,然后与新麦草
属物种聚为一支;而在 ISSR聚类图中 , L .cinereus
与 4种赖草属物种聚在一起 ,然后再与 H .coreana
及新麦草属物种聚为一支 。以上结果表明新麦草属
与赖草属的亲缘关系近于它与猬草属的关系 。
2.3　猬草属 、新麦草属和赖草属的种间 RAPD 和
ISSR遗传变异
在 RAPD分析中 , 4 个猬草属物种间的 J 氏相
似系数变化幅度在 0.503 ～ 0.755之间 ,聚类分析明
显分成了 3组:H.duthiei ssp.duthiei 与H.duthiei
ssp.longearistata 的相似系数最高(0.755),聚为一
组;H .coreana 与 L .cinereus 聚为另外一组;H .
patula 单独聚为一组。4 个新麦草属物种中 , 2 个
来自不同地方的 P .juncea 相似系数最高 , 为
0.860 ,聚为一支;P.huashanica 与P .f ragi lis相似
系数为 0.706 ,聚为另外一支。5个赖草属物种中 ,
L .secal inus 与 L .tianshanicus 的相似性系数为
0.657 ,而 L .racemosus 与 L .multicaul is的相似性
系数为最高(0.811)。 ISSR聚类结果与 RAPD结果
基本一致。
3　讨　论
3.1　分子标记所揭示的属间和种间关系
染色体组分析结果表明:新麦草属物种含 Ns
基因组;赖草属物种具有 NsXm 基因组 ,其中 Ns来
自新麦草属 ,而 Xm 为来源未知的一组基因组[ 16] ;
猬草属模式种 H.patula 含有与披碱草属物种一致
的 StH 基因组 , 而 H.coreana 、H .duthiei ssp.
duthiei和 H.duthiei ssp.longearistata 具有与赖草
属相同的 NsXm 基因组[ 6 ,9 ,10 , 13] 。本研究中 , RAPD
和 ISSR的聚类分析结果表明:①新麦草属物种和
赖草属物种各自聚类在一起;②猬草属模式种 H.
patula 与其他猬草属物种间存在明显的遗传差异;
③H .coreana 、H .duthiei ssp.duthiei 和 H .duthiei
ssp.longearistata与含 Ns 基因组的新麦草属物种
及具 NsXm 基因组的赖草属物种聚在一起。本研
究结果支持细胞学及叶绿体基因分析结果[ 17] 。
3.2　RAPD标记与 ISSR标记的比较
3.2.1　多态性比较
本实验中 , RAPD标记平均每个引物扩增 7.10
条带谱 ,而 ISSR标记平均每个引物扩增 17.92条
多态性带 。很明显 , ISSR引物扩增的多态性标记明
显高于 RAPD标记。分析原因可能有以下两点:①
两者在进行基因组扩增时引物结合的位置不同。
RAPD标记的引物为十聚体核酸随机引物 ,只要基
因组中存在一段与之互补的序列 ,并且长度适宜 ,通
过 PCR扩增反应即可检测到多样性 。从理论上说 ,
它可期望检测染色体组的几乎所有区域[ 18] ;ISSR
标记是利用包含微卫星重复序列并在 3′或 5′锚定
的单寡聚核苷酸引物对微卫星之间的 DNA序列进
行 PCR扩增的标记系统 。引物包含一段一定长度
的重复序列 ,与它结合的目标序列(多为微卫星)在
DNA复制过程中存在滑动(slippage)和不均等交换
等现象 ,使得它们在不同个体间的重复次数有着较
大的差异 ,这样便更易于导致引物结合位点和两结
合位点间的片段长度产生变异[ 19] 。 ②两种标记
PCR产物的检测方法不同 。RAPD的 PCR产物采
9第 1 期　　　　　　　　　　　张海琴(等):猬草属与其近缘属物种的 RAPD和 ISS R分析　　　　　　　　　　　　
用琼脂糖凝胶电泳技术;ISSR采用变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳(SDS -PAGE)和银染的方法。SDS -
PAGE的分辨率要高于琼脂糖凝胶电泳 ,加之采用
了银染的显带方法 ,因此 ISS R的扩增产物只要存
在一个碱基的差异即可分辨出来 ,检测的灵敏度要
高于 RAPD分析 。
3.2.2　PCR扩增反应的稳定性比较
ISSR 标记优于 RAPD 标记 。 RAPD 标记的
PCR扩增反应保证利用同一公司和同一批次的 Taq
酶 、同一浓度的 dN TP 、Mg2+浓度 、反应缓冲液以及
保证 PCR反应在同一台 PCR扩增仪上进行 ,否则
将影响扩增的稳定性 ,产生不稳定带谱 。在 ISSR
标记的 PCR扩增不必严格要求采用同一厂家生产
的 Taq酶 ,在不同 PCR扩增仪所得的 PCR产物也
存在较好的一致性。显然这与两种标记的引物不同
有关:ISSR引物一般为 5 ～ 24 bp ,而 RAPD标记的
引物为 10 bp 的随机引物 。一般来说 ,引物长度越
长 ,引物-模板复合物越稳定。为克服 RAPD标记
PCR反应的不稳定性给试验结果带来的误差 ,本研
究采用重复扩增反应 。用于最终结果分析的引物为
重复两次扩增产生一致的谱带的引物 ,产生不同带
纹的引物舍弃不用。
3.2.3　分析结果的比较
通过两种不同 DNA 分子标记得出的猬草属 、
新麦草属和赖草属 3个属间的 Jaccard 遗传相似系
数具有极显著的相关性 ,树状聚类图也非常相似 。
表明研究中所用的 RAPD和 ISS R标记数量可以检
测到 3个属间及种间的遗传差异 。因此 , RAPD 和
ISSR分子标记可以作为评价小麦族物种遗传多样
性和亲缘关系的一种可靠而有效的补充方法 ,以更
好地评价小麦族属间和种间系统亲缘关系。
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(本文审稿:刘登才)
10　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷